Könyvtárak, szekvenálás, mutagenezis

Átírás

1 Könyvtárak, szekvenálás, mutagenezis

2 GÉNKÖNYVTÁRAK GENOMIÁLIS KÖNYVTÁR (könyvtár rendelésre: pl. Stratagene) vektor: -fág (helyettesítő), kozmid, YAC, PAC, BAC méret: N = ln(1-p)/ln[1-(i/g)] klónok száma valószínűség inszert (gén) méret N = ln(1-0,99)/ln[1-(2x10 4 /3x10 9 )] = vektor előkészítés: vektor karok izolálása inszert előkészítés: genomiális DNS izolálás (>100 kb; proteináz-k), emésztés v. mechanikus hasítás, méret szerint frakcionálás ligálás, genom méret

3 primer és amplifikált könyvtár tárolás: fágok 4 o C, sejtek 4 o C ( stab ) v. 80 o C (glicerines stock ) klónkeresés ( screening ): DNS/RNS próba hibridizálás, PCR Séta a genomban ( chromosome walking ) átfedő klónok szub-könyvtárak pl. YAC klónokból

4 cdns könyvtárak vektor: -fág (inszerciós), fágemid méret: N = ln(1-p)/ln[1-(1/n)] ha 0,01% RNS n=10.000, N= RNS, mrns izolálás (RNáz veszély! DEPC kezelés) guanidin-izotiocianát; oligo-dt cellulóz cdns szintézis primer: oligo-dt, oligo-dt-adapter, random oligó, specifikus oligó reverz-transzkriptáz, RNáz H, DNS pol.áz I, ligáz, T4 DNS pol.áz linker v.adapter

5

6 SMART (Clontech) RT termiális transzferáz aktivitásssal is rendelkezik oligoc addíció

7 cdns klónozása: méret szerint frakcionálás ligálás, génbevitel primer v. amplifikált könyvtár (plakkok v. kolóniák) szkrínelés: hibridizálás (DNS/RNS próba, degenerált oligó) immunológiai azonosítás (expressziós vektorok) funkcionális esszé (pl. jelölt DNS DNS-kötő fehérjéhez)

8 SZUBSZTRAKTÍV cdns KÖNYVTÁR kétféle RNS forrás közös RNS/cDNS kiszűrése ligálás előtt

9 SZEKVENÁLÁS KÉMIAI MÓDSZER (Maxam & Gilber, 1977) 3 v. 5 végjelölt templát bázis specifikus módosítás, részleges hasítás, PAGE G dimetilszulfát (N 7 -metilálás) Pu savas piperidin Py hidrazin C hidrazin + NaCl cukor-foszfát gerinc hasítása: (forró) piperidin SV40 (5243 bp) (újdonság: MALDI-tömegspektrométer) 9

10 10

11 11

12 ENZIMATIKUS (láncterminációs; dideoxi) MÓDSZER (Sanger, 1977) templát + primer +DNS polimeráz + dntp/ddntp templát: egy- v. kétszálú DNS, PCR termék (tisztaság!) jelölés: primer (5, [ - 32 P]ATP) polimerizáció ([ - 35 S]dATP) enzim: Klenow, Sequenase, rev. transzkriptáz, Taq pol-áz reakció: négy párhuzamos reakció (négy ddntp) 12

13 denaturáló poliakrilamid gélelektroforézis (urea, formamid, 70 o C) szekvenáló létra ( bázis) wedged slab gél kompressziók (GC-gazdag régió) feloldása: ditp, 7- deaza-dgtp 13

14 AUTOMATA FLUORESZCENS SZEKVENÁLÁS enzimatikus módszer jelölés: primer v. dntp v. ddntp (1 v. 4 különböző) rodamin, BigDye slab gél v. kapilláris elfó (>500 bázis) ABI Prism 310, 373, 377 (PE Biosystems) ciklusos szekvenálás (templát amplifikálás) 1 primer, AmpliTaq polimeráz szintetikus polimer gél online detektálás (lézer) integrált szekvenáló rendszerek (10 kb-1 Mb/nap) 14

15 15

16 MULTIPLEX SZEKVENÁLÁS 20 szekvencia egyszerre 20-féle tag -vektor géltranszfer nylon membránra, többszörös hibridizálás 16

17 Szekvenálási stratégiák: mindkét szál, legalább kétszer (új szekvencia) pontosság: >0,1% shotgun = random szekvenálás nagy inszert: belső primerek ( primer walking ) szubklónozás nested deléciók (exoiii) transzpozon/primer inszerció contigok összeállítása JÖVŐ (?) HUGE (horizontális ultravékony kapilláris elfó) scanning tunneling EM tömegspektrometria mikrokonduktometria 17

18

19

20 20

21

22 22

23 23

24 24

25 Bio A P dsdna fragments P Ligation Fill in B Bio Bio Bio Bio DNA Capture Beads N-hydroxysuccinimide ester (NHS)- activated Sepharose HP (5 -Amine-hexa-ethyleneglycol spacers CCATCTGTTGCGTGCGTGTC-3 ) hybridization at limiting dilution (A seq.) A Capture on SA-Beads & Wash Alkaline Elution B Amplification in emulsion (epcr) µm forward (5 - CGTTTCCCCTGTGTGCCTTG-3 ) µm reverse primers (5 -CCATCTGTTGCG TGCGTGTC-3 ) 25

26 44 um in diameter 55 um in depth 75 pl 480 wells/mm million wells Incubation of DNA beads (25 um) with Bst DNA polymerase, Large Fragment and SSB protein Dynal enzyme beads UltraGlow Luciferase and Bst ATP sulfurylase were prepared biotin carboxyl carrier protein (BCCP) fusions 26

27 Substrate (300 µm D-luciferin and 2.5 µm adenosine phosphosulfate) The flow order of the sequencing reagents PPi flow (21 seconds), followed by 14 seconds of substrate flow, 28 seconds of apyrase wash and 21 seconds of substrate flow first PPi flow was followed by 21 cycles of dntp flows, each dntp flow was composed of 4 individual kernels: (dntp-21 seconds, substrate flow-14 seconds, apyrase wash-28 seconds, substrate flow-21 seconds); an image is captured after 21 seconds and after 63 seconds. 27