Molekuláris genetikai vizsgáló. módszerek az immundefektusok. diagnosztikájában

Átírás

1 Molekuláris genetikai vizsgáló módszerek az immundefektusok diagnosztikájában

2 Primer immundefektusok A primer immundeficiencia ritka, veleszületett, monogénes öröklődésű immunhiányos állapot. Családi halmozódást mutathatnak. A génhiba következménye: az immunsejtek számbeli és/vagy funkcionális csökkenése

3 Vizsgált gének száma között

4 Vizsgált gének száma BETEGSÉG GÉNEK SZÁMA PID 59 LSD 4 Egyéb 6 Összeses 69

5 1400 Elvégzett genetikai vizsgálatok száma között PID genes Other genes Total

6 Elvégzett genetikai vizsgálatok száma között BETEGSÉGEK VIZSGÁLATOK SZÁMA PID 1012 Egyéb 220 Összesen 1232 Prenatalis vizsgálat 35

7 GENETIKA = ÖRÖKLÉSTAN - a gének, - az öröklődés, - az élőlények variációjának tudománya 1819 Festetics Imre az öröklődés számos szabályszerűségét megfogalmazása 1865 Gregor Mendel genetikai törvények, kersztezés 1903 Kromoszóma felfedezése 1913 A kromoszómák lineárisan rendezett gének sorát tartalmazzák 1927 A génekben lejátszódó fizikai változásokat mutációnak nevezik 1941 A gének kódolják a fehérjét.

8 1944 Elősször izolálják a genetikai anyagot, a DNS-t 1953 James D. Watson és Francis Crick DNS szerkezetének a megismerése 1983 Kary Banks Mullis polimeráz láncreakciót (PCR-t) DNS sokszorosítása 1989 Francis Collins és Lap-Chee Tsui Az első gén szekvenálása (CFTR fehérje, cisztikus fibrózis) A Humán Genom Projekt sikeres befejezése a genom 99%-nak szekvenálása GÉNTERÁPIA

9 Örökítő anyag A kromoszómák génekből épülnek fel 23 pár kromoszóma A T A gének DNS-ből állnak A DNS nukleotidokból épül fel C A A C G T T G

10 DNS Éretlen RNS Érett RNS Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Intron 1 Intron 2 Intron 3 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Intron 1 Intron 2 Intron 3 5 CAP Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 3 PolyA Fehérje

11 MUTÁCIÓ Örökítő anyag megváltozása Kromoszóma számbeli és méretbeli megváltozása Gén bázissorendjének a megváltozás Funkció vesztés Funkció nyerés Káros Hasznos (Leiden-mutáció, véralvadás zavara)

12 Öröklődés típusai X-kromoszómához kötött XX XY XX XX XY XY Autoszómális domináns Autoszómális recesszív DE NOVO

13 MOLEKULÁRIS GENETIKAI VIZSGÁLAT JELENTŐSÉGE Klinikai diagnózis megerősítése Korai diagnózis felállítása Időben elkezdett, megfelelő terápia a beteg életminősége javul, jobb prognosztika Családtagok vizsgálata Családfa készítése Öröklődés menetének megismerése Hordozó állapot felderítése Családtervezés segítése

14 MÓDSZEREK DNS izolálás Amplifikációs PCR Szekvenálási PCR DNS szekvenálás Kiértékelés adatbázis segítségével 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)

15 Btk Gén elhelyezkedése: X -kromoszóma; Xq21,3-Xq22 Mérete: 37,5 kb Exonok száma: 19 (18 kódoló) Gene Cards GC0XM100491

16 I. II. BTK, 16 exon c.1573 C>T p.r525x I/1 II/1 II/2 G C T C G A A G C T T G A A G C T C G C T T G A A G A A G C T T G A A G C T Kontroll C G A A 1 PH TH SH3 SH2 SH PH TH SH3 SH2 SH1 525

17 Azonosított genetikai eltérések Csendes mutáció (C>A TCC TCA szerin szerin) Polimorfizmus (SNP) Ismert mutáció (irodalom, adatbázisok alapján) Új mutáció patogenitást igazolni kell

18 Patogenitás igazolása Nonsense mutáció, deléció, inszerció önmagában elegendő Splicing mutáció, missense mutáció további vizsgálatokat igényel Geneteikai eltérés jelenléte az egészséges populációban Mutáció helyzete Fehérje jelenléte Fehérje funkciója Sejtes vizsgálatok

19 MUTÁCIÓ HELYE 1 PH TH SH3 SH2 SH1 659 Lindvall et al., Fenilalanin Tirozin AMINÓSAVAK TULAJDONSÁGA apoláros hidrofób poláros hidrofil AMINÓSAV KONZERVÁLTSÁGA patkány egér human csimpánz csirke 10 Lindvall et al., 2005.

20 Relative SH2D1A expression Gén kifejeződése 1 0,8 0,6 1 0,62 Kontroll Anya Beteg 0,4 0,2 0 0

21 Western-blot 70 kda C WT G245D C WT F570L ά-flag 41,7 kda 40 µg 40 µg 40 µg 150 µg 40 µg 40 µg 40 µg 150 µg ACTIN

22 Relatív enzimaktivitás (%) SMPD1 enzimaktivitása és fehérje fél-életidő vizsgálat Szubsztrát: 2-N-Hexadecanoylamin-4-nitrophenolphosphorylcholine 15 mm / reakció

23 Percentage of cells (%) IL-17+ and IL-22+ T sejtek 4,5 4 3,5 3 Kontroll Beteg 2,5 2 1,5 1 0,5 0 CD3+/IL-17+ CD3+/IL-22+ CD4+/IL-17+ CD4+/IL-22+

24 Kontroll 257 I. APS1 (AIRE) AIRE, 6. exon c.769c>t p.r257x m/vt C T 257 m/vt C T 257 II. m/vt C T m/vt C T m/m p.arg257stop Mark Saltis et al.,2008

25 SÚLYOS KOMBINÁLT IMMUNDEFICIENCIA IL2RG gene c.295insa V99fsX11 I. II. Kontroll Beteg1 (II/1) Beteg 2 (II/2) Anya (I/1) insa insa insa prenatal

26 Molekuláris genetikai vizsgálat fontossága A mutáció analízise elengedhetetlen a pontos diagnózishoz Családtagok szűrése hordozó állapot felderítése korai diagnózis a tünetek megjelenése előtt prenatalis vizsgálat Időben elkezdett, megfelelő terápia Betegek állapota, életminősége és a betegség prognosztikája javul