I. Strukturális Genomika II. Funkcionális Genomika III. Integratív Genomika

Átírás

1 I. Strukturális Genomika II. Funkcionális Genomika III. Integratív Genomika

2 A genomika főbb területei Strukturális (szerkezeti ) genomika Funkcionális (működési) genomika Transzkriptomika Proteomika Integratív genomika Komparatív (összehasonlító) genomika Metabolomika In silico genomika Farmakogenomika Pszichogenomika

3 Strukturális genomika DNS szekvenálás

4 DNS szekvenálás A Sanger módszer Templát: 3 Primer : 5 CCGGTAGCAACT 5 GG 3 datp + ddatp dctp dgtp dttp datp dctp + ddctp dgtp dttp datp dctp dgtp + ddgtp dttp datp dctp dgtp dttp + ddttp GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCG GGCCATCGTTG GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT n A C G T A3 G T T G C T A C C5 A templát DNS-sel komplementer szekvencia

5 Automatizált Sanger-módszer

6 Nagy-volumenű, újgenerációs szekvenálási módszerek MULTIPLEX DNS SZEKVENÁLÁS Hibridizáció alapú SBH DNS szintézisen alapuló Piroszekvenálás tsms SMRT Nanopórusos technikák Második generációs szekvenátorok Harmadik generációs szekvenátorok

7 Hibridizáláson alapuló szekvenálás (SBH) Ismert DNS szekvenciához képest kis eltérések kimutatására SNP-analízis Microarray alapú Nem enzimatikus

8 DNS szintézisen alapuló szekvenálási módszerek Közös jellemzőik DNS polimeráz (enzimatikus) Fénydetekció Parallel, multiplex módszerek Piroszekvenálás tsms: valódi egymolekulás szekvenálás SMRT: egymolekulás real-time technológia

9 Piroszekvenálás (DNS) n + dntp DNS polimeráz (DNS) n+1 + PP i szulfuriláz luciferáz APS + PP i ATP fény dntp ATP apiráz dndp + dnmp + P i ADP + AMP + P i T/G polimorfizmus pirogramja

10 Valódi egymolekulás szekvenálás tsms bp-os DNS szálak szekvenálása 100 milliós nagyságrendben, egyidőben Naponta több milliárd bázis megszekvenálása

11 Egymolekulás real-time technológia SMRT 2013: a 100$-os genom 15 perc alatt

12 Nanopórusos szekvenálás ultragyors (többszáz kb (kilobázis) megszekvenálása néhány perc alatt) olcsó (a teljes genom megszekvenálásának költségeit kb 4 nagyságrenddel csökkenti) Nem enzimatikus Nem fényt, hanem áramerősséget detektál

13 Nanopórusos szekvenálás I. Exonukleáz szekvenálás Jelölésmentes Nem szintézis alapú Molekulánkénti szekvenálás Áramerősség detekció d=1nm Oxford Nanopore Technologies α-hemolizin nanopórus α-hemolizin nanopórus + ciklodextrin

14 Nanopórusos szekvenálás II.

15 A DNS szekvencia ismeretében lehetővé válik genetikai hátterű betegségekre való hajlam kimutatása fertőzések diagnosztikája (kórokozók azonosítása) rokonsági fok meghatározására (apasági vizsgálatok ) személyazonosítás (bűnüldözés) génváltozatok összehasonlítása törzsfák készítése biológiai folyamatok kutatása betegségek genetikai hátterének elemzése új terápiás lehetőségek felfedezése SZEMÉLYRE SZABOTT GYÓGYMÓDOK

16 Kromoszóma séta 1. lépés A B C D E F G H Próba: A1 klónból származó inszert Pozitív jelek: A1, E7, F6 klónok E7 A1 F6 2. lépés A B C D E F G H Próba:F6 klónból származó inszert Pozitív jelek: A1, B12, F6 klónok E7 A1 F6 B12

17 Kromoszóma séta PCR-ral 1. fragment primerek Klónok sorszáma Eredmény: az 1. és 14. klónok átfednek

18

19

20

21 Strukturális genomika GENOM - szekvencia megállapítása - mutációk felderítése - egy nukleotid eltérések (SNP) - deléció inszerció - metilációs mintázat DNS chip-ek CITOPLAZMA DNS Funkcionális genomika TRANSZKRIPTOM - gén expresszió megváltozása, - splice-variánsok kimutatása - szabályozó RNS-ek (mirns) kimutatása transzkripció SEJTMAG pre-mrns protein transzláció mrns riboszóma trns Fehérje chip-ek PROTEOM - kifejeződés - módosítások - kölcsönhatások

