Molekuláris biológiai technikák

Átírás

1 Molekuláris biológiai technikák Wunderlich Lívius A Molekuláris biológiai technikák jegyzet igyekszik átfogó képet adni a jövő tudományának, a molekuláris biológiának a módszertanáról. A technikák elméleti hátterének ismertetése mellett a könyv gyakran részletezi a gyakorlati kivitelezéshez szükséges tudnivalókat is. A jegyzet horizontálisan és vertikálisan is építkezik: a látszólag egymástól teljesen különálló, alapvető módszerek ismertetése után, azok szintézisével több, egymásra épülő komplex technikát mutat be. Néhány példa a komplexebb technikákra: DNS-szekvenálás, klónozás, in vitro mutagenezis, génexpresszió vizsgálata, génkiütés és transzgenikus élőlények előállítása, fehérjetermeltetés, fehérje-interakciók vizsgálata. A technikák bemutatása nem öncélú; elsősorban a komplexebb módszerek leírása esetén hangsúlyosak a kutatási vagy ipari felhasználásukra való utalások. Kulcsszavak: vektorok, klónozás, génkönyvtár, PCR, hibridizáció, restrikciós endonukleázok, szekvenálás, génkiütés, transzgénikus élőlények, in vitro mutagenezis, génexpresszió, géncsendesítés, fehérjeexpresszió, immunoblot, fehérje interakciók Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Semmelweis Egyetem Typotex Kiadó 2014

2 COPYRIGHT: , Wunderlich Lívius, Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A szerző nevének feltüntetése mellett nem kereskedelmi céllal szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de nem módosítható. Szakmai lektor: Zimányiné Ratkai Tünde, Stefán Gábor ISBN Készült a Typotex Kiadó gondozásában Felelős vezető: Votisky Zsuzsa Készült a TÁMOP-4.1.2/A/1-11/ számú, Konzorcium a biotechnológia és bioinformatika aktív tanulásáért című projekt keretében.

3 Tartalomjegyzék Előszó Történeti áttekintés A molekuláris biológia története A molekuláris biológia objektumai, összefüggései, kísérleti tervezés A molekuláris biológia objektumai Szénhidrátok Lipidek Fehérjék Nukleotidok, nukleinsavak A molekuláris biológia összefüggései Sejtek Makromolekulák keletkezése Határtudományok Kísérleti tervezés Elválasztási technikák Szűrés, koncentrálás Centrifugálás Kromatográfia Kizárásos kromatográfia Adszorpciós kromatográfia Megoszlási kromatográfia Ioncserés kromatográfia Affinitás kromatográfia Gélelektroforézis Agaróz gélelektroforézis Pulzáló erőterű gélelektroforézis Poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE) Kétdimenziós (2D) gélelektroforézis Kapilláris elektroforézis Sejttenyészetek fenntartása, manipulálása Baktériumok Baktériumok tenyésztése Baktériumok transzformálása Élesztőgombák Wunderlich Lívius

4 4 Molekuláris biológiai technikák Élesztőgomba tenyésztése Élesztő transzformálása Sejtkultúra állatokból Állati sejtek tenyésztése Állati sejtek transzfektálása Növényi sejtkultúra Transzgének növényi sejtekbe juttatása Vírusok DNS-, RNS-, fehérjeizolálási technikák Nukleinsavak izolálása Genomi DNS-izolálás Plazmid izolálás DNS-fragment izolálása RNS-izolálás Fehérjék izolálása Nukleinsav-módosító enzimek Polimerázok DNS-polimeráz RNS-polimeráz Nukleázok Dezoxiribonukleázok Ribonukleázok Ligázok Másodlagos DNS-módosító enzimek Alkalikus foszfatázok Polinukleotid-kináz Metilázok Térszerkezet-módosító enzimek Helikázok Topoizomerázok Polimeráz láncreakció A PCR elve Exponenciális szaporodás A reakcióelegy összetétele Primerek tervezése A PCR alkalmazási területei, feltételei Hőstabil polimerázok A PCR-reakció specifitása Extra szakaszok beépítése Pontmutációk vizsgálata hagyományos PCR-rel Degenerált PCR, multiplex PCR Kvantitatív mérések PCR-rel Wunderlich Lívius

5 Tartalomjegyzék Kvantitatív mérések real-time PCR-rel Pontmutáció kimutatása real-time PCR-rel Szekvenciameghatározás DNS-szekvenálás A Sanger-féle lánctermináción alapuló DNS-szekvenálás Új generációs szekvenálás Fehérjeszekvenálás Szekvenálás Edman-degradációval Szekvenálás tömegspektrométerrel Hibridizációs technikák Southern-blot Northern blot Dot blot és slot blot Nuclease-protection assay DNS-chip (DNA-microarray) Kolónia hibridizáció Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) Vektorok Plazmidok pbr Antibiotikumok, rezisztencia Bakteriofágok λ-fág M13 fág Kék-fehér szelekció puc18/ Vektorok in vitro transzkripcióhoz Fágemid vektorok pbluescript Kozmidok Mesterséges kromoszómák YAC BAC HAC Virális vektorok Klónozás, nukleinsav-könyvtárak Klónozás restrikciós enzimekkel Ligáz nélküli klónozások USER technológia Háromnukleotidos technológia TOPO-klónozás Wunderlich Lívius

6 6 Molekuláris biológiai technikák Rekombinációs klónozás Genomi könyvtárak cdns könyvtárak Az első szál szintézise A második szál szintézise RACE Expressziós rendszerek Expressziós vektorok Expresszió baktériumsejtekben Fehérjetermelés élesztőben Fehérjeexpresszió bakulovírus segítségével Expresszió emlőssejt-tenyészetekben Expresszió állatokban Sejtmentes fehérjeexpresszió Mutagenezis, géncsendesítés Mutagenezis Irányított pontmutációk generálása Random mutációk készítése PCR-rel Deléciók készítése Génkiütött állatok Géncsendesítés A géncsendesítés elmélete Géncsendesítési módszerek Fehérjék kimutatása Antitestek termeltetése Poliklonális antitestek készítése Monoklonális antitestek készítése Másodlagos antitestek Aptamerek Western blot ELISA Fehérje interakciók In vitro kapcsolatok kimutatása Kapcsolatok kimutatása fúziós fehérjével Immunprecipitáció Ko-immunprecipitáció Gél-shift Fág-display technika Kromatin-immunprecipitáció In vivo kapcsolatok kimutatása Élesztő két-hibrid rendszerek Wunderlich Lívius

7 Tartalomjegyzék Élesztő egy-hibrid rendszerek Élesztő három-hibrid rendszer Felhasznált irodalom Wunderlich Lívius