A BAKTÉRIUMOK AZONOSÍTÁSA: BIOKÉMIAI REAKCIÓK. Krizsán Gergely dr.

Átírás

1 A BAKTÉRIUMOK AZONOSÍTÁSA: BIOKÉMIAI REAKCIÓK Krizsán Gergely dr.

2 A nitrogén-anyagcserén alapuló tesztek

3 UREÁZ-REAKCIÓ Az urea (karbamid) lebontását katalizálja NH 3 -ra és CO 2 -ra A keletkező NH 3 megnöveli a ph-t, ezzel a fenolvörös indikátor narancsvörös (semleges) színét lilára változtatja (lúgos kémhatás) Ureáz-negatív baktériumok esetén a narancsvörös szín sárgára változik a savtermelés következtében SH-enzim, ezért gátolható DTNB-vel, PCMB-vel és egyéb higanytartalmú vegyületekkel Fontos szerepe van a nitrogén-anyagcserében Gyengén pozitív Klebsiella spp. esetén Erősen pozitív Proteus fajoknál struvitkövek (MgNH 4 PO 4 ) keletkezése! + - U

4 Ureáz-reakciók A Helicobacter pylori is ureáz-pozitív Negatív: E. coli Gyengén pozitív: Klebsiella pneumoniae Erősen pozitív: Proteus vulgaris

5 INDOL-REAKCIÓ A triptofanáz enzim kimutatására szolgál Két részreakcióból áll: hidrolízis és dezaminálás Sósav (HCl) jelenlétében az indol lila terméket képez a p-dimetil-amino-benzaldehiddel történő reakció során (Kovács-reagens/Ehrlich-reagens) Pozitív reakció: a felső fázis lila gyűrűként jelenik meg Negatív reakció: a felső fázis sárga marad

6 Néhány képlet Indol Triptofán Triptofán Indol Piruvát NH 3 (g) + HCl (g) NH 4 Cl (s) A Proteus fajok indol-reakciója során fehér füst keletkezik.

7 Indol-reakciók (kémcsőben és szűrőpapíron) Negatív: Klebsiella pneumoniae Pozitív: E. coli

8 A légzési enzimek aktivitásán alapuló tesztek

9 KATALÁZ-REAKCIÓ A hemet tartalmazó kataláz enzim által katalizált reakción alapul Az enzimnek igen jelentős szerepe van az oxidatív stressz elleni védelemben a H 2 O 2 eliminálása révén A kataláz és a hasonló protektív enzimek tipikusan aerob baktériumokban találhatók meg A katalizált reakció: 2 H 2 O 2 (aq) 2 H 2 O (l) + O 2 (g) Gázbuborékok keletkezése jelzi a pozitív reakciót Legfontosabb alkalmazás: Staphylococcus spp. (+) és Streptococcus spp. (-) elkülönítése

10 K1: Miért nem szabad ezt a tesztet véres agaron végrehajtani? V1: Mivel maga a táptalaj is rendelkezhet kataláz-aktivitással! (álpozitív reakció) K2: Miért nem szabad ezt a tesztet fémkaccsal kivitelezni? V2: Mivel bizonyos fémek hasonló reakciót adhatnak! (álpozitív reakció)

11 OXIDÁZ-TESZT Az oxidatív metabolizmus kulcsenzime, a citokróm-oxidáz kimutatására szolgál. Obligát anaerob baktériumokban nincs jelen. A kimutatás p-fenilén-diamin reagenssel történő redoxreakción alapul: a reagens irreverzibilisen sötétkék/lila termékké alakul. A reakció az alábbi baktériumokra pozitív: Pseudomonas spp. Neisseria spp. Haemophilus spp. (NB.: lassú reakció: >30 sec) Vibrio spp. Aeromonas spp. Plesiomonas spp. Campylobacter spp. Alcaligenes spp.

