In vitro mutagenezis és Irányított evolúció

Átírás

1 In vitro mutagenezis és Irányított evolúció The White House Office of Science and Technology Policy and the U.S. Patent and Trademark Office (USPTO) have announced the winners of the 2015 recipients of the Patents for Humanity Award, among them the Golden Rice Project. Golden rice is a variety of rice (Oryza sativa) produced through genetic engineering to biosynthesize betacarotene, a precursor of vitamin A, in the edible parts of rice. The research was conducted with the goal of producing a fortified food to be grown and consumed in areas with a shortage of dietary vitamin A,[2] a deficiency which is estimated to kill 670,000 children under the age of 5 each year.

2 Mutagenezis Mutáció: az eredeti DNS szekvencia megváltoztatása Mutagenezis céljai: 1. Gén(szakasz) szerepének meghatározása (fenotípus elemzés) 2. Géntermék (ált. fehérje) funkciójának megváltoztatása 3. Nem kódoló génszakaszok (pl. regulációs elemek) funkciójának vizsgálata, megváltoztatása In vitro mutagenezis típusai: 1. Random mutagenezis: random pozíciók változtatása és az érdekes fenotípusok és azokhoz tartozó genotípusok azonosítása 2. Helyspecifikus (site directed) mutagenezis: mutációk ésszerű tervezése ismert térszerkezet és/vagy szekvenciaösszehasonlítások alapján De novo szintézis: teljes gén szintézis (akár mutációval)

3 Random mutagenezis mutátor sejtvonalak Deléciók DNS hibajavító útvonalakon - hibafelhalmozódás pl. XL1-Red (enda1 gyra96 thi-1 hsdr17 supe44 rela1 lac mutd5 muts mutt Tn10 (Tet r )) muts: mismatch hibajavító mutd: pol III 3-5 exonukláz mutt: oxidatív stressz hibajavító kérdéses gén plazmid mutd5 muts mutt XL1-Red n generáció Előny: x magasabb mutációs ráta (vs. wt) - nem szükséges egyéb technika (emésztés, PCR, ligálás, stb.) Hátrány: - 1 mut/2000 bp/ciklus - genóm és plazmid váz is mutálódik - ismételt DNS izolálási és transzformálási lépesek szükségesek X X mutd5 muts mutt X XL1-Red X

4 Random mutagenezis hibára hajlamos error-prone PCR templát A B restrikciós enzim hasítóhelyek dntp arányok mut [Mg 2+ ] +[Mn 2+ ] [Taq] NINCS 3-5 exo proof-reading ciklusszám (60) mut mut mut hatékonyság/ mutáns sereg méret-limt! mut DNS tisztítás DNS emésztés ligálás mut mut Mutáns konstrukciók expresszió mut Klónok fenotípus szerint szelekciója és azonosítása szekvenálással

5 Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Mutációk bevitele észszerűen kiválasztott pozíciókba Észszerű tervezés kiindulópontjai: 1. Ismert szerkezet: funkcionálisan fontos(nak) tartott aminosavak kiválasztása 2. Rokon fehérjék szekvenciaanalízise: konzervált aminosavak cseréje rokonokon belül különböző aminosavak cseréje CLUSTAL multiple sequence alignment sequence1 sequence3 sequence2 sequence4 sequence1 sequence3 sequence2 sequence4 MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR---E MASLAALLPLLALLVLCRLDPAQAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKSRREVEE MAPWMHLLTVLALLALWGPNSVQAYSSQHLCGSNLVEALYMTCGRSG-FYRPHDRRELED MAVWLQAGALLVLLVVSSVSTNPG-TPQHLCGSHLVDALYLVCGPTGFFYNP-KRDVEPL **.:*.**.:... ******:**:***:.** * ** * * AEVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN-- LQVGQAELGGGPGAGGLQPSALELALQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN-- LQVEQAELG--LEAGGLQPSALEMILQKRGIVDQCCNNICTFNQLQNYCNVP LGFLPPKSAQETEVADFAFKDHAELIRKRGIVEQCCHKPCSIFELQNYCN--. :....: ::*****:***. *:: :*:****

6 Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Mutálandó pozíciók azonosítása (PubMed, Uniprot, Expasy, JustBio, stb.)

