HUNGALIMENTARIA KONFERENCIA BUDAPEST,

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "HUNGALIMENTARIA KONFERENCIA BUDAPEST,"

Laura Faragóné
6 évvel ezelőtt
Látták:

1 ÉLELMISZERFELDOLGOZÓ KÖRNYEZETÉBŐL IZOLÁLT BAKTÉRIUMOK ANTAGONISTA HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA YERSINIA ENTEROCOLITICA ELLEN DEÁK BERNADETT, BELÁK ÁGNES, SOMOGYI GABRIELLA HUNGALIMENTARIA KONFERENCIA BUDAPEST,

Biokontroll és élelmiszerbiztonság Biztonságos, kémiai tartósító szerektől mentes élelmiszer előállítása Érzékszervi tulajdonságok ne változzanak Friss jellegű termékek, kényelmi termékek (RTE)

2 Biokontroll és élelmiszerbiztonság Biztonságos, kémiai tartósító szerektől mentes élelmiszer előállítása Érzékszervi tulajdonságok ne változzanak Friss jellegű termékek, kényelmi termékek (RTE) Biokontroll: Élő szervezetek alkalmazása más szervezetek gátlására Alkalmazása kártevő állatok, gyomnövények, patogén mikroorganizmusok ellen Az élelmiszerben és annak feldolgozó környezetében található mikrobák között előfordulhatnak olyanok is, amelyek valamilyen módon képesek visszaszorítani az esetlegesen jelen levő patogének szaporodását 2

Yersinia enterocolitica Bél (Enterobacteriaceae) családja, Yersinia (korábban Pasturella) nemzetsége Humánpatogén faj Jellemzői: Gram-negatív, aerob vagy fakultatív anaerob Peritrich csillói vannak

3 Yersinia enterocolitica Bél (Enterobacteriaceae) családja, Yersinia (korábban Pasturella) nemzetsége Humánpatogén faj Jellemzői: Gram-negatív, aerob vagy fakultatív anaerob Peritrich csillói vannak C-on (szobahőmérsékleten) mozgásképes, de 37 C-on csillótlan Pszichrotróf, hőm. opt.: C ( C), a fagyasztva tárolást is hosszú ideig túléli, ismételt fagyasztást és felengedtetést is ph opt.: 7-8 (min. ph: 4,2) 7% NaCl gátolja Hőtűrése nem kiemelkedő (D60=0,4-0,5perc tejben; z=4,5 C) Előfordulása: Számos emlős (kutya, macska, patkány) béltraktusában Gyakori szabad vizekben Kecsketejben (általában pasztőrözés nélkül használják fel) Borjú, sertés, bárány, baromfi, tejtermékek, fagylalt Az összes előfordulás 65-90%-a élelmiszer eredetu. A betegség be- és kijelentésre kötelezett 3

4 Célkitűzések Élelmiszerből izolálása ának keresése Yersinia enterocolitica ellen Morfológia szerinti csoportosítás Kontakt inhibíció Gátló hatású jellemzése KOH, OF, spórafestés (GP) Proteáz aktivitás azonosítása 16S rdns Sejtmentes 10x Koncentrált Együttenyésztési vizsgálat TSB és tej 4

5 Módszerek Izolálás élelmiszerrel érintkező felületekről és élelmiszerből Vágóhíd Zöldség feldolgozó üzem Tojásüzem Tejüzem Mintavételhez használt táptalaj: TSA vagy TSB TSA és WL agaron megfigyelt morfológia szerinti csoportosítás 5

Módszerek Élelmiszerből izolálása ának keresése Yersinia enterocolitica ellen Yersinia enterocolitica (98001)-val masszívan leoltott TSA

37 C, 42 C Leolvasás: egy kettő három és hat nap után azonosítása Morfológia szerinti csoportosítás Kontakt inhibíció KOH, OF, spórafestés

6 Módszerek Élelmiszerből izolálása ának keresése Yersinia enterocolitica ellen Yersinia enterocolitica (98001)-val masszívan leoltott TSA lemezekre tesztmikroba felcseppentése Gátló (~10 hatású 6 ) Inkubálás nyolc hőmérsékleten jellemzése : 5 C, 10 C, 15 C, 20 C, 25 C, 30 C, 37 C, 42 C Leolvasás: egy kettő három és hat nap után azonosítása Morfológia szerinti csoportosítás Kontakt inhibíció KOH, OF, spórafestés (GP) 16S rdns Feltisztulási zóna keresése (részleges vagy teljes gátlás) Sejtmentes 10x Koncentrált Együttenyésztési vizsgálat TSB és tej 6

