Proteomika Peptid szekvenálás. Dr. Csősz Éva Debreceni Egyetem ÁOK Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Proteomika Szolgáltató Laboratórium

Átírás

1 Proteomika Peptid szekvenálás Dr. Csősz Éva Debreceni Egyetem ÁOK Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Proteomika Szolgáltató Laboratórium

2 Fókuszterületek Omikák, rendszerbiológia hipotézis vezérelt és hipotézismentes megközelítések Miért van szükség a proteomikára? Milyen jellegű információt tud adni a proteomika? A proteomika módszertana A proteomika eszköztára A proteomika szerepe a diagnosztikában

3 Környezeti változás/ Stimulus Sejt Válasz Patológiás reakció Környezeti változás/ Stimulus Válasz Környezeti hatások mesterséges módosítása ( pl. gyógyszer adása) Válasz karakterizálása ( metabolitok szintjének vizsgálata szérumban)

4 Hipotézis-vezérelt és hipotézis nélküli megközelítések Környezeti változás/ Stimulus Válasz Környezeti hatások mesterséges módosítása Hipotézis-vezérelt megközelítés Válasz karakterizálása Egy jól körülhatárolt kérdés Egy jól értelmezhető válasz

5 A vak ember és az elefánt...

6 Hipotézis-vezérelt és hipotézis nélküli megközelítések Környezeti változás/ Stimulus Válasz Környezeti hatások mesterséges módosítása Hipotézis-vezérelt megközelítés Válasz karakterizálása Egy jól körülhatárolt kérdés Egy jól értelmezhető válasz Előnye: Pontos információt nyújt Hátránya: Lassú nem látjuk a fától az erdőt nehézkes lehet az egész megértése

7 Hipotézis-vezérelt és hipotézis nélküli megközelítések Környezeti változás/ Stimulus Válasz Környezeti hatások mesterséges módosítása Válasz karakterizálása Hipotézismentes megközelítés Egy kérdés Nagy információ halmaz

8 Omikák... a cél az egész megértése...??

9 Hipotézis-vezérelt és hipotézis nélküli megközelítések Környezeti változás/ Stimulus Válasz Környezeti hatások mesterséges módosítása Válasz karakterizálása Hipotézismentes megközelítés Egy kérdés Nagy információ halmaz Erősség: Omikák nagy mennyiségű adattal dolgoznak speciális adatgyűjtési és adatfeldolgozási módszerek szükségesek, rendszerszintű információkat kaphatunk Probléma lehet: A kapott adatok megbízhatóságának biztosítása, az adatok értelmezése

10 Omikák... a cél az egész megértése...? Genomika/transzkriptomika Proteomika Lipidomika Glikomika Metabolomika Foszfoproteomika

11 Hipotézis-vezérelt és hipotézis nélküli megközelítések

12 Modell nélkül? All models are wrong, but some are useful." George Box statistician All models are wrong, and increasingly you can succeed without them." Peter Norvig, Google Együtt-változások vizsgálata ok-okozati összefüggések vizsgálata nélkül

13

14 Rendszerbiológiai megközelítés Különböző módon nyert információk közös rendszerben történő kezelése Probléma lehet a vizualizáció Milyen gének aktívak adott időpillanatban? Milyen fehérjék vannak jelen adott időpillanatban? Melyek a foszforilált fehérjék adott időpillanatban? Melyek a glikozilált fehérjék adott időpillanatban? Milyen lipidek vannak jelen adott időpillanatban? Milyen metabolitok/kismolekulák vannak jelen adott időpillanatban? Milyen a citokinek mennyisége az adott időpillanatban? Rétegekben ábrázoljuk Interakciós hálózatokban ábrázoljuk

16 Proteomika bevezető * Genom DNS RNS Transzkriptom Fehérje Proteom PROTEOM: Meghatározott sejtben, szövetben, vagy organizmusban adott körülmények között, egy adott időpillanatban kifejeződő fehérjék összessége. PROTEOMIKA: egy adott sejt, szövet, vagy organizmus proteomjának szisztematikus vizsgálata

17 Miért van szükség proteomikára? Azonos a genom, de különböző a proteom vörös vértestek izomsejtek A különböző fehérjék változatos megjelenést eredményeznek azonos genom mellett

18 Miért van szükség proteomikára? A fehérjék szerepe: Struktúrfehérjék pl. aktin, miozin Enzimek Receptorok Szabályozó funkció pl. DNS kötő fehérjék Információ hordozók citokinek, hormonok, lokális mediátorok Stb. A sejt effektorai a fehérjék

