Endofita baktériumok és enterális patogén baktériumok kolonizációja növényi szövetekben

Átírás

1 Endofita baktériumok és enterális patogén baktériumok kolonizációja növényi szövetekben Maráz Anna, Füstös Zoltán, Belák Ágnes Budapesti Corvinus Egyetem Élelmiszertudományi Kar Mikrobiológia és Biotechnológia Tanszék HUNGALIMENTARIA

2 Endofita baktériumok Növényi endoszimbionták Befolyásolják a növény növekedését, vitalitását Biotikus, abiotikus stresszel és patogénekkel szenbeni védelem Egyes baktérium sejtalkotók és tulajdonságok szerepe az endofita-növény interakcióban Recinhold-Hurek &Hurek (2011) Curr. Opin. Plant Biol. 14,

3 Különböző baktérium nemzetségekhez tartozó endofiták hatása Ryan et al. (2008) FEMS Microbiol Lett;278:1-9

4 Endofiták kimutatása, izolálása VALÓDI TENYÉSZTHETŐ ENDOFITÁK Felületi fertőtlenítést követően növényi szövetekből történt izolálás baktériumok növényi szövetekben való jelenlétének/kolonizációjának mikroszkópos igazolása Mikroszkópos igazolást megelőzően az izolátumok csak FELTÉTELEZETT ENDOFITÁKNAK tekintendők Endofiták mikroszkópos kimutatása növényi szövetekben GFP (Green fluorescent protein) vagy RFP (Red fluorescent protein) génjének klónozása a baktérium sejtben FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation) módszerrel: rrns-hez hibridizáló fluoreszcens oligonukleotid próbák alkalmazása

5 Baktériumok jelölése a GFP vagy RFP riporter gének klónozásával MBP-GFP hybrid fehérjét expresszáló E. coli Feilmeier et al., 2000 RFP-t expresszáló P. aeruginosa Singer et al., 2010

6 Endofita-növény interakció: kolonizáció kimutatása fluoreszcens protein jelöléssel Pseudomonas putida kolonizációja nyárfa tracheában Pseudomonas putida kolonizációja borsó gyökér kortexben Ryan et al. FEMS Microbiol Lett 2008;278:1-9

7 Endofita baktériumok: Növényi endoszimbionták Befolyásolják a növény növekedését, vitalitását (tápanyagok, fitohormonok, antibiotikumok, stb.) Baktérium kolóniák a saláta endorhizoszférájában. Biotikus, abiotikus stresszel és patogénekkel szenbeni védelem Frontiers in Microbiology, (148): 2. Fitoremediáció xenobiotikumok lebontása Életmódjuk (Gaiero et al., Amer. Jour. of Bot. 2013, 100(9): 1740.) : Obligát Fakultatív Passzív VALÓDI TENYÉSZTHETŐ ENDOFITÁK = felületileg fertőtlenített szövetekből izolált + baktériumok növényi szövetekben való jelenlétének mikroszkópos igazolása Mikroszkópos igazolást megelőzően csak FELTÉTELEZETT ENDOFITÁKNAK tekintendők (Rhosenblueth & Martinez-Romero, The Amer. Phytopath. Soc. 2006, 9(8): 827.) Valódi endofita jelleg igazolása: növényi szövetekvől való kimutatásuk mikroszkóposan GFP vagy RFP jelöléssel rrns-hez hibridizáló fluoreszcens oligonukleotid próbák Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)

8 A/ B/ Saláta rhizoszférájában (A) és endoszférájában (B) FISH módszerrel kimutatott és konfokális lézer szkennelő mikroszkóppal CLSM) vizsgált baktérium mikrokolóniák Berg et al., (2014) Frontiers in Microbiology, 5: 2

9 Újabb tudományos publikációk alapján: Humán patogének bejutása a növényi szövetekbe járvány kitörések Endofiták patogének kölcsönhatása humán patogének gátlása biokontroll törzsekként való alkalmazhatóságuk humán patogének bejutásának segítése élelmiszer-biztonsági kockázat Enterális patogének leveles zöldségekben: a kontamináció útjai Martinez-Vaz et al., 2014