12 Kéntartalmú vegyületek anyagcseréjén alapuló tesztek

13 A H 2 S-TERMELÉS KIMUTATÁSA Bizonyos baktériumok különféle kéntartalmú molekulákból ill. ionokból (pl. szulfátok (SO 4 2- ), szulfitok (SO 3 2- ), tioszulfátok (S 2 O 3 2- ) vagy bizonyos aminosavak (pl. Cys, Met)) kénhidrogént (H 2 S) termelnek, amely záptojásszagú mérgező gáz. A H 2 S általában sötétszínű csapadékokat képez fémionokkal, mint a Fe 3+ (ferri) és az Pb 2+ (plumbo), mindkét csapadék fekete (Fe 2 S 3, PbS) FeCl 3 ill. Fe 2 (SO 4 ) 3 tartalmú táptalajokat használunk a H 2 S-termelés detektálására A fenti kémiai reakciókat a Módosított Russel-táptalaj, a TSI-politrop táptalaj és a bizmut-szulfit agar esetén alkalmazzuk.

14 A LEGFONTOSABB H 2 S-TERMELŐ BAKTÉRIUMOK Proteus spp. Pr. vulgaris, Pr. mirabilis, Salmonella spp. TSI = Triple Sugar Iron táptalaj Tartalmaz: + brillantcukor (laktóz, dextróz, szacharóz) + fenolvörös (sav-bázis indikátor) + vas(iii)-só (pl. Fe 2 (SO 4 ) 3 ) H 2 S- termelés Nincs laktózfermentáció Glükózfermentáció

15 Szénhidrátok és szerves savak anyagcseréjén alapuló tesztek

16 LAKTÓZ-FERMENTÁCIÓ Az Enterobacteriaceae család felosztható laktóz-fermentáló (+) és lactózt nem fermentáló (-) baktériumokra. A legfontosabb laktóz-pozitív baktériumok: E. coli Klebsiella spp. Enterobacter spp. Citrobacter spp. A legfontosabb laktóz-negatív baktériumok: Salmonella spp. Shigella spp. Serratia spp. Proteus spp. Yersinia spp.

17 ONPG (β-galaktozidáz)-teszt I. ONPG = o-nitrofenil-β-d-galaktopiranozid Mikroorganizmusok laktóz fermentáló képességének detektálására használatos Igen hasznos az Enterobacteriaceae családba tartozó baktériumok osztályozásában Az ONPG a laktózhoz hasonló molekula A laktóz-fermentáló (+) baktériumokban megtalálható mind a β-galaktozidáz mind a laktóz-permeáz A késői laktóz-fermentáló (+) baktériumokban csak a β-galaktozidáz van jelen A laktózt nem fermentáló (-) baktériumokban egyik molekula sem található meg

18 ONPG (β-galaktozidáz)-teszt II.

19 EOZIN-METILÉNKÉK (EMK) AGAR A laktóz mellett két festéket tartalmaz: eozint és metilénkéket A festékek gátolják a legtöbb Gram-pozitív baktérium növekedését (szelektivitás) A baktériumok a laktóz-fermentálás alapján különíthetők el (differenciálás) A laktóz-pozitív baktériumok sötétkék/lila telepeket képeznek A telepekben savtermelés következtében csökken a ph, ezért az eozin kicsapódik és a felszínén megköti a metilénkéket A laktóz-negatív baktériumok színtelen vagy rózsaszín telepeket képeznek Tartalmaz rajzásgátló detergenseket

20 Escherichia coli EMK-táptalajon

21 OXIDÁCIÓ-FERMENTÁCIÓ (OF)-TESZT A teszt annak eldöntésére szolgál, hogy a szerves molekulák lebontása oxidatív (aerob) vagy fermentatív (anaerob) metabolikus úton történik-e. A táptalaj 1 % glükózt (vagy dextrózt) tartalmazó magas agar, amelyben jelen van brómtimolkék, egy sav-bázis indikátor, amely semleges ph-n fűzöld, savas ph-n sárga, míg lúgos közegben kék. A steril OF-agar fűzöld (a semleges kémhatásnak megfelelően), savtermelés esetén a színe sárgára változik.