22 A DNS chip (microarray) DNS-chipen több ezer gén aktivitását nyomon tudjuk követni. Minden pont egy génre jellemző szekvenciát tartalmaz. A biológiai mintából kinyert, fluoreszcensen megjelölt RNS a gén aktivitásával arányos fluoreszcens jelet ad. -Működés alapja: DNS-DNS vagy DNS-RNS hibridizáció - Nagyszámú gén expressziós mintázatának egyidejű meghatározására szolgál. Valójában fordított Southern blot: az ismert próbák kovalens kötéssel rögzítettek az üvegfelületen. - Egy chip 6-10,000 gén vizsgálatára alkalmas. -cdns chipek -oligonukleotid chip-ek

23 1. Chip elkészítése: - nyomtatás kontrol 2. Szövetminták begyűjtése kezelt 3. RNS tisztítás 4. Reverz transzkripció (fluoreszcens jelölés) 5. Hibridizálás 6. Detektálás

24

25 Chipek felhasználása Fertőzések felismerése mikroorganizmusok azonosítása Rákdiagnosztika diffúz nagy B-sejtes limfóma (DLBLC) típusok megkülönbözetése alkalmas kezelés SNP-k detektálása mirns microarray különböző ráktípusokban megfigyelhető, hogy bizonyos mirns-ek alul/túlexpresszálódnak

26 Chipek felhasználása mikroorganizmusok azonosítása

27 Chipek felhasználása - rákdiagnosztika DLBLC: diffúz nagy B-sejtes limfóma (nem-hodgkin-limfóma) 2 típus: - aktivált B-sejtszerű - GC-szerű Markergének (sejttípus azonosítás) Cél: betegek génexpresszió alapján való besorolása megfelelő kezelés

28 SNP-k & fenotípus SNP Single Nucleotide Polymorphism Biológiai markerek Association study SNP-profilok megállapítása

29 SNP-k & fenotípus gén ApoE Nos2 Betegség, vagy egyéb fenotípusos jelleg Alzheimer-kór NO, malária ellen jobban ellenálló BRCA1 Alternatív splicing bizonyos ráktípusok esélye nő Mc1R Pheomelanin, eumelanin, vörös haj + midazolam rezisztencia

30 ApoE & Alzheimer-kór Alzheimer-kór: poligénes Apolipoprotein E 2 SNP 3 allél: E2, E3, E4 1-1 AS különbség

31 Nos2 Plasmodium fajok okozzák Anopheles szúnyog a vektor Nos2 gén promóterében T -> C csere Több NO a vérben - > csökken a malária esélye Kenya&Tanzánia 25%

32 BRCA1 BRCA1 mutáció esetén 85% esély a mellrák kialakulására ESE: exonic splicing enhancher->snp->exon nem épül be ESS: exonoc splicing silencer -> SNP -> exon beépül, nem kellene Változások: fehérje struktúrájában és funkciójában

33 Mc1R melanocortin 1 receptor

34 Fehérje chip

35 Fehérje chip Jelölési stratégiák 1. Direkt jelölés 2. Szendvics módszer

36 WGT Whole Genome Tiling új típusú microarray gének transzkripciójának vizsgálata alternatív-splicing analízise transzkripciós faktor kötő helyek, DNS metilációs helyek feltérképezése polimorfizmusok vizsgálata genotipizálás PRÓBÁK (25-60 bp) szabályosan elrendezett átfedő szeparált step : az egymást követő próbák centrumainak távolsága

37 WGT Whole Genome Tiling A próbák szintézise: oligonukleotid, v. PCR termék spot direkt az üveglap felületére a próbák fluoreszcensen jelölt crns-hez, vagy cdns-hez kötnek Tiling próbák fluoreszcencia intenzitás próba intenzitása transzkripciós aktivitás 30 kb-os régió