Módszerek KOH teszt Gram pozitív és Gram negatív inhibíció

Proteáz aktivitás Tejporos TGE agaron Élelmiszerből izolálása ának

Sejtszuszpenzió felcseppentése Inkubálás: 20 C, 25 C, 30 C Leolvasás

Sejtmentes Morfológia szerinti csoportosítás Kontakt KOH, OF,

7 Módszerek KOH teszt Gram pozitív és Gram negatív inhibíció elkülönítésére Oxidatív-fermentatív teszt (glükóz) Spórafestés Proteáz aktivitás Tejporos TGE agaron Élelmiszerből izolálása ának keresése Yersinia enterocolitica ellen Gátló hatású jellemzése Sejtszuszpenzió felcseppentése Inkubálás: 20 C, 25 C, 30 C Leolvasás 24, 48 és 120 órát követően Feltisztulás megfigyelése azonosítása Sejtmentes Morfológia szerinti csoportosítás Kontakt KOH, OF, spórafestés (GP) 16S rdns 10x Koncentrált Proteáz aktivitás Együttenyésztési vizsgálat TSB és tej 7

Módszerek Első lépésben miniatürizált keresése identifikációs Yersinia tesztekkel API, BBL Crystal Azonosítás szekvenálással 16S rdns alapján R1492 primer NetBlast, EzTaxon Élelmiszerből izolálása

8 Módszerek Első lépésben miniatürizált keresése identifikációs Yersinia tesztekkel API, BBL Crystal Azonosítás szekvenálással 16S rdns alapján R1492 primer NetBlast, EzTaxon Élelmiszerből izolálása ának enterocolitica ellen Gátló hatású jellemzése azonosítása Morfológia szerinti csoportosítás Kontakt inhibíció KOH, OF, spórafestés (GP) 16S rdns Sejtmentes 10x Koncentrált Együttenyésztési vizsgálat TSB és tej 8

Módszerek Tesztmikróba TSB-ben Inkubálás egy három és hat napig 25 C-on Sejtmentes készítése Élelmiszerből izolálása ának keresése Yersinia enterocolitica ellen Gátló hatású jellemzése Centrifugálás

9 Módszerek Tesztmikróba TSB-ben Inkubálás egy három és hat napig 25 C-on Sejtmentes készítése Élelmiszerből izolálása ának keresése Yersinia enterocolitica ellen Gátló hatású jellemzése Centrifugálás (14000rpm, 4 C), szűrés Yersinia szaporodásának megfigyelése a jelenlétében Multiscan ascent, 595nm-en szaporodás detektálása Felülúszó bekoncentrálása azonosítása liofilizálással Morfológia szerinti csoportosítás Kontakt inhibíció KOH, OF, spórafestés (GP) Koncentrált gátló hatásának megfigyelése Sejtmentes 16S rdns 10x Koncentrált Együttenyésztési vizsgálat TSB és tej 9

Módszerek Egy, a kontakt inhibíciós vizsgálat keresése Yersinia során jelentős gátlási zónával rendelkező enterocolitica ellen izolátum kiválasztása CSE-T-4 A gátló mikróba és a Y.

10 Módszerek Egy, a kontakt inhibíciós vizsgálat keresése Yersinia során jelentős gátlási zónával rendelkező enterocolitica ellen izolátum kiválasztása CSE-T-4 A gátló mikróba és a Y. enterocolitica Gátló hatású beoltása TSB-be és UHT-tejbe A beoltott koncentráció 1:1 és 1:10 arányú (~10 1 patogén mind a két esetben) Inkubálás 4 C-on és 25 C-on Élelmiszerből izolálása ának jellemzése Kioltás TSA és Mossel agar lemezekre egy, kettő, három és hat nap után azonosítása TSA: mind a két baktérium szaporodik Mossel: Yersinia nem szaporodik Morfológia szerinti csoportosítás Kontakt inhibíció KOH, OF, spórafestés (GP) 16S rdns Sejtmentes 10x Koncentrált Együttenyésztési vizsgálat TSB és tej 10

11 Eredmények Összesen 78 izolátum került begyűjtésre négy helyről Morfológia alapján csoportosítva 68 féle izolátummal végeztünk további vizsgálatokat 11