22 OF-próbák OF +/+: az egész táptalaj sárga (pl. E. coli) OF +/-: csak a táptalaj felső része sárga (nem fermentálók, pl. Pseudomonas spp.) OF -/-: az egész táptalaj fűzöld (biokémiai inaktivitás, pl. Acinetobacter spp.) OF +/+ OF +/- OF -/- Ha a táptalaj felső része kék: alkalizáló mikroorganizmus van jelen (pl. Alcaligenes spp.) Steril OF-agar

23 CITRÁT-FELHASZNÁLÁS Ammónium-sókat (pl. (NH 4 ) 2 SO 4 ) + nátrium-citrátot + brómtimolkék indikátort tartalmazó magas agar Citrát-felhasználás esetén a savfogyasztás következtében megnő a ph Az indikátor zöld színe kékre változik. Néhány citrát-pozitív baktérium: KESC-csoport: Klebsiella spp. Enterobacter spp. Serratia spp. Citrobacter spp. TCBS-táptalaj Vibrio spp. tenyésztésére C = citrát brómtimolkéket tartalmaz

24 Kölcsönhatások a baktériumok és a vér különféle komponensei között

25 A HEMOLÍZIS TÍPUSAI α: A haemoglobin részleges lebontása biliverdinné (zöld pigment), a haem-oxigenáz révén. Egyéb elnevezés: zöldítő hemolízis. Nem a vörösvértestek részleges lebontását jelenti! β: A haemoglobin teljes lebontása színtelen termékké Definíciószerűen nem a vörösvértest teljes lebontását jelenti, bár ebben az esetben maga a vörösvértest is lebontásra kerül. γ: Nincs hemolízis

26

27 CAMP-TESZT STREPTOCOCCUS AGALACTIAE AZONOSÍTÁSÁRA CAMP Streptococcus agalactiae Staphylococcus aureus CAMP = Christie, Atkins, Munch-Petersen

28 KOAGULÁZ-TESZTEK I. A koaguláz enzimeknek két típusa létezik: az exokoaguláz (szabad) és az endokoaguláz (kötött) Funkciójuk a baktériumsejt védelme a szervezet baktericid mechanizmusaitól fibrinburok kialakítása révén ( molekuláris mimikri ) Az exokoaguláz szekretált enzim, amely a fibrinogént fibrinné alakítja, ezzel lokálisan véralvadást idéz elő. Az endokoaguláz a S. aureus felszínén található, megköti a fibrinogént, ezzel befedi a baktériumot. Igen fontos teszt a Staphylococcus spp. elkülönítésében A Staphylococcus aureus pozitív Egyéb Staphylococcus spp. negatívok, ezért koaguláz-negatív Staphylococcus-oknak nevezzük őket (KNS/CNS) A leggyakoribb KNS-ok: S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus Néhány egyéb faj szintén adhat pozitív reakciót, pl. S. lugdunensis (clump-szerű faktor), S. intermedius, S. hyicus Ezek közül a S. lugdunensis a S. aureus-hoz hasonlóan súlyos endocarditist okozhat.

29 KOAGULÁZ-TESZTEK II Csőkoaguláz-teszt szekretált enzim (exo-koaguláz) fibrinogén fibrin átalakulás Clump-teszt S. aureus sejtek agglutinációja fibrinogénhez kapcsolással nem szekretált enzim (endo-koaguláz) NINCS fibrinogén fibrin átalakulás Fn Fn Latex particle SA Fn Gyorsteszt Latex-agglutináció fibrinogén + anti-protein A-antitest latex partikulumok felszínéhez rögzítve

30 A lipidek anyagcseréjén alapuló tesztek

31 LECITINÁZ- ÉS LIPÁZ-REAKCIÓ Lecitináz-reakció: a lecitinázt termelő baktériumok lebontják a lecitovitellin nevű lipoproteint, ennek következtében lipidek csapódnak ki a telepek körül a táptalajban A teszt specifikus változata: Nagler-reakció (a Clostridium perfringens lecitináz-termelése specifikus antitoxinnal gátolható) Lipáz-reakció: olajos, gyöngyházfényű telepek

32 API = AUTOMATED PROFILE IDENTIFICATION Azonosítás plate-eken biokémiai reakciók révén, számítógép felhasználásával