Módszerfejlesztés antibiotikumok meghatározására tejmintákból on-line szilárd fázisú

Átírás

1 Módszerfejlesztés antibiotikumok meghatározására tejmintákból on-line szilárd fázisú extrakciós UHPLC-MS/MS módszerrel Susán Judit Élelmiszer Toxikológiai Nemzeti Referencia Laboratórium Április 23.

2 NÉBIH Domány Gábor Pálffi Éva Lukonics Dóra Nagy Dániel Marosi Dóra Szent István Egyetem ÁOTK Dr. Lányi Katalin Dr. Könyves László Dr. Briedl Endre Szabó Piroska Simkon Kft. Dr. Kmellár Béla Vincze Lajos Szakai Miklós

3 Bevezetés 5. témacsoport Állatorvosi gyógyszermaradékok vizsgálatok témacsoport Az Európai Unió szigorúan szabályozza az állati eredetű élelmiszerekben előforduló antibiotikumok mennyiségét, MRL értékeket határoz meg, ami mátrixonként és vegyületenként is eltérő lehet Low lipophilicity Moderate lipophilicity High lipophilicity Strong acids Strong bases Penicillins Cephalosporins Aminoglycosides Weak acids Sulfonamides Fluoroquinolones Költséghatékonyság szempontjából fontos cél a minél több vegyület egy méréssel történő meghatározása, amit azonban a komponensek sokszor igen eltérő fizikai-kémiai tulajdonsága korlátoz Weak bases Amphoteric Macrolides Tetracyclines (OTC, TC and CTC) Fluoroquinolones (2d and 3d generation)

4 Bevezetés Vizsgálataink célcsoportja a β-laktám antibiotikumok: 1. Penicillineket: Penicillin V, Penicillin G, Oxacillin, Cloxacillin, Dicloxacillin, Nafcillin, Amoxicillin, Ampicillin és Penicillin G D7 (ISTD) 2. Cefalosporinokat: Cefalexin, Cefazolin, Cefoperazon, Cefapirin, Cefquinome, Ceftiofur és Cefalonium

5 Minta előkészítés A minta-előkészítés a mérés egy igen kritikus pontja: ki kell vonni a célvegyületeket a mintából valamilyen extrakciós eljárással, de ezzel együtt a lehető legjobban kell csökkenteni a mátrix jelenlétét. A mintatisztításra gyakran alkalmazott eljárás a szilárd fázisú extrakció (SPE), melynek során egy szorbens rétegen engedik át az adott térfogatú extraktumot. A szorbens megköti a számunkra értékes komponenseket, a zavaró mátrixot viszont nem, ezért az oldószeres lemosáskor már nem lesz az oszlopon és nem kerül bele az eluátumba. Az SPE technika laboratóriumi időigénye jelentős, manuálisan lehet végezni (több párhuzamos mintával is akár). Az SPE automatizálására volt már próbálkozás, de az a lépések automatizálását és nem a csapdázást alkalmazta, és HPLC-hez csatolt külön eszköz kellett hozzá.

6 off-line SPE Minta előkészítés SPE nélkül On-line SPE Minta előkészítés módszerek Extrakció Rázatás Centrifugálás SPE dúsítás, tisztítás Eluálás Bepárlás Oldás Szűrés Injektálás Extrakció Rázatás Centrifugálás Bepárlás Oldás Szűrés Injektálás Extrakció Rázatás Centrifugálás Szűrés Injektálás on-line SPE