7 Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Mutálandó pozíciók azonosítása (PubMed, Uniprot, Expasy, JustBio, stb.) 1. Szerkezettel összevetni (ha van) 2. Meghatározni a cserélendő aminosavat

8 Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Mutálandó pozíciók azonosítása (PubMed, Uniprot, Expasy, JustBio, stb.) GCATTCTGAGGCATTCTCTAACAGGTTCTCGACCCTCCGCCATGGCCCCGTGGATGCATC M A P W M H L TCCTCACCGTGCTGGCCCTGCTGGCCCTCTGGGGACCCAACTCTGTTCAGGCCTATTCCA L T V L A L L A L W G P N S V Q A Y S S GCCAGCACCTGTGCGGCTCCAACCTAGTGGAGGCACTGTACATGACATGTGGACGGAGTG Q H L C G S N L V E A L Y M T C G R S G GCTTCTATAGACCCCACGACCGCCGAGAGCTGGAGGACCTCCAGGTGGAGCAGGCAGAAC F Y R P H D R R E L E D L Q V E Q A E L TGGGTCTGGAGGCAGGCGGCCTGCAGCCTTCGGCCCTGGAGATGATTCTGCAGAAGCGCG G L E A G G L Q P S A L E M I L Q K R G GCATTGTGGATCAGTGCTGTAATAACATTTGCACATTTAACCAGCTGCAGAACTACTGCA I V D Q C C N N I C T F N Q L Q N Y C N ATGTCCCTTAGACACCTGCCTTGGGCCTGGCCTGCTGCTCTGCCCTGGCAACCAATAAAC V P * T P A L G L A C C S A L A T N K P CCCTTGAATGAG L E * X Meghatározni a változtatandó aminosav kódját 2. Mutagenezis módszert választani a mutáció beviteléhez

9 Helyspecifikus (site directed) mutagenezis PCR alapú mutagenezis megváltoztatott kóddal mutáció helye 5 AGAGAAGCCGAGCTGAGCGGATCCTCACACGACTGTGAT CTGCAACCAAGCGGGTCTTACCCCCGGTCCTCCG 3 3 TCTCTTCGGCTCGACTCGCCTAGGAGTGTGCTGACACTA GACGTTGGTTCGCCCAGAATGGGGGCCAGGAGGC 5 GAATTCATG TGAGCGGATCCTCACACGACTGTGAT CTGCAACCAAGCGGGTCTTACCCCCTAGGGATCC 3 5 GGTTCGCCCAGAATGGGGGATCCCTAGGGTAC a mutáns pozicióba a megváltoztatott nukleotidot rendeljük ACTGGAATTCATGTGAGCGGATCCTTACACG 5 3 ACTCGCCTAGGAGTGTGCTGACACTA GACGTTGGTTCGCCCAGAATGGGGG upstream oligo: downstream oligo: ACTGGAATTCATGTGAGCGGATCCTTACACG 5 3 CATGGGATCCCTAGGGGGTAAGACCCGCTTGG a szekvencia közepén lévő kód megváltoztatása így nehézkes lehet a hasítóhelyek korlátozott száma miatt

10 Helyspecifikus (site directed) mutagenezis PCR alapú mutagenezis megváltoztatott kóddal B mut templát A PCR (A+B) mut restrikciós enzim hasítóhelyek DNS tisztítás DNS emésztés ligálás mut Mutáns konstrukció - a szekvencia közepén lévő kód megváltoztatása így nehézkes lehet a hasítóhelyek korlátozott száma miatt

11 Helyspecifikus (site directed) mutagenezis templát PCR alapú deléció (domén trunkáció) Primer1 termék PCR Primer2 Primer1 Primer2 termék Primer1 termék Primer2 expresszió

12 Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Megaprimer módszer templát B mut restrikciós enzim hasítóhelyek A 1. PCR (A+B) Az 1. PCR tisztított terméke a 2. PCR primere (megaprimer) templát C megaprimer 2. PCR (megaprimer + C) Mutáció Az eredeti hasítóhelyekre klónozható

13 Helyspecifikus (site directed) mutagenezis B Megaprimer módszer - domén csere prot 1 prot 2 templát 1 templát 2 A 1. PCR (A+B) templát 2 C megaprimer 2. PCR (megaprimer + C) domén cserélt fehérje