19 Miért van szükség proteomikára? A fehérjék vizsgálata összetettebb képet ad a sejt működéséről

20 Miért van szükség proteomikára? Hogyan tudunk változást elérni, szabályozást végrehajtani? 1. Fehérjék mennyiségét változtatjuk Gén szinten mrns szinten Transzláció szinten Fehérje degradáció szinten 2. Meglévő fehérjék aktivitását változtatjuk Kovalens módosítás nélkül Allosztérikus módosítás Fehérje-fehérje interakció révén Kovalens módosítással Reverzibilis Foszforiláció Acetiláció Metiláció Irreverzibilis Limitált proteolízis

21 Miért van szükség proteomikára? * Microarray vs. proteomikai elemzés Microarray adat Proteomikai adat A microarray adatok jelentős mennyiségű és minőségű információt szolgáltatnak a biológiai folyamatok megértéséhez Az adott időpillanatban éppen bekapcsolt gének vizsgálatát teszi lehetővé Jól használható az egyes gének expresszió változásának vizsgálatára De a transzkriptom és a proteom nem azonos

22 Miért van szükség proteomikára? Miért vizsgáljunk fehérjéket? kb mrna tranzkript/osztódó sejt 2,4 mrns kópia/sejt kb. 95 millió fehérje/osztódó sejt 3919 fehérje kópia/sejt Marguerat, 2012, Cell A fehérje változások nagyobb dinamikus tartományban történnek, mint az mrns változások A transzkriptóm zsugorodik a nyugalmi időszakban A fehérjék globális mennyisége nem változik, de a proteóm átalakul

23 Miért van szükség proteomikára? A különböző fehérjék változatos megjelenést eredményeznek azonos genom mellett A sejt effektorai a fehérjék A transzkriptom és a proteom nem azonos A fehérje változások nagyobb dinamikus tartományban történnek, mint az mrns változások Míg a transzkriptóm zsugorodik a nyugalmi időszakban, a fehérjék globális mennyisége nem változik, hanem a proteóm átalakul A fehérjék vizsgálata összetettebb képet ad a sejt működéséről

25 Fehérjék azonosítása Komplexben levő fehérjék és interakciós partnerek azonosítása

26 Fehérjék poszt-transzlációs módosításainak azonosítása, lokalizálása Glikogén Sokszor maga a fehérje jelenléte/hiánya nem ad elegendő információt a tényleges működésre vonatkozóan Glikogén foszforiláz Glükóz-1P

27 Fehérjék poszt-transzlációs módosításainak azonosítása, lokalizálása Fruktóz-6-foszfát Foszfofrukto-2 kináz Fruktóz-6-foszfát ATP ADP Pi PF2K F2,6Páz P Fruktóz-2,6-biszfoszfát Fruktóz-2,6-biszfoszfát Csak a fehérje jelenléte/hiánya nem ad elegendő információt a tényleges működésre vonatkozóan

28 Fehérjék bizonyos térszerkezet-változásainak azonosítása Sup35 transzlációs terminációs faktor Riboszóma komplexhez kapcsolódik, leállítja a transzlációt Prion forma a riboszóma nem érzékeli a stop kodont, a fehérjék hossza megnő és a funkciója is megváltozik

29 A fehérjék térszerkezet-változása gyökeresen megváltoztathatja a fehérje funkcióját Natív, endogén PrP c PrP sc interakciója endogén PrP c -vel Spontán PrP sc keletkezik PrP sc interakciója endogén PrP c -vel

30 Fehérje interakciós hálózatok felépítése Az egyes fehérjék tulajdonságai, funkciói, a szervezetben betöltött szerepei jobban értelmezhetők és megérthetők a fehérje hálózatok szintjén

31 Fehérjék relatív vagy abszolút mennyiségének meghatározása Dr. Crhistina Ludwig jóvoltából

32 Milyen jellegű információt tud adni a proteomika?

33 Milyen jellegű információt tud adni a proteomika? Fehérje azonosítása Fehérje lokalizációja Fehérje PTM meghatározása Fehérje szerkezeti adatok Fehérje-fehérje interakciók Mennyiségi információk

35 Fehérje elemzés vs. proteomika Fehérje elemzés egyetlen fehérje tanulmányozása: azonosítás, szerkezet és funkció meghatározás... top-down proteomika Proteomika a proteom vizsgálata bottom-up proteomika Top-down proteomika Bottom-up proteomika MS/MS analízis Fehérjék kinyerése Tripszines emésztés MS/MS analízis

36 Fehérje elemzés vs. proteomika

37 A proteomika módszertana Gél alapú módszerek Tömegspektrometriás módszerek Kétdimenziós gélelektroforézis Fehérjék emésztése Peptidek elválasztása és dúsítása kromatográfiás lépés Fehérjék emésztése Fehérje mintázat vizsgálata Tömegspektrometriás analízis