10 Leveles zöldségek és csírák fogyasztásához kapcsolódó, enterális baktériumok által okozott járványok között Baktérium törzs Termék típusa Év Esetszám Ország Escherichia coli O157:H7 Spenót USA E. coli O26 Lóhere csíra USA E. coli O157:H7 Római saláta USA E. coli O104 Görögszéna mag ,075 Németo., Franciao., USA Salmonella enterica sv. Enteritidis Lucerna csíra USA E. coli O145 Saláta USA S. enterica sv. Newport Lucerna csíra USA S. enterica sv. SaintPaul Lucerna csíra USA S. enterica sv. Bovismorbificas Lucerna mag Finnország E. coli O157:H7 Saláta Grönland, Hollandia S. enterica sv. Stanley Lucerna csíra Sédország S. enterica sv. Weltevreden Lucerna csíra Norvégia, Dánia, Finnország E. coli O157:H7 Spenót USA E. coli O157:H7 Saláta Svédország Martinez-Vaz et al., 2014

11 Martinez-Vaz et al., 2014 Humán patogének megtelepedését és kolonizációját elősegítő molekuláris mechanizmusok Rhizoszférához és filloszférához történő tapadás elősegítése felületi adhéziós faktorokkal és biofilm képzéssel (1. és 2. lépés) Növényekben való túlélés/szaporodás stresszválasz indukcióval és a fehérje szintézisben, energiaképzésben és metabolizmusban fontos gének alulszabályozása (3. lépés)

12 E. coli sejtek megtapadása friss salátaleveleken Levél felületén megtapadó enteropatogén E. coli (EPEC) sejtek. Immunofluoreszcensen festett mikroszkópos kép. Piros E. coli sejtek, filamentumok (zöld). Sztóma zárósejteken és a sztóma alatti üregekben megtapadó enteroaggregativ E. coli (EAEC) sejtek Berger et al., (2010) Environ. Microbiol.,12:

13 Patogének és endofiták kölcsönhatása salátalevélen Zöld (GFP-vel jelölt) S. enterica sv. Montevideo sejtek aggregációja salátalevél felületén A/ Zöld (GFP-vel jelölt) Erwinia herbicola és kék (CFP-vel jelölt) S. enterica sv. Montevideo sejtek ko-aggregációja salátalevél felületén B/ Elpusztiult (piros) S. enterica sejtek Egyes endofiták (pl. E. herbicola, Ps. syringae) védelmet nyújtottak a patogén számára, mások (pl. Ps. fluorescens) pedig negatív hatással volt! Pozza-Carionet al. (2013) Phytopathol. 103:341

14 Patogének (S. enterica, E. coli O157:H7) megtelepedése és bejutása lucerna csírába E. coli O157:H7 mikrokolóniák (zöld) lucerna csírán ( sejt/g). 2-5 nap múlva sejt/g endofitaként szaporodott! Teplitski et al., 2009, Curr. Opinion Biotechn. 20:166

15 VBNC E. coli sejtek indukciója salátaleveleken Stresszhatás vizsgálata E. coli O157:H7 törzsekkel (Dinu et al.,2011, Appl. Environ. Microbiol. 77:8295) : Szuboptimális hőmérsékleten (16 oc-on) jó szaporodás Stresszelt körülmények között (8 oc-on) a populációk egyrésze VBNC állapotba került Nagyobb sejtsűrűség esetén a VBNC sejtek aránya kisebb volt, mint kisebb sejtsűrűségnél Csak VBNC sejteket tartalmazó populáció esetén a verotoxin termelés még 3 napig kimutatható volt. GFP-vel jelölt E. coli O157:H7 A/ VBNC sejtek saláta levélen B/ Keresztmetszet, ami mutatja a sejtek felüle lokalizáltságát

