Bakteriális identifikáció 16S rrns gén szekvencia alapján

Átírás

1 Bakteriális identifikáció 16S rrns gén szekvencia alapján MOHR ANITA SIPOS RITA, SZÁNTÓ-EGÉSZ RÉKA, MICSINAI ADRIENN 2100 Gödöllő, Szent-Györgyi Albert út 4.

2 TÖRZS AZONOSÍTÁS Morfológia+Biokémia Biokémiai tesztek Gram festés Még mindig a fajleírás alapvető kritériuma Időigényes Labor intenzív Gyors identifikálás, automatizálás API VITEK Atípusos törzsek esetében nehézségek A biokémiai tulajdonságok nem mindig tükrözik a genetikai leszármazást (pl.: laterális géntranszfer)

3 TÖRZS AZONOSÍTÁS MALDI Biotyper Matrix-assisted Laser Desorption Ionisation-Time Of Flight Tömegspektrometria 1991: első MALDI TOF tömeg spektrométer 2008: első MALDI Biotyper Rendszer Gyors Azonosítás faj ill. genus szinten Fehérje-spektrum (16S riboszómák) Laborok közötti kompatibilitás hiánya Adatbázis ( db) Nem validált rendszer

4 TÖRZS AZONOSÍTÁS DNS-DNS hibridizáció Molekuláris Biológia Teljes genom összehasonlítása GOLD STANDARD Fajleíráshoz szükséges Definitív ( 70%; 5 C Tm) Költséges Megbízható Reprodukálható Labor-intenzív Nehezen elérhető (egyre kevesebb laborban végzik)

5 TÖRZS AZONOSÍTÁS Molekuláris Biológia 16s riboszómális RNS gén meghatározás Minden baktériumban van (sőt!) Optimális méret (1500bp): Még vizsgálható Elegendő információt hordoz Gyors (1-2 nap) Laborok közötti kompatibilitás Kiterjedt adatbázis Reprodukálható Nehezen definiálható Validált rendszere: MicroSeq Identification Systems (Lifetech)

6 A MOLEKULÁRIS ÓRÁK A molekuláris óra elmélete Molecules as documents of evolutionary History J. Theoret. Biol. (1965) E. Zuckerkandl, L. Pauling A fehérjék változása az evolúció során időben egyenletes Ha ismerjük két faj ugyanazon fehérjemolekulái közötti különbséget meghatározható az elválás időpontja Riboszómális struktúrák az élővilágban

7 A MOLEKULÁRIS ÓRÁK Az élet fája A Molecular View of Microbial Diversity and the Biosphere Norman R. Pace Science (1997) Vol. 276 pp

8 A 16S rrns gén 0 bp 510 bp 1010 bp 1500 bp V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 A variabilitás >50% Konzervatív és variábilis régiók (9 db) Polimorfizmusok Kópiaszám Hossz-heterogenitás

9 A MÓDSZER ELVE Baktérium szuszpenzió Sejtek összegyűjtése Nukleinsav (DNS) kivonás Azonosítás Adatbázisokban Szekvenálás Sanger, S rdns Amplifikálás Mullis, 1983

10 A 16S rrns gén Azonosítás: >90%-ban genus szinten 65-83%-ban faj szinten 1-14%-ban nem azonosítható Ajánlott Definíció: Minimum >99% hasonlóság (ideális: >99,5%) Ellenőrzött típustörzs vagy referencia törzs szekvenciához Teljes hossz vizsgálata Genus Valid fajok száma Microseq adatbázisban található fajok % % Fajok közötti távolság <3% % Fajok közötti távolság <1% Átlagos fajok közötti távolság % Bacillus Pseudomonas Listeria Acinetobacter Edwardsiella ,5 Shigella ,9 Impact of 16S rrna gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Jill E. Clarridge, Clin Microbiol Rev October; 17(4):

11 ADATBÁZISOK Ingyenes, mindenki számára elérhető Egyre növekvő számú adat Ellenőrzött?? Hibás szekvenciák (szekvenálási hibák, kimérák) > Leírt fajok és 16S rdns szekvenciák számának változása SILVA adatbázisban > > The All-Species Living Tree project: a 16S rrna-based phylogenetic tree of all sequenced type strains. Yarza P, Richter M, Peplies J, Euzeby J, Amann R, Schleifer KH, Ludwig W, Glöckner FO, Rosselló-Móra R. Syst Appl Microbiol Sep;31(4): >

12 ELŐNYÖK - HÁTRÁNYOK Előnyök: Gyors Megbízható Reprodukálható Könnyen vizsgálható Kiterjedt adatbázis (legnagyobb) Laborok közötti kompatibilitás (nyersadat) Módszer- és adatbázis validált változata: Microseq (B:1400 +F:900) Hátrányok: Felbontás ( Kritikus csoportok ) Faj: 65-83% Genus: 90% Adatbázis hibák ( hibás típustörzsek) Definíció hiánya (adatelemzés különbözhet laborok között) Heterogenitás (kópiaszám, polimorfizmus)

13 KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!