14 Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Primer meghosszabítás módszer B D B D A C A C 1. PCR (A+B, C+D) D 1. PCR (A+B, C+D) D A A 2. PCR (A+D) 2. PCR (A+D) Inszerció Deléció eu.idtdna.com alapján eu.idtdna.com alapján

15 Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Kunkel módszer Fágmid (wt inszert) transzformálása dut- ungsejtvonalba (pl. CJ236) DUT: dutpáz dut-: emelkedett dutp szint UNG: uracil-n-glikoziláz ung-: nincs uracil eltávolítás a DNS-ből dut- ung- A G A Az dut- ung- sejtvonalban a T-k esetlegesen U-ra cserélődnek (emelkedett U szint, nincs hibajavítás) m13 fág ssdns izolásása mutáns oligonukleotid anellálása az ssdns-hez szálkiegészítés polimerázzal (dntp, nincs dutp) Mutáns konstrukció transzformálása ung+ sejtvonalba (pl. JM101) alapján Mutációt tartalmazó m13 fág ssdns izolálható (kb % mutáns) ung+ ung+ sejtvonalban: 1. az Uracil tartalmú szál lebomlik 2. a mutációt tartalmazó szálhoz, mint templáthoz szintetizálódik az új szál

16 Helyspecifikus (site directed) mutagenezis Quikhange módszer S-adenosyl-L-methionine (SAM) - metil donor wikipedia.org PCR the-mechanisms-of-dna-replication (SAM) Dpn I hasítóhely Primerek: bp, Tm 78 o C Tm = (%GC)-(675/N)-%mismatch (mismatch) Tm = (%GC)-(675/N) (inszerció, deléció) N nukleotidok száma a mutáns pozíciók nélkül *Pfu Fusion: - 1 hiba/2.5 millió bp - Akár 19 kb termék - Hiba% 3x kisebb, mint PfuTurbo és 20x kisebb, mint Taq (Fusion: Pfu+DNS kötő domén fúziója)

17 Helyspecifikus (site directed) mutagenezis aa-trns szintáz Kiterjesztett genetikai kód STOP kódok/kodonok használata mutagenezisre: aatrns 3 mutáns antikodon C U A G A U STOP kodon NTA kötőhely 5 Cél: nem természetes aminosavak (NTA) bevitele a fehérjébe (unnatural amino acids - UAA) Mód: - mutáns aa-trns szintáz - mutáns trns antikodon - NTA a tápoldatban - Speciális E.coli törzs használata (mutált amber (UAG) kód: C321.ΔA)

18 Helyspecifikus (site directed) mutagenezis alapján Kiterjesztett genetikai kód NEM TERMÉSZETES AMINOSAV MUTAGENEZIS nem természetes aminosav tartalmú célfehérje Fluoreszcens Fotoaktiválható Keresztkötő Spektroszkópiai próba Nanogold-jelölt Nehézfém tartalmú In vitro és in vivo alkalmazás

19 NON-DIRECTED EVOLÚCIÓ information2share.files.wordpress.com/2011/07/the-evolution-of-man-and-woman.jpg

20 EVOLÚCIÓ A variánstömeg B szaporodás öröklődés A A A B B A A A B B C változatosság szelekció A D E B C C C

21 IRÁNYÍTOTT EVOLÚCIÓ A B C D E F változatosság szelekció (akár könyvtár) A B C D E F A B azonosítás szelekció C A fehérjénk mely részét és milyen mértékben mutáljuk?

22 Egy 60 aminosav hosszúságú peptid összes variációja= = Egy 62 minosavas peptid összes variációja= = 5x aminosavas fehérje= = aminosavas fehérje= =

23 Egy 60 aminosav hosszúságú peptid összes variációja= = Egy 62 minosavas peptid összes variációja= = 5x10 80 Atomok szama az univerzumban= aminosavas fehérje= =

24 Variánsok (mutáns könyvtár) kialakítása: Random mutagenzis alapú - error-prone PCR (ld. fent) - szexuális vagy rekombinációs PCR Helyspecifikus mutagenezis alapú - telítési mutagenezis - spiked oligo mutagenezis - tailored oligo mutagenezis

25 Rekombinációs PCR DNáz I természetes variánsok, error-prone PCR termékek aspecifikusan emésztett termékek PCR (minták keverésével; primerek nélkül) az emésztési termékek, mint primerek szerepelnek a kiindulási változatok rekombináns termékei: kombinatórikus könyvtár enzimek biotechnológiai fejlesztésére is használható

26 DNS oligonukleotid szintézis

27 Telítési mutagenezis: 6-7 pozícióban mind a 20 aa. kódolása NNS A T G C A T G C G C NNK 32 féle kodon keverékét eredményezi: - mind a 20 aa. - 1 STOP (vs. 3 STOP - NNN) - egyenletesebb aa. eloszlás (mint NNN) - max. 6-7 pozíció (20 7 = 10 9, ami a display technikák felső limitje) A T G C A T G C T G Spiked oligo: csak 1-1 pozícióban tartalmaz nem wt nukleotidot Tailored oligo: csak 1-1 pozícióban és nem mind a 20 aa. kódja

28 Variánsok (mutáns könyvtár) bemutatása: Riboszóma bemutatás Fág bemutatás Sejtes (bakt., élesztő) bemutatás Bemutatási display technikák jellemzői 2. szelekció fenotípus alapján (kötés erősség, fluoreszcencia, stb.) 1. bemutató rendszer természetes alkotójához fuzionált mutáns variánsok

29 Riboszóma bemutatás Reverz transzkripció + PCR DNS DNS könyvtár mrns Transzkripció (T7 pol) mrns mrns könyvtár rögzített célmolekula mrns izolálás Szelekció (affinitás) kérdéses fehérje linker peptid mrns riboszóma Transzláció nincs STOP, nem disszociál Fehérje-Riboszóma-mRNS komplex

30 m13 fág bemutatás m13 bakteriofág bemutatásra használt fehérjék méret (aa) méret (kda) db/virion alapján P3 P6 P8 P7 P9 valencia: hány db bemutatott fehérje/ peptid van egy víruson aviditás: a több 1000 gyenge kötés eredményezhet erős affinitású fenotípust

31 m13 fág bemutatás A táplevesben az összes variánst bemutató fágklón megjelenik emésztett fágmid (pbluescript) mutáns variánsok (ld.fent) fág burokfehérje (P3, P6, P8) + linker peptid + kérdéses fehérje + + ligálás fágtermelés transzformálás mutáns DNS könyvtár

32 m13 fág bemutatás fág burokfehérje (P3, P6, P8) kérdéses fehérje rögzített kötőpartner szelekció Y PGA F TVIC + szelekciós ciklusok (affinitás, aviditás,valencia) mutáns azonosítás fág/dns izolálás szekvenálás + fágtermelés kötő fágok izolálása és transzformálása

33 Sejtes bemutatás gén -expr. Sejtfelszínen megjelenik a fuzionált fehérjénk (akár több 10,000/sejt) kérdéses fehérje inkubálás fluorescencen jelölt partnerrel jelölt partnerfehérje másik partnerfehérje másféle jellel

34 Sejtes bemutatás Fluoreszcencia alapú szortírozás (FACS) 1. Van-e fluoreszcencia?

35 Sejtes bemutatás Fluoreszcencia alapú szortírozás (FACS) 2. Jelintenzitás alapján (arányos a kötés erősségével)

36 Sejtes bemutatás Fluoreszcencia alapú szortírozás (FACS) 3. Keresztreakciók kimutatása (pl. ellenanyagok esetén)

37 Sejtes bemutatás + nanocsepp szortírozás enzimaktivitás alapján bemutatott enzim Agresti et al 2010 PNAS alapján sejt+szubsztrát sejt 1 sejt/csepp szubsztrát termék élesztő mutáns könyvtár

38 nanocsepp szortírozás Kintses et al 2010 Chem Biol Kintses et al 2010 Chem Biol csepp gyártás Agresti et al 2010 PNAS Kintses et al 2010 Chem Biol Kintses et al 2010 Chem Biol

39 nanocsepp szortírozás Kintses et al 2010 Chem Biol

40 nanocsepp szortírozás Agresti et al 2010 PNAS