16 Potenciális endofita baktériumok izolálása talaj- és vízkulturás Capsicum annum var. grossum HO és KPA fajtákból Vizsgált izolátumok száma Összesen Gram +/- 101 Gram (-) 69 Gram (+) 2. Fenotípus 82 csoport 56 csoport 3. Molekuláris tipizálás 4. Identifikálás - biodiverzitás Azonosítás: Pseudomonasok esetében rpob gén alapján Minden más esetben 16S rdns alapján, az EzTaxon adatbázis segítségével 49 csoport 51 csoport Nemzetség/ek (izolátumok száma): Pseudomonas (17) Rhizobium (12) Stenotrophomonas (5) Leclercia (3) Enterobacter (2) Brevundimonas (1) Cedecea/Enterobacter/Leclercia (1) Chryseobacterium (1) Delftia (1) Deinococcus (1) Limnohabitans (1) Pantoea/Curtobacterium (1) Pantoea (1) Ochrobactrum (1) Cupriavidus (1) Nemzetség/ek (izolátumok száma): Bacillus (12) Microbacterium (9) Paenibacillus (5) Staphylococcus (5) Brevibacillus (4) Micrococcus (4) Curtobacterium (3) Kocuria (2) Rothia (2) Clavibacter (1) Cohnella (1) Leucobacter (1) Leifsonia (1) Lysinibacillus (1)

17 Paprika mag csírázási teszt Eredmények 23 Gram (-) izolátum esetén Ezen határ alatt nagyvalószínűséggel már nem Endofita Pseudomonas sp. Pseudomonas sp. Pseudomonas koreensis Pseudomonas hunanensis Rhizobium sp. Pseudomonas brassicacearum Chryseobacterium hispalense Curtobacterium/Pantoea sp. Rhizobium sp. Leclercia adecarboxylata Pseudomonas sp. Enterobacter sp. Pseudomonas composti Pseudomonas sp. Brevundimonas sp. Enterobacter/Cedecea sp. Limnohabitans sp. Rhizobium sp. Pantoea brenneri Pseudomonas sp. Stenotrophomonas sp. Delftia sp. Cupriavidus campinensis SE-PR-K-6 SE-PR-K-15 SE-PR-K-23 SE-PR-K-19 SEF-SR-K-3 SEF-PR-K-15 FP-BSK-K-1 FP-BBI-H-2 FP-BSK-K-3 SEF-PR-K-12 SEF-PR-K-8 SEF-PR-K-16 HP-BBI-K-3 SEF-L-H-4 FP-BTI-H-1 SEF-PR-K-4 SE-PR-H-9 SEF-PR-H-13 FP-BBI-H-3 SEF-PR-K-2 SE-PR-K-9 SE-PR-K-12 SE-PR-H-20 Kontroll Erős stimulálás Erős gátlás 43 Enyhe gátlás Izolátumok Kontrollhoz viszonyított csírázás (%) Gyengébb stimulálás Neutrális