38 Fókuszterületek Omikák, rendszerbiológia hipotézis vezérelt és hipotézismentes megközelítések Miért van szükség a proteomikára? Milyen jellegű információt tud adni a proteomika? A proteomika módszertana A proteomika eszköztára Kétdimenziós elektroforézis Tömegspektrometriás módszerek A proteomika szerepe a diagnosztikában

39 Kétdimenziós gélelektroforézis 2DE Hatékony módszer fehérjék elválasztására Nagyon érzékeny, nagy technikai tudást igénylő módszer Csak a legtisztább anyagokat lehet használni Az első dimenzió az izoelektromos fókuszálás a fehérjék elválasztása a pi alapján A második dimenzió az SDS-PAGE a fehérjék elválasztása a méret alapján Alkalmas teljes proteómok vizsgálatára Legjobban sejtkultúrák vizsgálatára használható

40 Izoelektromos fókuszálás ph 3 ph 10 A fehérjék amfoterek, emiatt a töltésük változik a környezetük ph-jától függően Izoelektromos pont: az a ph értek, amelyen a fehérje nettó töltése nulla A fehérjék elválasztása a pi alapján történik Izoelektromos fókuszáló készülék A fehérjék vándorolnak az elektromos térben és amint elérik az izoelektromos pontjuknak megfelelő ph értéket elveszítik töltésüket és vándorlásuk megszűnik

41 méret pi

42 Kétdimenziós elektroforézis A Minta B Minta 2DE 2DE gélanalízis kvalitatív és kvantitatív különbségek Alkalmas a teljes proteóm vizsgálatára Minőségi és mennyiségi adatot egyaránt szolgáltat Hátrány A technikai variációk kiküszöbölésére legalább három párhuzamossal kell dolgozni Munkaigényes és vegyszerigényes

43 Nagyhatékonyságú gélanalízis a különbségek kimutatása

44 A kétdimenziós elektroforézis eredményeinek kiértékelése Progenesis (NonLinear Dynamics) Delta2D (Decodon) PDQuest (BioRad) DeCyder (GE Healthcare) Melanie... Redfin (BioRad)

45 A 2D elektroforézis során nyert gélképek összehasonlítása Delta2D szoftverrel

46 H. Influenzae (Kontrol) DIGE differenciál gél elektroforézis H. Influenzae Jelölés DIGE festékkel (aktinonin kezelt) Minták összekeverése 2DE A minták összekeverésével kiküszöbölhetők az analízisek közti technikai különbségek Alkalmas a teljes proteóm vizsgálatára Minőségi és mennyiségi adatot egyaránt szolgáltat Hátrány Drága

47 Poszt-transzlációs módosítások kimutatására szolgáló festési eljárások Sypro Ruby Flamingo Minden fehérjét megfest ProQ Diamond Csak a foszfoproteineket festi ProQ Emerald Csak a glikoproteineket festi

48 Fókuszterületek Omikák, rendszerbiológia hipotézis vezérelt és hipotézismentes megközelítések Miért van szükség a proteomikára? Milyen jellegű információt tud adni a proteomika? A proteomika módszertana A proteomika eszköztára Kétdimenziós elektroforézis Tömegspektrometriás módszerek A proteomika szerepe a diagnosztikában

49 A fehérjék vizsgálata tömegspektrométer segítségével Lehetővé válik a teljes proteóm analízise vagy az egyedi fehérjék azonosítása Nagyon érzékeny, kis mintamennyiséget igénylő módszer MS/MS vizsgálatokkal a fehérje nagy biztonsággal azonosítható Fehérjét tartalmazó foltok kivágása Enzime (tripszi emészt A sejt lízise 2DE Fehérjék azonosítása Tömegspektrometriás analízis

50 A tömegspektrométer felépítése Minta bemenet Elektronika Ion forrás Tömeg analizátor Detektor Adatfeldolgozó rendszer Vákuum rendszer Tömeg spektrum

51 intenzitás A tömegspektrum Detektált jel Peptidek/fehérjék azonosítása m/z Adatbázisok (NCBInr, SwissProt), Speciális keresőprogramok (MASCOT), Kvantitálásra alkalmas szoftverek (ProteinPilot, MASCOT) használata Az tömegspetrometriás adatok és a fehérje funkció összekapcsolása Detektált jelek felvett spektrum fehérje azonosítás/kvantitálás