7 A szilárd fázisú extrakció lépései 1. Aktiválás Az oszlop aktiválása. Általában a kolonna közepes polaritású szerves oldószerrel való mosását, nedvesítését jelenti. Cél a szorbens szemcséi közötti térbõl a levegő eltávolítása, az aktív ligandumok szolvatációja és aktiválása. 2. Kondicionálás Az aktiválás után egy egyensúlyt beállító lépés következik, amit általában egy olyan oldószer 3. Mintafelvitel A meghatározandó anyag 4. Mosás Az oszlopon gyengébben kötődő szennyezők és a mintamátrix nem kötődő komponenseinek eltávolítása. A mosó oldószer szükségképpen a mintafelvitelinél erősebb, de az elúciós oldószernél gyengébb eluenserősségű, valamint lehetőleg azokkal elegyedő, hogy a kolonna teljes kiszárítását el lehessen kerülni, ami az elválasztás szempontjából kedvezőtlen. 5. Elúció A vizsgálandó komponensek szelektív leoldása az oszlopról. Törekedni kell arra, hogy az elúciót a lehető legkevesebb oldószerrel végezzük, hogy elkerüljük a minta hígulását. SPE minta tisztítás és koncentrálás

8 Minta bemérés

9

10 On-line SPE HPLC HPLC on-line SPE

11

12

13 Mérési paraméterek. HPLC Paraméter Áramlási sebesség (ml/perc) Gradiens: 0% B (3.5 percig), 90% B 13 percnél (tartja 2 percig), 0% B 15.5 percnél Futtatási idő (perc) 20 Érték 0.3 Oszlop termosztát hőmérséklete 40 Nebulizing gas flow (porlasztógáz; ml/perc) 3 Heating gas flow (fűtött gáz; ml/perc) 10 ESI Drying gas flow (szárítógáz; ml/perc) 10 Interface hőmérséklete ( C) 400 DL hőmérséklete ( C) 250 Heat block hőmérséklete ( C) 400 ESI tű távolsága a forrástól (mm; skála:[-2 ;10]) 1.5 MS Q1 felbontás Q3 felbontás üzemmód Egység Eghység +/- MRM dwell time (msec) 20 pause time (msec) 1

14 On-line SPE Nagy nyomású váltószelep: kezdetben 1-es pozíció, 3 percnél 0-s pozíció, 15.5 percnél 1-es pozíció

15 Minta előkészítés A cél az volt, hogy a lehető legegyszerűbb minta-előkésítést alkalmazzuk. A tejminták fehérjéket, tejcukrot és zsírokat tartalmaznak, amik injektálási mintába kerülését lehetőség szerint meg kell akadályozni. A fehérjéket kicsapással és centrifugálással, a zsírokat centrifugálással, a cukrokat részben centrifugálással lehet leválasztani. Ezért, kétféle kicsapási-előkészítési módszert próbáltunk ki: az acetonitriles és az ecetsavas kicsapást. A tejfehérjék a tej mennyiségével ekvivalens mennyiségű acetonitril hozzáadásával csapódnak ki, kevesebb acetonitril (kisebb hígítás) hozzáadásával nem centrifugálhatóak. 1 ml felülúszó, ami acetonitril-víz elegy, ezért 0.5 g tejet reprezentál. Ez azért fontos, mert az on-line SPE oszlopot 100% vizes eluenssel mossuk az injektálást követően, és a kis mennyiségű szerves oldószer is befolyással lehet a csúcsalakra és a visszatartásra. 100 µl mintamennyiség mellett megvizsgáltuk a csúcsalakokat a két extrakció esetén. Arra is kíváncsiak voltunk, hogy változik-e a csúcsalak, ha a 100 µl mintát kétféle módon viszem a rendszerbe: 5 20 vagy 2 50 µl formájában.

16 változik-e a csúcsalak, ha a 100 µl mintát kétféle módon viszem a rendszerbe: 5 20 vagy 2 50 µl formájában

17 változik-e a csúcsalak, ha a 100 µl mintát kétféle módon viszem a rendszerbe: 5 20 vagy 2 50 µl formájában

18 LOD:0.03 µg/kg MRL: 30 µg/kg 7-pontos kalibráció komponensre szabottan: 0.01 MRL 5 MRL LOD-k: µg/kg LOQ-k: µg/kg

19 Összegzés Minta előkészítési eljárás Hatékonyabb Gyorsabb Olcsóbb