18 Enterobacter spp. (2 darab) Leclercia adecarboxylata SEF-PR-K-12 SEF-PR-K-7 SEF-PR-H-10 Cedecea/Enterobacter/Leclercia sp. SEF-PR-K-4 Pantoea brenneri FP-BBI-H-3 Pantoea/Curtobacterium sp. FP-BBI-H-2 Stenotrophomonas spp. (5 darab) Cupriavidus campinensis SE-PR-H-20 Limnohabitans sp. SE-PR-H Delftia sp. SE-PR-K-12 Pseudomonas composti HP-BBI-K-3 81 Filogenetikai törzsfa Stenotrophomonas sp. SE-PR-K-9 Stenotrophomonas rhizophila SE-SR-K-16 SE-PR-H-6 SE-PR-H-11 Stenotrophomonas sp. SE-PR-K Pseudomonas spp. (17 darab) Brevundimonas sp. FP-BTI-H-1 Rhizobium sp. SEF-L-H-4 Rhizobium tibeticum SEF-SR-K Rhizobium sp. SEF-SR-K-3 Ochrobactrum sp. FP-BBI-K Rhizobium spp. (9 darab) 100 Cohnella ginsengisoli SE-SR-K-17 Paenibacillus sp. SEF-S-H-4 Paenibacillus sp. SEF-SR-K-1 Paenibacillus spp. (2 darab) Deinococcus sp. SEF-SR-H-1 Paenibacillus chondroitinus SE-SR-K-1 Brevibacillus sp. SE-SR-K-14 SE-SR-K-2 SE-SR-K-13 SE-PR-K-13 Lysinibacillus halotolerans SE-SR-K Staphylococcus spp. (5 darab) Bacillus spp. (12 darab) Rothia amarae SEF-S-K-10 Rothia tarrae SEF-S-K-2 Kocuria palustris SE-SR-K-6-K SE-SR-K-7-K Pseudomonas protegens SE-S-K-2 Pseudomonas sp. SE-PR-K-15 SE-PR-K-16 SE-L-H-1 Pseudomonas koreensis SE-PR-K-23 SE-PR-H-18 Pseudomonas sp. SE-PR-H-2 Pseudomonas koreensis SE-PR-K-29 SE-PR-H-2 Pseudomonas sp. SEF-PR-K-8 Pseudomonas brassicacearum subsp. neoaurantiaca SEF-PR-K-15 Pseudomonas sp. SE-PR-H-1-K Pseudomonas sp. SEF-PR-K-2 Bacillus aryabhattai SE-PR-H-5-1 SE-PR-K-27 SE-PR-K-7 SE-PR-K Pseudomonas Bacillus marisflavi sp. SE-PR-K-6 SEF-L-K-1 SE-PR-H-1 Bacillus sp. SE-SR-K-8 SE-SR-K-5 SE-SR-K-3 SE-PR-H-8 Pseudomonas SE-PR-H-4 Bacillus sp. S-K-S-2 Pseudomonas Bacillus hunanensis safensis SE-PR-K-19 SEF-L-H Bacillus sp. SE-L-K Micrococcus yunnanensis SE-SR-K-2-K SE-SR-K-4-K SE-SR-K-1-K SEF-S-K Curtobacterium spp. (3 darab) 100 Microbacterium sp. SEF-S-H-7 SEF-S-H-5 Clavibacter sp. FP-BTI-K-2 Leucobacter tardus HP-BSK-H-1 Microbacterium testaceum FP-BTI-K-1A FP-BTI-K-1 84 Leifsonia sp. SEF-SR-K-2 Microbacterium esteraromaticum SE-L-K Microbacterium spp. (9 darab) Chryseobacterium hispalense FP-BSK-K-1 Microbacterium sp. HP-BSK-H-2 SEF-PR-H-9 SE-L-H-2 Színkódok: Kiválasztott törzsek Microbacterium sp. HP-BBI-K-4 Faji szinten azonosított törzsek Potenciálisan új fajok 0.001

19 FISH TECHNIKA ALKALMAZÁSA Oligonucleotid PRÓBÁK Arb szoftver Cél izolátum Chryseobacterium hispalense Pseudomonas composti Specifikus próbák Gram negatív izolátumokra Izolátum kód Próba név_pozició (E. coli-ban) Szekvencia 5'-3 (Hosszúság nukleotidban) Fluorofor jelölés 5' végen FP-BSK-K-1 Chryseo_643 TCAACCTCACTCAAGACACGCA (22) Cyber 3 HP-BBI-K-3 Pseudo_828 GTACTCAAGGTACCCAACGGC (21) Cyber 3 és Fluorescein Általános próbák Legtöbb baktériumra (90%) EUB338 I GCTGCCTCCCGTAGGAGT (18) Fluorescein Planctomycetales (69%) EUB338 II GCAGCCACCCGTAGGTGT (18) Fluorescein Verrucomicrobiales (93%) EUB338 III GCTGCCACCCGTAGGTGT (18) Fluorescein Listeria és E. coli specifikus próbák Listeria spp., kivéve L. grayi Lis-637 CACTCCAGTCTTCCAGTTTCC (21) Fluorescein Listeria versengő Lis-comp CACTCCAGTCTCCCAGTTTCC (21) - E. coli/ Shigella Ec/Sh_453 GCAAAGGTATTAACTTTACTCCC (23) Fluorescein

