Fuzárium toxinok egyidejű vizsgálati lehetőségei HPLC-MS technikával

Átírás

1 Debreczeni L., Schill J., Kereszturi J. Nemzeti Élelmiszerlánc biztonsági Hivatal Élelmiszer- és Takarmánybiztonsági Igazgatóság Takarmányvizsgáló Nemzeti Referencia Laboratórium Budapest Fuzárium toxinok egyidejű vizsgálati lehetőségei HPLC-MS technikával NIVALENOL DON FUSARENON-X NEOSOLANIOL 3-Ac-DON DAS HT-2 T2 és F-2

2 Fuzárium toxinok, kémiai szerkezet alapján 4 fő csoport - A típusú trichotecének - B típusú trichotecének - Fumonizinek - Egyéb toxinok

3 A típusú trichotecének: 8-s C atom keto csoportot nem tartalmaz

4 B típusú trichotecének: 8-s C atom keto csoportot tartalmaz

5 Fumonizinek

6 Egyéb toxinok

7 Műszeres mikotoxin vizsgálati módszerek Egyedi módszerek - általában szelektív immonoaffin előkészítés, emiatt csak egy, vagy csak néhány komponens mérése (pl. AFL 4 komponens, ZEA, OCHR stb. 1-1) - általában szabványosított módszerek, egyszerűen kivitelezhetők, HPLC technika - elterjedten használt ELISA módszerek Multimódszerek szűrésre (screening) - sok komponens jelenlétéről van egyidejű információ LC-MS-MS - mennyiségi meghatározásra korlátozottan alkalmas (különböző kémiai komponensek, széles visszanyerési tartomány ( %) - standardizáció problémás Multimódszerek quantitatív meghatározásra komponens vizsgálata, mennyiségi meghatározás - ténylegesen egyidejűleg megjelenő, veszélyt jelentő komponensek csoportját vizsgálja (pl. trichotecének) - egyszerű, olcsó minta-előkészítés, HPLC-MS-MS - kereskedelemben kapható standard mix

8 Trichotecén és F2 toxinok extrakciója takarmányokból és tisztításuk AflaZon+ oszlopon Extrakció 25 g/100 ml ACN/víz 86/14 2 óra rázógép Visszaoldás 2 ml MeOH/víz 1/1-ben Mérés Felülúszó szűrése 4 ml tisztított extrakt szárazra párlása 8 ml kémcsőbe töltése és savanyítása 80 µl ecetsavval Az AflaZon+ oszlop átnyomása a kémcső tartalmán

9 Alkalmazott kromatográfiás paraméterek Kolonna: GROM-Sil 120 ODS-5 ST 250*4,6 mm*5 µm A eluens: B eluens: Áramlási sebesség: 1 g/l Ammónium-acetát/víz Metanol 0,6 ml/perc Gardiens: 0-6 perc A:75% B: 25% 6-15 perc A:75-5% B 25-95% lineáris gradiens perc A:5% B:95% Stop time: 24 perc Post time: 7 perc Injektált térfogat: 5 µl

10 Tömegszelektív detektor beállításai különböző toxinokra Ionforrás (APES) Parameter Value Gas Temp ( C) 300 Gas Flow (l/min) 8 Nebulizer (psi) 35 Capillary (V) 2500 Q1 Q3 Q2 Compound Name Prec Ion Prod Ion CE (V) pol nivalenol 311,2 281,1 10 neg nivalenol 311,2 191,1 20 don 297,1 249,1 8 pos don 297,1 231,2 12 neosol 400,2 305,2 12 pos neosol 400,2 215,1 20 neosol 400,2 185,1 22 fus 355,1 247,1 10 fus 355,1 229,1 20 fus 355, acdon 339,2 291,1 8 pos acdon 339,2 231,1 12 acdon 339,2 202,9 17 acdon 339, t2 484, pos t2 484, t2 484, ht2 442, ht2 442, das 384, das 384, f2 317, neg f2 317,2 175,2 20 f2 317,2 132,2 25

11 Kalibrációs egyenesek 5 pontra nullán átmenő egyenest fektettünk, mind a 9 egyenes esetén R 2 >0,995

12 A módszer kimutatási és meghatározási határai Név LOD LOQ µg/kg µg/kg Nivalenol 8 40 DON 8 40 FUSARENON-X 8 40 NEOSOLANIOL Ac-DON 8 40 DAS 2 10 HT2-TOXIN 4 20 T2-TOXIN 2 10 F2-TOXIN 2 10