38 PCR - ismétlés 4.ciklus 1 kiindulási kópia Target DNS 2.ciklus 1.ciklus 3.ciklus 35 PCR ciklus Ideális reakció: 2 n kópia/ciklus Exponenciális növekedés 2 35 =34 milliárd kópia

39 PCR DNS-templát tartalmazza a DNS-szakasz amplifikálandó régióját 2 primer meghatározza az amplifikálandó szakasz elejét és végét DNS-polimeráz lemásolja az amplifikálandó szakaszt Nukleotidok amelyekből a DNS-polimeráz felépíti az új DNS-t Puffer biztosítja az enzim számára megfelelő kémiai környezetet

40 Real-Time-PCR alapja: fluoreszcencia detektálása a PCR reakció mindenegyes ciklusában REAL TIME A fluoreszcencia intenzitása arányos a PCR termék mennyiségével a reakció végén nincs szükség gél-alapú kiértékelésre analízis: szoftver alapú

41 Real-Time vs. End Point

42 RT2-PCR (reverz transzkripción alapuló Real-Time PCR) mrns expresszió vizsgálata lépések: RNS tisztítás (totál RNS, mrns; sejtből, szövetből) reverz transzkripció (RNS cdns) Real-Time PCR Fogalmak Real-Time PCR = qpcr (quantitative) RT2-PCR = qrt-pcr RT-PCR = reverz transzkripciót követő PCR

43 Detektálás Nem-specifikus SYBR Green Specifikus TaqMan próba

44 SYBR Green interkalálódó molekula (~ etidium-bromid) dsdns-hez köt (kis árok) monokróm fénnyel indukálva 530nm hullámhosszú fényt emittál a fluoreszcens jel nagysága arányos a PCR során keletkező DNS mennyiségével ssdns dsdns

45 TaqMan próba bp hosszú, módosított oligonukleotid az amplifikálandó régió középső szakaszával komplementer 5 vég: fluoreszcens festék molekulával jelölt reporter (R) 3 vég: a reporter fluoreszcenciáját kioltó, nem fluoreszcens quencher (NFQ) molekulát tartalmaz a próba intakt állapotában a kioltó molekula elnyeli a reporter fluoreszcens emisszióját energiaátadás: fluoreszcens rezonancia energia transzferrel (FRET) a két molekula fizikai közelségén alapul

46 amplifikációhoz három oligonukleotid egyidejű bekötődése szükséges nagyfokú specificitás a termék szintézisének megkezdése után a DNS polimeráz (P) 5 -exonukleáz aktivitásának megfelelően hasítja a próbát a reporter molekula távolabb kerül a quencher molekulától a reporter molekula egyre növekvő fluoreszcens emissziójának detekciója arányos a termék exponenciálisan növekvő mennyiségével, (a minta kiindulási RNS tartalmával)

47 Analízis I. (melting curve) primer dimer specifikus termék

48 log Analízis II. (Ct: threshold cycle) plató threshold (küszöb) exponenciális fázis minták összehasonlítása az exponenciális fázisban háttér fluoreszcencia(zaj)

49 Real-Time PCR a gyakorlatban - SNP detektálás - allél-specifikus Real-Time PCR TaqMan próbával az egyik primer 3 - vége az SNP-re kell, hogy essen a DNS szintézis, azaz a PCR reakció működik, ha a használt primer 3 -vége az SNP-vel komplementer ebben az esetben detektálható a reporter fluoreszcenciája

50 fluoreszcencia Real-Time PCR a gyakorlatban - expresszió vizsgálat - kezelt-kezeletlen egészséges-beteg érzékenyebb a DNS chipeknél kevesebb minta egyidejű analízise Relatív kópiaszám meghatározás: Ct tumor ciklusszám

51 Összehasonlító genomika

52 MYH16 a gondolat szobája

53 FOXP2 a beszéd génje

54 HAR Human accelerated region

55 Genom és komplexitás Mus musculus Fugu sp. FAJ GÉNEK SZÁMA A. thaliana C. elegans F. rubripes M. musculus H. sapiens sapiens

56 Humán genom J. Craig Venter, a yachtja és a genom szekvenciája A böngészhető szekvencia külön file-ként feltöltve

57 Eukarióta genomok Sejtmagi, mitokondriális (és kloroplasztisz) genom Ismétlődések, mozgó genetikai elemek, stb.