Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Átírás

1 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A

2 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Scholtz Beáta Molekuláris Terápiák 1. előadás FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 1.

3 FUNKCIONÁLIS GENOMIKA 1. TÁMOP /1/A A fejezet célja, hogy ismertesse a funkcionális genomika célkitűzéseit és legfontosabb módszereit. Konkrét példákon kereszül bemutatjuk, hogyan járulhat hozzá ez a tudományág az orvostudomány fejlődéséhez. 1.1 DEFINÍCIÓK 1.2 A BETEGSÉGEKRŐL 1.3 A BETEGSÉGMECHANIZMUSOK FELTÁRÁSÁNAK MÓDSZEREI A génexpresszió szabályozásának alapesetei Microarray-k: Funkcionális genomika a rákterápia fejlesztéséért Genetikai aberrációk és betegségek Genom microarray-k Array összehasonlító genom hibridizáció (acgh)

4 Definíciók Genomika: a genomok, azaz az élőlények DNS állományának vizsgálata, bioinformatikai eszközökkel. Előfeltétele: genomszekvenciák adatbázisokban. Statikus: a genomszekvenciák elvileg nem (igen lassan) változnak. Bioinformatika: proteinek, gének, genomok vizsgálata számítógépes algoritmusokkal és adatbázisok felhasználásával. Funkcionális genomika: Genotípus és fenotípus korrelációk. Globális, nagy áteresztő-képességű módszerek segítségével vizsgálni a gének és termékeik funkcióit. Normál és patológiás állapotokban A környezeti változások hatására Különböző élőlények összehasonlítása 4

5 Mi a funkcionális genomika? Funkcionális genomika: Globális (genom-szintű vagy rendszer-szintű) kísérleti módszerek kifejlesztése és alkalmazása, melyek a strukturális genomika reagenseivel és információival együtt alkalmas a gének funkcióinak vizsgálatára. Jellemzően nagy áteresztő-képességű, sok mintát vizsgáló kísérletes megközelítéseket jelent, melyeket az eredmények számítógépes, statisztikai analízise egészít ki (Hieter and Boguski 1997). A fenotípus vizsgálatra használt funkcionális genomika elsősorban abban különbözik a klasszikus módszerektől, hogy lényegesen több mintát/adatpontot vizsgál, és erősen automatizált. Egy klasszikus génexpressziós kísérlet azt vizsgálhatja, hogy hogyan változik egy gén aktivitása az egyedfejlődés során in vivo. Modern funkcionális genomikai megközelítéssel ezzel szemben azt vizsgáljuk, hogy hogyan változik gének ezreinek-tízezreinek az aktivitása az egyedfejlődés során. (UCDavis Genome Center) 5

6 Emberi betegségek: a változatok következményei A genetikai variációk teszik lehetővé az evolúció motorjaként szolgáló adaptív változásokat. Bizonyos változások javítják a faj alkalmazkodó-képességét. Mások káros hatásúak. A faj bizonyos egyedei számára a káros változatok betegséget okozhatnak. Molekuláris szemszögből: mutáció és variáció Orvosi szemszögből: patológiás állapot 6

7 Miért van olyan sokféle betegség? A genom sok régióját érintheti Sokféle mutációs mechanizmus létezik A gének és termékeik kölcsönhatásban vannak a molekuláris környezetükkel Az egyén olyan kölcsönhatásba kerülhet környezetével, ami elősegíti a betegség kialakulását 7

8 Egy betegség különböző perspektívákból Orvoslás: diagnózis, kezelés, prognózis, megelőzés Genetika: megérteni az egyedi fenotípus hátterét és kialakulását Genomika/funkcionális genomika: gének azonosítása és karakterizálása. Kromoszomális elrendeződésük, betegségekben betöltött szerepük és funkcióik Bioinformatika: proteinek, gének, genomok vizsgálata számítógépes algoritmusokkal és adatbázisok felhasználásával. 8