52 Fehérjék azonosítása

53 intenzitás intenzitás intenzitás Fehérjék azonosítása Intakt fehérje M W alapján Túl sok variációs lehetőség ritkán használható Fehérje azonosítás m/z m/z Tripszinnel emésztett fehérjéből származó peptidek m/z alapján PMF: peptide mass fingerprint Több variációs lehetőség ha van előzetes információ, használható. Közléshez nem elfogadott. Tripszinnel emésztett fehérjéből származó peptidek fragmentációja segítségével megállapított szekvencia alapján. Pontos információ, közléshez is elfogadott. m/z

54 Fehérje azonosítás tömegspektrometriával A fehérjéket tripszinnel emésztik Peptideket ionizálják és pontos tömegüket meghatározzák, hogy így azonosítsák a peptideket és fehérjéket (PMF), vagy ionokat választanak ki (anya ion/prekurzor ion) és fragmentálják őket (MS/MS spektrum) A keletkezett egyszeres töltésű ionokat (leány ionok) analizálják hogy a szekvenciát meghatározzák és azonosítják a peptidet, majd a peptidek segítségével a fehérjéket

55 Peptidek fragmentációja Az ütközési cellában történik, általában ütközés hatására Több típusa létezik, leggyakrabban a CID collision induced dissotiation ütközés indukálta disszociációt alkalmazzák Amikor a peptidek belépnek az ütközési cellába, akkor főként a peptid kötés mentén fragmentálódnak Minden egyes peptidre optimalizálni kell az ütközési energiát Ütközéses fragmentációkor főleg b és y típusú leány ionok keletkeznek

56 A b és y fragmens ionok y3 y2 y1 H 2 N Aminosav 1 Aminosav 2 Aminosav 3 Aminosav 4 COOH b1 b2 + + b3 H 2 N Aminosav 1 Aminosav 2 Aminosav 3 Aminosav 4 COOH b ion y ion y 4 y 3 y 2 y 1 MINTAPEPTID b 1 b 2 b 3 b 4

57 intenzitás intenzitás Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Komplex minta Ionforrás Analizátor 1 Ütközési cella Analizátor 2 Detektor MS spektrum MS/MS spektrum fragmentáció m/z m/z b és y sorozatok azonosítása Peptid szekvencia megállapítása Fehérje azonosítása

58 Komplex minta Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével 1. Tömegspektrum (MS) felvétele Ionforrás Analizátor 1 Ütközési cella Analizátor 2 Detektor MS spektrum Prekurzor ion kiválasztása

59 Komplex minta Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével 2. Töltöttségi fok meghatározása Ionforrás Analizátor 1 Ütközési cella Analizátor 2 Detektor +2 - Töltöttségi fok megállapítása - Megfelelő ütközési energia kiszámolása

60 Komplex minta Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével 3. MS/MS spektrum felvétele Ionforrás Analizátor 1 Ütközési cella Analizátor 2 Detektor MS/MS spektrum Peptid fragmens ionok analízise

61 Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Információ függő adatgyűjtés: IDA information dependent aquisition/dda data dependent aquisition MS (EMS) Kizárási listák Töltöttségi fok megállapítása (ER) MS/MS (EPI)

62 Intenzitás Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével A szekvencia meghatározása a spektrumban látható csúcsok különbségéből b 1 b 2 b 3 EPTID PEPTID PEPTI y 4 y 5 97 Pro(P) 129 Glu(E) 3 b 5 y y Ile/Leu Thr(T) b b 6 Glu(E) Pro(P) Thr(T) Ile/Leu Asp(D) 97 (I/L) Pro(P) m/z y 6 y 7 Aminosavak monoizotópos tömege Glicin Alanin Szerin Prolin Valin Treonin Cisztein Izoleucin Leucin Aszparagin Aszpartát Glutamin Lizin Glutamát Metionin Hisztidin Fenilalanin Arginin Tirozin Triptopfán

63 intenzitás MS/MS spektrum Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Fehérjék azonosítása tömegspektrometriás szekvenálás és adatbázisok segítségével Adatbázis (pl. NCBInr, UniProt) m/z Keresőprogram (pl. MASCOT) Peptid szekvenciák Fehérjék

64 intenzitás intenzitás intenzitás intenzitás intenzitás Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Fehérjék azonosítása tömegspektrometriás szekvenálással - áttekintés Tripszines emésztés Fehérje Triptikus fragmensek (peptidek) m/z LC-MS Fehérje Peptid szekvencia Peptid szekvencia Peptid szekvencia Peptid szekvencia m/z m/z m/z MS spektrum m/z MS/MS spektrum

65 intenzitás MS/MS spektrum Peptidek szekvenálása MS/MS segítségével Fehérjék azonosítása tömegspektrometriás szekvenálás és adatbázisok segítségével Adatbázis (pl. NCBInr, UniProt) m/z Keresőprogram (pl. MASCOT) De novo szekvenálás Peptid szekvenciák Fehérjék