Eredmények Az izolátumok közül 14 volt képes a

gátlására kontakt inhibíciót figyelve A legjobb 15

Tojás Tej Kód C2Z CP-P-5 CP-P-8 CSE-B-2 CE-B-1 CE-PT-1

12 Eredmények Az izolátumok közül 14 volt képes a Yersinia enterocolitica részleges vagy teljes gátlására kontakt inhibíciót figyelve A legjobb 15 C-30 C között első és második napon Forrás Zöldség Hús Tojás Tej Kód C2Z CP-P-5 CP-P-8 CSE-B-2 CE-B-1 CE-PT-1 CSE-T-1 CSE-T-3 CSE-T-4 CE-E-1 CM-CT-2 CM-SMT-1 CSM-RMT-1 CSM-RMTII-1 12

13 Eredmények Forrás Kód OF (glükóz) KOH Spóra Zöldség C2Z Hús CP-P-5 O - - CP-P-8 F - + CSE-B-2 O - - CE-B CE-PT Tojás CSE-T-1 O/F + - CSE-T CSE-T CE-E CM-CT Tej CM-SMT CSM-RMT-1 O/F - - CSM-RMTII-1 O/F

14 Eredmények Forrás Kód API/BBL szekvenálás Zöldség C2Z Enterococcus avium Bacillus weihenstephanensis (99.91%) Hús CP-P-5 Pseudomonas putida Pseudomonas lundensis (99.9%) CP-P-8 Sphingomonas paucimobilis Paenibacillus pabuli (99.9%) CSE-B-2 Acinetobacter baumanii/ calcoaceticus Pseudomonas rhizosphaerae (99.05%) CE-B-1 Corynebacterium renale Macrococcus caseolyticus (99.8%) CE-PT-1 Staph. kloosii Rothia endophytica (100%) Tojás CSE-T-1 Lactococcus lactis ssp. cremoris Staphylococcus vitulinus (100%) CSE-T-3 Staph. haemolyticus Macrococcus caseolyticus (99.8%) CSE-T-4 Helcococcus kunzii Bacillus pumilus (100%) CE-E-1 Satph. haemolyticus Macrococcus caseolyticus (99.79%) CM-CT-2 Ps. Fluorescens Pseudomonas azotoformans (99.52%) Tej CM-SMT-1 Streptococcus intermedius Staphylococcus sciuri subsp. sciuri (100%) CSM-RMT-1 Burkholderia cepacia Serratia marcescens subsp. marcescens (99.5%) CSM-RMTII-1 Aeromonas hydrophilia/caviae Serratia marcescens subsp. marcescens (100%) 14

15 Eredmények Yersinia _lio_1.nap 0,6 Absorbance 595nm 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0-0,5 4,5 9,5 14,5 19,5 24,5 Idő (óra) Yersinia kontroll CE-EJ-2 day1 CE-EJ-2 day3 CP-P-5 day1 CP-P-5 day3 CSM-RMT-1 day1 CSM-RMT-1 day3 CSM-RMT-1 day6 CM-CT-2 day1 CM-CT-2 day3 CM-CT-2 day6 Koncentrált k 15

16 Eredmények Tejben jelenlévő természetes antimikrobás anyagok 16

17 Összefoglalás Élelmiszerfeldolgozó környezetéből sikerült potenciálisan antagonista izolálása (Y. enterocolitica ellen vizsgálva) Kontakt inhibíció esetén a hőmérsékleti optimuma 15 C -30 C Sejtmentes a koncentrált (10x-es töménységű) esetben kedvező Szükséges a molekuláris azonosítás a fajok pontos meghatározásához környezeti izolátumok esetében A gátló komponensek Feltehetően elsődleges metabolitok (a 24 óra után megjelenik és akkor a legjelentősebb) Koncentráltan tudnak kedvezőbb hatást kifejteni (folyadék tenyészetben minimális hatás) 17

18 Köszönöm a megtisztelő figyelmet!

Hasonló dokumentumok

Különböző Capsicum annuum var. grossum paprikafajták endofita baktériumainak izolálása, jellemzése és molekuláris biológiai vizsgálata

Élelmiszertudományi Kar, Mikrobiológiai és Biotechnológiai Tanszék, Budapest Különböző Capsicum annuum var. grossum paprikafajták endofita baktériumainak izolálása, jellemzése és molekuláris biológiai