9 Egy betegség a bioinformatika szemszögéből Bioinformatika: proteinek, gének, genomok vizsgálata számítógépes algoritmusokkal és adatbázisok felhasználásával. A DNS adatbázisokban tárolt referencia szekvenciák a normál és betegséggel kapcsolható szekvenciák összehasonlítására is használhatók A fizikai és genetikai térkép betegség-gének azonosítására alkalmas A proteinek szerkezetét vizsgáló kísérletek értelmezhetik a mutációk hatásait A géneket többféle funkcionális genomikai módszerrel tanulmányozzák A betegségekkel kapcsolt génekről sok minden megállapítható az ortológ gének és funkcióik összehasonlításával 9

10 A betegségek alaptípusai Négy alapvető betegségtípus: Monogénes komplex genomikai környezeti 10

11 A betegségek alaptípusai Egygénes betegségek ritka többgénes patofiziológia autoszomális domináns autoszomális recesszív X-kapcsolt recesszív Komplex betegségek gyakori többgénes központi idegrendszer kardiovaszkuláris veleszületett rendellenességek Kromoszóma elváltozások gyakori többgénes Fertőző betegségek leggyakoribb többgénes Környezet okozta betegségek leggyakoribb többgénes 11

12 Egygénes betegségek Korábban szigorúan elválasztották egymástól az egygénes és a többgénes (komplex) betegségeket. Ma már inkább átfedőnek látjuk őket. Az egygénes betegségeket definiálhatjuk úgy, hogy a rendellenességet elsősorban egy gén mutációi váltják ki. Ettől függetlenül, a patofiziológia kialakításában több gén is részt fog venni. 12

13 Betegségek alaptípusai: Komplex betegségek Az egygénes betegségek 90%-a serdülőkorra manifesztálódik 1%-uk 50 éves kor fölött jelentkezik A komplex betegségek jellemzően később jelentkeznek Ha korán jelentkeznek, a tünetek lényegesen súlyosabbak Példák: fejlődési rendellenességek, korai asztma, magas vérnyomás, rák, cukorbetegség A komplex betegségek fenotípusa gradiens mentén változik a populációban 13

14 Komplex betegségek Több gén felelős a kialakulásukért. A génekben található mutációk vagy szekvencia variánsok együttes kombinációja határozza meg a betegséget. A komplex betegségek nem mutatnak Mendeli öröklődést: családokban halmozottan fordulhatnak elő, de nem szegregálódnak. Ezért a szokásos genetikai analízisekkel (pl. linkage) nem könnyű azonosítani az érintett géneket még a családok ismeretében sem. A hajlamosító allélek gyakoriak a populációban. Komplex betegségek például: asztma, autizmus, magas vérnyomás, elhízás, csontritkulás. 14

15 Genomi - kromoszomális - betegségek Sok betegség hátterében kromoszomális deléciók, duplikációk vagy átrendeződések állnak. Előfordulhat aneuploidia is, azaz a normálistól eltérő kromoszómaszám. Ezeket a betegségeket bioinformatikai szempontból genomi microarray kísérletekkel érdemes tanulmányozni. 15

16 16

17 Fizikai térképezéssel azonosított betegséggének Duchenne izomdisztrófia (1986) Cisztikus fibrózis (1989) Huntington betegség (1993) BRCA1 és 2 - emlőrák (1994) 17

18 Egygénes betegségek Autoszómás domináns BRCA1, BRCA2 1:1000 Huntington chorea 1:2,500 Tuberous sclerosis 1:15,000 Autosomal recessive Albinizmus 1:10,000 Sarlósejtes anémia 1:655 (U.S. fekete) Cisztikus fibrózis 1:2,500 (Európa) Fenilketonuria 1:12,000 X-kapcsolt Hemofília A Rett szindróma Törékeny X szindróma 1:10,000 (férfiak) 1:10,000 (nők) 1:1,250 (férfiak) 18

19 Betegségtípusok: környezet okozta betegségek Példa: Az ólommérgezés környezet okozta betegségnek tekinthető. Elég gyakori - az USA-ban élő gyermekek 9%-ában magas a vér ólomszintje. De ugyanolyan ólomterhelésnek kitett gyermekek fenotípusa egészen különböző lehet. A különbséget az eltérő genetikai háttér okozza. Következtetés: a genetikai háttér befolyásolja a környezeti tényezők vagy fertőző ágensek hatására kialakuló betegségek manifesztációját. Még egygénes betegségeknél is több gén megváltozott működése alakítja ki a végső fenotípust. 19

