Kappelmayer János. Malignus hematológiai megbetegedések molekuláris háttere. MOLSZE IX. Nagygyűlése. Bük, 2005 szeptember

Átírás

1 Kappelmayer János Malignus hematológiai megbetegedések molekuláris háttere MOLSZE IX. Nagygyűlése Bük, 2005 szeptember

2 Laboratóriumi vizsgálatok hematológiai malignómákban Általános laboratóriumi vizsgálatok A hematológiai betegség fenotípusának jellemzése: minőségi vérkép (periféria, csontvelő - MGG festés) hematológiai automaták adatai? citokémiai reakciók immunfenotipizálás A hematológiai malignoma genotípusának jellemzése: citogenetika/fish (kromoszóma rendellenességek) Ig/TcR génátrendeződések vizsgálata mol. biol. módszerekkel transzlokációk kimutatása mol. biol. módszerekkel MRD kimutatása ploiditás vizsgálat

3 A B

4 Citokémiai reakció molekuláris diagnosztika? MPO PAS

5 LUC (large unstained cell) analízis FVS: 204 G/L FVS: 1.2 G/L LUC: 56% LUC: 22%

6 Antigén kimutatás Fluorokróm 494 nm 517 nm anticd61 Ab CD61

7 PMN érés markerei Monocyta érés markerei

8

9 Chronic Lymphocytic Leukemia Leukemic cells: pos for CD5 and CD19 CD19 CD5

10

11

12 AL 4 color analízis EWGCCA AL task force 2x4 felszíni marker 2x4 felszíni+ic marker

13 Fenotípus PSGL-1 kópiaszám Receptor kópiaszám PMN MO AML-blast Monoblast

14 Fenotípus Diploid peak Hyperdiploid peak DNS tartalom

15 Multi Drug Rezisztencia (MDR) vizsgálata

16 Genetikai vizsgálatok jelentősége haematológiai malignómákban Klonalitás igazolása (poliklonális és/vagy monoklonális sejtpopulációk jelenlétének igazolása) Diagnózis felállítása - tumor specifikus genetikai eltérések kimutatása (Philadelphia kromoszóma - CGL) Minimális reziduális betegség (MRD) kimutatása, monitorozás (terápiát követően a malignus sejtek reziduális klónjának jelenléte, mely standard patológiai és radiológiai módszerekkel nem mutatható ki) Prognózis becslése (specifikus gén mutáció jelenléte egy adott tumorban rossz vagy jó prognózissal jár együtt) Terápiára való reagálás megítélése (egyes génmutációk jelenléte bizonyos kezelésekkel szembeni rezisztenciára utal)

17 A leggyakoribb kromoszóma transzlokációk haematológiai megbetegedésekben Transzlokáció B-ALL T-ALL AML gyerek felnőtt gyerek felnőtt gyerek felnőtt t(1;19)(q23;p13) 5-8% 3-4% t(4;11)(q21;q23) 3-5% 3-4% <1% <1% t(9;22)(q34;q11) 3-5% 15-30% <1% <1% <1% <1% t(9;22)(q34;q11) 1-2% 10-15% <1% <1% <1% <1% t(12;21)(p13;q22) 25-30% <2% del(1)(p32;p32) % 10% t(8;21)(q22;q22) % 6-8% t(15;17)(q22;q21) % 5-15% inv(16)(p13;q22) % 5-6%

18 Genetikai elváltozások prognosztikai jelentősége t(1;19) - pre-b-all, rossz prognózis (magas fvs szám és LDH, CNS érintettség) t(4;11) -felnőtt ALL esetében rossz prognózis t(8;22) - AML-M2, jó prognózis, jó válasz citozin arabinozidra t(9;22) -felnőtt ALL esetében rossz prognózis (komplett remisszió aránya alacsonyabb, betegségmentes túlélés ideje csökken) t(12;21) - gyerekkori ALL, jó prognózis (sokkal később jelentkező relapszus) inv(16) - AML-M4(Eo), jó prognózis t(17;19) - prob-all, rossz prognózis (gyakran társul DIC-kel)

19 A bcr/abl átrendeződés kromoszómális mechanizmusa

20 A bcr/abl expresszió változása Gleevec terápia során Ratio BCR-ABL/G6PDH % (n = 65) negative p < Complete response n = 14 Partial response n = 18 Minor response n = 10 Nonresponse n = 23 Cytogenetics

21 Crossing Point (ciklusszám) Minták Standard görbe: G6PDH A kvantitálás elve t (9;22) G6PDH n n n log (kópiaszám) log (F2/F1) log (F2/F1)

22 Saját standard görbe 2130 fg 213,0 fg 2,13 fg 21,3 fg 213 fg 2130 fg

23 A bcr/abl expresszió változása Gleevec terápia során

24 Freuhauf S. et al. J. Leuk Biol. 2003, 73: Imatinib restores expression of CD62L in BCR-ABL positives cells

25 FLT3 ITD/LM a duplikált szekvencia a 14. exont érinti ritkán 14. intront és 15. exont is (korábban 11., 12. exon) is érinti (JM domént és TK1 domént kódoló régió)

26 FLT3 D835/TKD mutáció leggyakoribbak a pontmutációk a 835 kodonban (834, 836 kodon is érintett lehet) inszerció és deléció is előfordulhat

27 FLT3 ITD Prognosztikai jelentőség egységes álláspont: FLT3 ITD+ nagyobb a relapszus esélye gyakoribb terápia rezisztencia rövidebb DFS (disease free survival), EFS (event free survival) és OS (overall survival) mutáns/vad típusú allél aránya fontos vad típusú allél elvesztése különösen rossz prognózist jelez

28 FLT3 mutációk kimutatása hagyományos PCR reakciót használtunk, 11F és 12R primerekkel a vad típusú allél jelenlétére 329 bp nagyságú PCR termék utal nagyobb PCR termék ITD jelenlétére utal a vad típusú allél el is veszhet vad és a mutáns allél/ok intenzitásbeli különbségei is fontosak jobb a csontvelői minta vizsgálata

29 FLT3 ITD+ esetek MW 50 bp K víz ITD 329 bp

30 Vizsgált betegek Beteg Dg. FLT3% kóros sejtek% ITD D my+ ALL AML M4 (MDS) AML M AML M AML v. CGL AML M AML M AML M AML M my+ call

31 Közreműködők Dr. Antal Szalmás Péter Dr. Hevessy Zsuzsa Dr. Koczok Katalin Kissné Sziráki Valéria Győrffiné Veszprémi Anikó