13 Standard kromatogramm

14 Egy minta kromatogramjai két féle minta-előkészítéssel: 25g/100 ml ACN/víz 84/16 clean-up 4/2 25g/100 ml ACN/víz 84/16 clean-up nélkül (multitoxin) HT2: ionelnyomás? Sample niv don fus neo 3acdon das ht2 t2 f2 Data File Amt. Dil. Type µg/kg µg/kg µg/kg µg/kg µg/kg µg/kg µg/kg µg/kg µg/kg st_1_1.d 1,00 Cal 10,59 10,70 11,55 10,71 10,29 11,05 10,25 11,05 10,45 st_2_1.d 1,00 Cal 20,02 21,47 25,13 20,42 21,00 22,22 21,51 22,63 21,55 st_3_1.d 1,00 Cal 39,79 39,81 41,35 39,61 40,83 42,80 40,13 42,97 42,70 st_4_1.d 1,00 Cal 101,41 101,54 105,15 100,83 102,47 103,95 100,19 106,03 103,65 st_5_1.d 1,00 Cal 199,30 199,09 196,56 199,59 198,49 197,19 199,72 196,07 197,46 934_1mi.d 25,00 100,00 Sample 729,12 28,21 24,09 62,27 934_1a.d 25,00 50,00 Sample 782,11 58,42 22,28 62,08

15 A módszer F2 eredményeinek összehasonlítása a szabvány szerint (MEOH/Víz-es extrakció, immunaffin mintaelőkészítés, HPLC-FLD mérés)mért F2 eredményeivel Szabvány módszer LC-MS/MS módszer Arány µg/kg µg/kg % 1 <10 < ,0 3 <10 <10 4 <10 < ,3 14,8 120, ,1 105, ,7 90,9 8 19,1 21,4 112,0 9 67,1 59,8 89, , , ,5 18,7 79,6

16 Az egyik 2014-es körvizsgálat eredményei HPLC ELISA

17 Mérések számokban: Évente kb db különböző takarmány-, illetve élelmiszerminta vizsgálatát végezzük el akkreditáltan az ismertetett módszerrel DON-ra több mint 10, T2 HT2-re 3 körvizsgálaton vettünk részt, melyeken a Z-score értékeink minden esetben belül maradtak a ±1 értéken F2 körvizsgálatok esetében rendre hasonló párhuzamos értékeket mértünk, mint a szabvány módszerrel kapott és megfelelt eredményeink

18 Aktualitás: a tavalyi év időjárási viszonyai kimondottan kedvezőek voltak Különösen a DON és F2 szennyezettség erős növekedése figyelhető 30 mg/kg feletti DON, illetve 5 mg/kg feletti F2 tartalmú kukorica ( is ) termett! TRICHOTECÉN VÁZAS TOXINOK- biológiai hatás Takarmány visszautasítás Cytotoxikusak Gátolják a fehérjeszintézist Károsítják az ideg-, és immunrendszert Gyulladásos elhalásos folyamatokat indítanak el Károsítják a vese kéreg- és velőállományát. ZEARALENON/ F2 / - biológiai hatás Hüvelyduzzanat Belső nemi szervek ödémája Petefészek funkcionális zavarai Csecsbimbó gyulladás Elmaradó fogamzás Spermiogenezis károsodása Halva ellések nőnek

19 Határértékek- 1881/2006 EK Élelmiszer DON ZEA /ug/kg / Gabonafélék Kivétel Durumbúza, zab Kukorica Kenyérfélék,tésztafélék Bébiétel gabonaalapú

20 Ajánlási szintek- 576/2006 EK Takarmány DON ZEA HT/T2 /mg/kg / Alapanyagok- gabona 8 2 Kukorica 12 3 Teljesértékű táp 5 Kivételek Malac - kocasüldő 0,1 Tenyészkoca- hízósertés 0,25 Borjak, tejelő marhák, juhok, Kecskék 0,5 ÚJ: Malac, borjú 0,2 Hízósertés 0,4 Baromfi 0,5

21 EU Referencia laboratóriumának szabványosítani kívánt módszere: Vizsgált komponensek: DON, AflaB1, Fumoniszin B1 és B2, T-2, HT-2, F-2 és Ochratoxin Extrakció: 5 g minta/25 ml ACN/VÍZ/HCOOH 79/20/1 Teszt oldat: 500µl extraktot+25µl minden komponenst tartalmazó C-13 jelzett belső std.-et szárazra párolunk, majd 250µl eluensben felveszünk. Kromatográfia: Kolonna: Supelco Ascentis Express C 18 75mm*2.1mm*2.7µm Kromatográfia I. Kromatográfia II: Gradiens Mobil A 0.1%HCOOH/VÍZ 5mM NH4Ac_0.3%Ecetsav/VÍZ elúció Mobil B 0.1%HCOOH/MeOH 5mMNH4Ac_0.3%Ecetsav/MeOH Detektálás: Kiértékelés: Hármas quadrupol A két féle kromatográfia esetén a vizsgált ionátmenetek az eluens minőségétől függően egyes komponenseknél változnak. T-2, HT-2, DON ISTD kalibráció

22 KÖSZÖNÖM A FIGYELMET