20 Próbák specifikusságának vizsgálata színtenyészeteken Specifikusság vizsgálata Chryseo_643-próbára, FA: 25% Chryseobacterium FP-BSK-K-1 sejtek EUBmix- Fl Chryseo_643- Cy3 E. coli sejtek EUBmix- Pseudomonas Fl HP-BBI-K-3 sejtek Chryseo_643- Cy3 EUBmix- Fl Chryseo_643- Cy3 Listeria monocytogenes sejtek Pseudomonas EUBmix- fluorescens Fl sejtek Pseudomonas mendocina Chryseo_643- sejtek EUBmix- Cy3 Fl EUBmix- Fl Chryseo_643- Cy3 Chryseo_643- Cy3

21 Próbák optimalizálása és alkalmazhatósága színtenyészeteken Specifikusság vizsgálata Pseudo_828-próbára, FA: 25% Chryseobacterrium FP-BSK-K-1 sejtek EUBmix- Fl Pseudo_828 - Cy3 Pseudomonas HP-BBI-K-3 sejtek EUBmix- Fl Pseudo_828- Cy3 E. coli sejtek EUBmix- Fl Pseudo_828- Cy3 Pseudomonas fluorescens sejtek Listeria monocytogenes sejtek EUBmix- Fl EUBmix- Fl Pseudo_828 - Cy3 Pseudo_828 - Cy3 Pseudomonas mendocina sejtek EUBmix- Fl Pseudo_828 - Cy3

22 Chryseobacterium hispalense FP-BSK-K-1 vizsgálata növényi szövetben 10 8 sejt/ml 10 4 sejt/ml FISH Chryseo_643 próba, CLFM alkalmazása

23 PCR-es MÓDSZEREK Specifikus primerek tervezése endofita izolátumokra és patogénekre Mega6 szoftver segítségével Cél izolátum/ baktérium Forw. Primer Szekvencia 5'-3' név_poz. Méret (bp) Rev. Primer Szekvencia 5'-3' név_poz. Méret (bp) PCR termék méret (bp) Chryseobacterium sp. FP-BSK-K-1 Pseudomonas sp. HP-BBI-K-3 Chr22F TGCGTGTCTTGAGTGAGGTTGA 22 (Chr643_revcomp) Pse393F GCCGTTGGGTACCTTGAGTA 20 (Mod_Pse828_revcomp) Chr818R TACGGTCACCGACTTCAGGTAC Pse618R GCAGCACCTGTGTCTGAGTT 226 Listeria spp., kivéve L. grayi 27F (meglévő) AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 20 Lis659R CACTCCAGTCTTCCAGTTTC 20 (Mod_Lis-637) 659 E. coli/ Shigella 27F (meglévő) AGAGTTTGATCATGGCTCAG 20 Ec/Sh473 AAAGGTATTAACTTTACTCCCT 22 R (Mod_Ec/Sh_453) 466

24 Endofiták és patogének növénybe jutásának vizsgálata Paprikamag fertőzése baktérium szuszpenzióval Csíráztatás Növénynevelés hidrokultúrában Kb. 30 cm-es növényből és tápfolyadékból mintvétel Baktériumok kitenyésztése és kimutatása PCR-es és FISH módszerrel

25 A két Endofita és két patogén kimutatása a paprikából kitenyésztett baktériumokból I. Baktérium telepek izolálása a fertőtlenített palántákból és a tápfolyadékukból (89 telep) II. Fenotípusos csoportosítás (10 fenocsoport) III. RAPD-PCR két primerrel EC/II/1/2 és NS/SZ/5/2

26 KÖSZÖNÖM A FIGYELMET! A munka az OTKA projekt támogatásával valósult meg.