Molekuláris biológiai módszerek m. hibridizációs s technikák

Átírás

1 Molekuláris biológiai módszerek m II: közvetlen k szekvencia analízis, hibridizációs s technikák Tordai Attila OVSZ Molekuláris Diagnosztikai Labor Bp., április 21. Labordiagnosztikai szinten tartó tanf.

2 foszfát 5 vég bázis 3 vég Bázis komplementaritás dezoxiribóz cukor-foszfát gerinc komplementer bázis párosodás hidrogén hidak cukor

3 Közvetlen szekvencia analízis, lánctermináció ció (Sanger)

4 Szekvencia- analízis (lánctermináció, ció, Sanger)

5 Szekvencia-analízis analízis ((Sanger) Módszer: lánctermináció fluoreszcensen jelölt didezoxi (módosított) nukleotidokkal (BigDye terminator kit) Lépések: Amplifikáció PCR-rel PCR termék tisztítás Szekvenáló reakció Termék tisztítás Analízis: kapilláris elektroforézis T CGTAACGCTAGTC

6 Lánc- hosszabbítás egy primerrel

7 A kapilláris elektroforézis működési elve Gélelektroforézis Kapilláris elfo (ABI 310) - DNS minta kapilláris DNS minta gél érzékelő + puffer puffer + - elfo-kád Detektálás: pl. etídium-bromid Detektálás : fluoreszcens festékek

8 Poliakrila mid gélelektro- forézis radio- izotópos jelöléssel G C A T Kapilláris kapilláris elektroforé zis fluoreszcen s jelöléssel

9 Egy 96-os gél l vizuális képe frameworker.wordpress.com/2008/08/

10 A szekvencia-analízis analízis ((Sanger) ) vvégeredménye kontroll C>T transzverzió variáns heterozigóta ta

11 Mire jó??? j Kutatás: Élőlények genetikai kódja k megfejtése, pl. Human genome project; Alapvető ellenőrz rző módszer bármilyen b DNS-manipul manipuláció során. Diagnosztika: Előre nem jósolhatj solható,, esetleg többszt bbszörös s DNS- variáci ciók k kimutatása egy behatárolt génszakaszon. g

12 Hemofilia A: missense és nonsense mutáció FVIII gén 2. exon: egészséges ember/ normál szekvencia 1. Hemofíliás beteg: Kodon 48: AAG>CAG Lys48Gln 2. Hemofíliás beteg: Kodon 68: TGG>TAG Trp68STOP

13 Nagy felbontású HLA-tipizálás (SBTexcellerator kit)

14 Nagy felbontású HLA-tipizálás kiértékelése kelése HLA-A A*01:01:01:01, 30:01:01

15 Új j generáció (Next generation sequencing,, NGS)

16 NGS platformok Roche 454 GS-FLX platform: piro-szekven szekvenálás (2001 Genome Res); ABI SOLiD sequencing system: Supported Oligonucleotide Ligation and Detection (Science 2005); Illumina Solexa 1G Genome Analyzer: klonális lis amplifikáci ció,, kihorgonyzott primerek, szekvenálás szintézissel zissel (2006).

17 Piro-szekvenálás (II. generációs) A mérés m s elve: Pirofoszfát felszabadulás s nagy érzékenységű (kemilumineszcencián alapuló) ) kimutatása az ismert nukleotid-be beépülés kapcsán.

18 Szekvenálási lehetőségek összehasonlítása sa Voelkerding (2009) Clin Chem

19 Hibridizációs s technikák

20 Southern hibridizáció (hőskor) J Mol Biol Nov 5;98(3): Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. Southern EM. Hibridizáci ció (genetika) = Eltérő genotípus pusú egyedek genetikai anyagának nak részleges r vagy teljes egyesítése se ivaros úton (megtermékeny kenyítéssel). Mendeli értelemben : eltérő homozigóták k párosp rosítása sa (AA x aa). Hibrid fajok. Hibridizáci ció (kémia) = atomi pályp lyák k keveredése, új j pályp lyák létrejötte. tte. Hibridizáci ció (autóipar) = robbanómotoros jármj rmű részleges átalakítása elektromnos energiával kombinált meghajtáss ssá. Hibridizáci ció (mol.biol.).) = komplementer DNS-szakaszok kapcsolódása sa H-kötésekkel. H