20 Egyéb betegségtípusok: az organellumok betegségei Mitokondriumok: Több mint 100 betegség-okozó mutáció ismert Peroxiszómák: A mutációk vagy a peroxiszóma funkciót, vagy az organellum biogenezisét érintik. Élesztőben jól modellezhetők. Lizoszómák 20

21 A humán mitokondriális genom morbiditási térképe 21 DiMauro and Schon, 2001

22 22

23 A betegségmechanizmusok feltárásának módszerei Egygénes betegségek: Genetika és genomika Módszerek: linkage analízis, genom-szintű asszociációs vizsgálatok, kromoszóma aberrációk azonosítása, genom DNS szekvenálás Többgének betegségek: genomika, funkcionális genomika, genetika stb. A globális analízisek azonosíthatják a molekuláris terápia célpontjait! 1. Betegségokozó gének: (kardiovaszkuláris, diabétesz, Alzheimer-kór) 2. Gének és a környezet közötti interakciók, melyek krónikus betegségekhez vezethetnek 3. A rák különböző aspektusai terápiás válasz prognózis kiújulás 4. Alapvető kérdések a gének szabályozásával kapcsolatban. 23

24 A génexpresszió szabályozásának alapesetei szervszintű (pl. agyban vagy vesében) az egyedfejlődés során (pl. magzati vagy felnőtt szövetek) a környezeti hatásokra adott dinamikus válasz (pl. korai válaszadó gének) betegség hatására génaktivitás Génexpresszió és betegségek: jó korreláció az RNS expressziós szintek és a fenotípus között. 24

25 A génexpresszió globális analízise DNS RNS protein DNS RNS protein Microarray cdns cdns UniGene SAGE 25

26 Microarray DNS RNS protein DNS RNS protein cdns cdns A génexpresszió az a folyamat, melynek során a génben levő információ struktúrákká (protein) és sejtbeli funkciókká fordítódik le. A microarray alapkoncepciója, hogy egyedileg mérje a mrns-ek mennyiségét, és ezáltal azonosítsa, mely géneket expresszálja (használja) a sejt. 26

27 Génexpressziós microarray-k Pillanatfelvétel, mely egyszerre többezer gén aktivitását rögzíti. Szabályos mátrixba rendezett, próbákat tartalmazó mikropöttyök összessége, ahol minden pötty egyféle szekvenciájú nukleinsavat (próbát) tartalmaz, ami egy génnek felel meg. A rendszer alkotóelemei: szilárd hordozófelület DNS próbák: cdns vagy oligonukleotida, ismert gének homológjai Vizsgálandó minták (mrns-ből jelölt cdns) Szkenner (szignál rögzítés) Számítógépes algoritmus (adatelemzés) 27

28 Nyomtatott expressziós array-k Affymetrix expressziós array-k 28

29 29

30 Nyomtatott expressziós array-k Fluoreszcencia mérése, két csatornán piros zöld Kontroll Teszt Fluoreszcensen jelölt próbák készítése Hibridizálás mosás szkennelés Adatanalízis génexpressziós mintázat azonosítása 30

31 Affymetrix expressziós array-k Hibridizálás festés mosás Szkennelés Kontroll Analízis Teszt Biotinnal jelölt próbák készítése 31

32 A microarray minőségi konzorcium (MAQC) A MAQC Konzorcium cikksorozatot publikált a Nature Biotechnologyban : 2006 szeptember, 24(9). 20 mikroarray terméket és háromféle technológiát értékeltek, RNS transzkript expresszióját vizsgálva humán tumorsejtvonalakban vagy agyszövetben. A kísérleteket végző laboratóriumok és a különböző platformok eredményeiben (szabályozott gének) nagyban megegyeztek. 32

33 MAQC Konzorcium (2006) Nature Biotechnology 24:

34 MAQC Konzorcium (2006) Nature Biotechnology 24: