Az Ig génátrendeződés

Átírás

1 Az Ig génátrendeződés Háromféle változás játszódik le a molekula szerkezetét tekintve: B sejtek fejlődése alatt: VDJ átrendeződés (rekombináció) IgH izotípusváltás rekombináció (CSR) Szomatikus hipermutáció (SM)

2 Véletlenszerű- e a génátrendeződés? The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984 Niels K. Jerne, Georges J.F. Köhler, César Milstein Niels Jerne: primer repertoár saját antigénekre korlátozott, ezt követi az antigén által indukált szelekció A génszegmentek véletlenszerű átrendeződése Az embrionális génátrendeződés genetikailag korlátozott, nem véletlenszerű, (pl. bizonyos Vb gének nagyobb gyakorisággal, mint mások, 12/23 RSS-rekombináz kölcsönhatási preferenciák) Hatékony szelekció limitált diverzitás Széles felismerési repertoár maximális diverzitás

3 Antigén felismerő receptorok sokfélesége limitált kódoló DNS?? Aminosav analízis: Ig molekula N terminális része sokféle, C terminális szekvencia azonos Egy gén egy polipeptid?? Deyer és Benett 1965: 2 gén: variábilis és konstans Niels Jerne: 1984 Nobel Díj: "for theories concerning the specificity in development and control of the immune system Susumu Tonegawa 1987 Nobel Díj "for his discovery of the genetic principle for generation of antibody diversity Az embrionális, vagy nem limfoid szövetből nyert Ig gének szerkezete eltér az ellenanyagot termelő tumor sejtekben (myeloma) található Ig gének szerkezetétől.

4 Embrionális (germline) DNS Szomatikus rekombináció D-J átrendeződés Szomatikus rekombináció V-J vagy V-DJ átrendeződés Transzkripció Elsődleges RNS átirat Splicing mrns Transzláció Polipeptid lánc Könnyű lánc Figure 4-2 Nehéz lánc Egy klónra jellemző repertoár- egyedi V-D-J rekombináció

5 Emberi Ig könnyű és nehéz lánc lókuszainak embrionális szerveződése a genomban L: leader peptid, a fehérje irányítása (extracelluláris fehérje) 3 külön lókusz, 2, ill. 3 génszegmens több kópiában, majd a konstans doméneket kódoló gének, H lánc: 9 C gén, ezeken belül 5 vagy 6 exon

6 DJ szegmensek: H lánc, J szegmensek: L lánc V szegmensek

7

8 Minden rekombinálódó V, D és J génszegmentumot nem kódoló régiók határolnak: konzervált heptamer és nonamer szekvenciák csatlakoznak a kódoló szekvenciákhoz, ezek között 23, vagy 12 nukleotid hosszú nem konzervált szekvencia (spacer). Szerepe: RAG hozzáférés bitosítása. Rekombinációs szignál szekvencia (RSS), ezt ismerik fel és ehhez kötődnek a RAG1 és RAG2 fehérjék RAG gének csak a fejlődő limfocitákban fejeződnek ki

9 A könnyűlánc V és J génszegmenseinek rekombinációja 4 lépésben 1. Szinapszis A RAG1-RAG2 fehérje komplex kötődik a 12 és a 23 bp spacer-res RSS-hez Újabb fehérjék (Ku, DNS függő protein kinázok) csatlakoznak a hajtűhöz és az elhasított RSS végekhez RAG1:RAG2 RAG1:RAG2 A fehérjekomplexek kötődnek egymáshoz, közelitve a szegmenseket A DNS hajtűk kinyílnak, a TdT újabb nukleotidokat ad a végekhez, illetve az exonukleázok eltávolítanak nukleotidokat 3. Kódoló végek módosítása 2. Dupla szálhasítás A DNS elhasad, a gén szegmensek végén hajtű struktúra jön létre RAG: rekombinációt aktiváló enzim komplex TdT: terminális deoxinukleotidil transzfeáz A DNS ligáz összekapcsolja a génszegmensek végeit Kódoló vég Szignál vég 4. Csatlakozás (NHJ: Nonhomolog end joining)

10

11 A VDJ rekombináció lépései: 1. Rag1/Rag2: VDJ rekombináz. Rag2: más fehérjékhez kapcsol 1 Génszegmensek megfelelő helyzetben tartása. 2. Rag1: hasítás egyik szálon szabad 3 OH másik szál, kovalens kötés hajtű Szignál vég: blunt end KU70, KU80 DNS-PK kötődése, aktiválja Artemis endonuleázt hajtű felnyílik (DNS-PK hibás SCID-ben) 4 4. TdT, DNS ligáz IV, kódoló végek csatlakozása

12 Hogyan befolyásolja a Rag mutációja a kódoló és szignál végek kapcsolódását? Rag hiányában sem B sem T sejtek nem fejlődnek ki. Csak B és T sejtekben fejeződik ki és csak bizonyos fejlődési fázisban! Csak Go és G1 fázisban, osztódó sejtben nincs Rag!

13 Figure 4-8 A RAG komplex kötődik és hasítja az egyik DNS szálat a kódoló és a heptamer szekvencia között hajtűket eredményezve A DNS szálak párosodása A hajtűk kinyílása palindrom P- nukleotidokat eredményez A páratlan nukleotidokat elhasítja az exonukleáz Az üres helyek feltöltése után a kódoló végeket csatlakoztatja a DNS ligáz Újabb nukleotidok beépülése TdT közvetítésével N: nem templát alapján hozzáadott nukleotid

14 Az Ig gének átrendeződésének lépései, sorrendje Az érett, naív B sejtek felszínén azonos specificitású migm és migd jelenik meg IgM IgD B sejt A RAG gének kiütése -> limfocita fejlődés megáll, súlyos kombinált immunhiány (severe combined immunodefficiency): SCID fenotípus

15 Allél exklúzió

16 Szomatikus hipermutáció - további variabilitás Elszórt mutációk a V régióban Figure nap nap További mutációk felhalmozódása a V régióban Negatív szelekció A legjobb antigénkötő, legtöbb mutációt tartalmazó B sejtek fejlődnek tovább > affinitás érés Activation induced cytidine deaminase: AID-hiánya gátolja a szomatikus hipermutációt

17 A immunoglobulin repertoár sokféleségének kialalkulása négy folyamat eredménye: Kombinatórikus diverzitás - könnyű és nehéz láncok V régiói, több kópia minden génszegmensből, ezek különböző kombinációi Génszegmensek kapcsolódása által meghatározott sokféleség (VJ, VDJ) Kombinatórikus diverzitás - a lehetséges H és L lánc párok kialakulása Szomatikus hipermutáció az átrendeződött V régió génekben - negatív és pozitív szelekció, a legjobban kötődő receptorral rendelkező sejtek kiválogatódása ~10 11 lehetséges repertoár, de valójában ~10 9 klón

18 IgM és IgD Alternatív splicing

19 Ig nehézlánc izotípusváltás

20 Izotípus váltás: rekombináció specifikus switch szignálok között Figure 4-21

21 Izotípusváltás (Class-switch recombination - CSR) rekombináció/deléció mechanizmusával történik S régió: GAGCT, CSR: GGGGT CSR nem tartalmaz konszenzus szekvenciát mint RSS, GC-ben van, de kivüle is,

22 Izotípus váltás (class switch recombination) Minden CH gén 5 végén van switch régió (S), kivéve Cd- az IgD alternatív splicing-gal jön létre S régió: repetitív szekvenciák transzkripció indul 5 S régió-tól indul, fúzió 3 S régióval, fúzió az intronban- nem befolyásolja a transzláció leolvasási keretét Activation induced cytosine deamináz (AID) szükséges, (RAG nem) AID: citidin specifikus mutátor Csak B sejtekben van AID, AID hiányában (egér KO) nincs CSR! In vivo: T sejtektől függő mechanizmus: CD40-CD40 ligandum kölcsönhatás In vitro: LPS, citokinek hatására indukálható Szabályozás: transzkripciós faktorok-i régió promoter kapcsolat

23 Az izotípusváltás mechanizmusa Nehézlánc gének IgM-et expresszáló sejtben CD40L, citokinek Switch-rekombináció az S régióknál (Kettős szálú DNS törés) deléció Nehéz lánc gének IgA-t expresszáló sejtben

24 A kettősszálú DNS törés létrejöttének mechanizmusa a switch régiókban Switch-régió csira-vonal átirat Kódoló szál R-hurok Az AID C / U átalakulást indukál Uracil glycosylase (UNG), APE: AP endonukleáz APE I: hasítja a bázishiányos helyet UNG: bázishiányt hoz létre Kettős szálú DNS törés a switch régióban

25 AZ AID-indukált DNS törés, mutáció és transzlokáció izotípusváltás hibajavítás mutáció transzlokáció Uracil glycosylase (UNG), APE: AP endonukleáz

26 Az AID szerepe az SHM és az izotípusváltás során Szomatikus hipermutáció Izotípusváltás Uracil glycosylase (UNG, green wedge), base excision repair (BER), mismatch repair proteins (MSH2/6)

27 A V-gének szomatikus mutációja H lánc V régiók L lánc V régiók 7. nap primer 14. nap primer Másodlagos Harmadlagos Affinitás érés: szomatikus mutációk -- > szelekció

28 A membránon kifejezett és a szekretálódó m lánc létrejöttének mechanizmusa Primer RNS átirat Poliadenilációs helyek Nyugvó B-sejt B-sejt differenciálódás transmembrán