21 A Southern hibridizáció főbb lépéseil

22 A FVIII ggéninverzió kimutatása Southern blot technikával Várható RFLP mintázatok Bcl I emésztést követően RFLP mintázatok: I C1 N C2 II 21, , ,5 14 kb N. Normál RFLP mintázat I. 1-es v. disztális típusú inverzió II. 2-es v. proximalis típusú inverzió C1. Carrier (1. típus) C2. Carrier (2. típus)

23 Chip array

24 Definició: Chip-array-technológia Array = makromolekulák k térben t rendezett, hordozóhoz hoz (chip) rögzített sorozata. Fajtái: o Macro ( spot, méret>300m ret>300µm, membrán) o Micro ( spot, méret<300m ret<300µm, szilikon chip) o oligonukleotid; o cdns (komplementer DNS); o DNS; o fehérje; o antitest. Kulcsszó: Hibridizáci ció = specifikus kapcsolódás s a bázisb zis- komplementaritás s elve alapján. + Informáci ció-sokszorozás. s.

25 mrns expresszió összehasonlítás array technikával

26

27 mrns expressziós array ALL és s AML összehasonlítása sa Expressziós mintázat (gene( signature) esetleges prognosztikai tényezt nyező

28 mrns expressziós array ALL és s AML összehasonlítása sa Expressziós mintázat (gene( signature) esetleges prognosztikai tényezt nyező

29 Luminex gyöngyök

30 Luminex xmap: technológia Mikrogyöngy ngyök (5,6 mikron átmérő) ) két k t festék k 100 féle f különbk nböző arányban összekevert elegyével töltve. t A gyöngy ngyök k spektrális tulajdonságaik alapján n egymást stól l elkülöníthet thetők. Minden gyöngy egy külön k n tesztnek felel meg, így 100-as multiplexesítés érhető el. 96-os tálca: t 96 minta x 100 teszt. Egyedüláll lló abban, hogy egyszerre képes k sok mintát t analizálni lni és s egyben sok informáci cióval is szolgál l minden egyes mintáról. A gyöngy felszínére köthetk thető: : antitest, oligonukleotid, fehérje, receptor. Kiért rtékelés: Luminex 100/200 készk szülékben (áraml( ramlási citométerhez terhez hasonló működési elv). Két t lézer: l (i) gyöngy azonosítás és s (ii( ii) ) teszt kiért rtékelés.

31 A munkafolyamat főbb f lépéseil 1: PCR 5 5 biotinnal jelölt lt primerekkel. Eredmény: biotinnal jelölt lt PCR termék. 2: A PCR termék k denaturálása (kémiai). 3: Hibridizáci ció gyöngy felszínére kötött k tt jelöletlen letlen oligonukleotidokkal (max féle f gyöngy 100 féle f különbk nböző próba, 60 C, 15 perc). 4: Mosás. s. 5: Jelölés SA-PE PE-val (sztreptavidin-fikoeritrinnel). 6: Kiért rtékelés s Luminex készk szülékkel.

32 Mérési eredmény

33 Mire jó??? j Növeli a tesztenként nt kinyerhető informáci ció mennyiséget (multiplexesítés); s); Csökkenthet kkenthető az analit mennyiség; Sokféle analit (pl. nukleinsavak, fehérj rjék, stb.) vizsgálhat lható.

34 Ráadás

35 SNP-vizsgálat valós s idejű PCR-rel és s fluoreszcens jelölésű oligonukleotidokkal Saját tervezésű, jelölt/jel lt/jelöletlen letlen szintetikus oligonukleotidok Normál genotípus Heterozigóta Homozigóta mutáns Negatív kontroll

36