7. Festékelegyek elválasztása oszlopkromatográfiás módszerrel. Előkészítő előadás

Átírás

1 7. Festékelegyek elválasztása oszlopkromatográfiás módszerrel Előkészítő előadás

2 A kromatográfia A módszer során az elválasztandó anyagot áthajtjuk egy mozgó fázisban egy álló fázison keresztül és közben az anyag komponensei elválnak egymástól. A módszereket - a mozgófázis - a mozgó- és állófázis térbeli elrendeződése - a mozgó- és állófázis polaritása - az elválasztáshoz vezető kölcsönhatás alapján csoportosítjuk.

3 Csoportosítás a mozgófázis szerint A mozgófázis: folyadék gáz > folyadékkromatográfia -> gázkromatográfia Csoportosítás a polaritásviszonyok szerint Normál fázisú folyadékkromatográfia: ha az állófázis polárisabb mint a mozgó fázis Fordított fázisú folyadékkromatográfia: ha a mozgófázis polárisabb mint az állófázis

4 Csoportosítás a mozgó- és állófázis térbeli elrendeződése szerint szilárd töltet oszlopba töltve > oszlopkromatográfia szilárd bevonat sík felületen > vékonyréteg kromatográfia folyékony bevonat vékony cső belső falán > gázkromatográfia kapilláris kolonnával

5 Oszlopkromatográfia Az elválasztás egy oszlopban történik. Az oldószert a gravitáció vagy nyomáskülönbség hajtja végig az oszlopon. Analitikai és preparatív cél!

6 Vékonyréteg kromatográfia TLC thin layer chromatography Az elválasztás zárt, oldószergőzökkel telített térben történik. Az oldószer szívódik felfelé a vékonyréteg lapon és viszi magával a komponenseket. Analitikai cél!

7 Csoportosítás a kölcsönhatás típusa szerint adszorpciós megoszlási ioncsere affinitás méret kizárásos

8 Adszorpciós kromatográfia A kölcsönhatás: adszorpciós Az adszorpciós kötőerők nagysága határozza meg a mozgó fázis melyik komponense mennyi ideig tartózkodik az oszlopon. A mozgófázisnál gyengébben kötődő komponens végigszalad az oszlopon. A mozgófázisnál sokkal erősebben kötődő komponens megkötődik az oszlop elején.

9 Adszorpciós kromatográfia Az oszlopba töltött szilárd fázis felülete energetikailag inhomogén, rajta a kötődés szempontjából kedvezőbb, ún. aktív helyek találhatók. A megkötött komponenst az erősebben adszorbeálódó oldószer az aktív helyekről leszorítja, eluálja. Így egy elválasztott tiszta komponens az oszlopról leoldva visszanyerhető. Ezt legtöbbször oldószer cseréjével vagy az oldószerelegy összetételének megváltoztatásával érik el.

10 Adszorpciós kromatográfia Gyakran használt adszorbensek: aktív szén szilikonüveg alapú adszorbensek cellulóz alapú adszorbensek polisztirol-divinil benzol alapú adszorbensek molekulasziták (zeolitok) aktivált alumínium-oxid szilikagél

11 Az oszlopkromatográfiás elválasztás minta felvitele elválasztás oszlop elkészítése az elválasztott komponensek gyűjtése

12 Megoszlási kromatográfia A megoszlási folyamat két egymással nem elegyedő oldószer fázis között jön létre. Állófázis: szilárd hordozóhoz erősen adszorbeálódó folyadék film. Mozgófázis: a folyadékfilmmel nem elegyedő folyadék Tipikus gyakorlati alkalmazások: aminosavak, szénhidrátok és vízoldékony növényi pigmentek elválasztása.

13 Ioncsere kromatográfia A molekulák elektromos tulajdonságain alapuló eljárás ionok és poláros molekulák elválasztására. Állófázis: gyanta vagy gél mátrix kovalens kötéssel kapcsolt pozitív vagy negatív töltésű funkciós csoportokat tartalmaz, és ennek megfelelően anion- vagy kationcserélő. Mozgófázis: vizes puffer oldat. Eluálás: ph vagy ionerősség változtatás.

14 Affinitás kromatográfia A molekula és komplementere közötti igen specifikus kölcsönhatáson alapul. Állófázis: nem oldódó mátrix + kémiai kötéssel felvitt komplementer. Mozgófázis : az izolálandó anyag oldata. Eluálás: ph vagy ionerősség változtatás. Ligandum Az izolált anyag enzim szubsztrát, kofaktor antitest antigén, vírus, sejt nukleinsav kötő fehérje nukleinsav hormon receptor hormon

15 Az affinitás kromatográfia folyamata I. az elválasztandó elegy betöltése II. III. a nem kötött komponensek kimosása a keresett komponens eluálása

16 Méret kizárásos kromatográfia A molekulák méretük szerint válnak szét a nagy molekulatömeg tartományban (2-25 kg/mol). Állófázis: kémiailag inert gél vagy porózus szervetlen szilárd anyag. Mozgófázis: víz vagy vizes oldat. Elv: úthossz különbség

17 A mérési feladat Szudán-III-at és erioglaucint tartalmazó festékelegy elválasztása adszorpciós oszlopkromatográfiás módszerrel. Az elválasztott festékek koncentrációjának meghatározása spektrofotometriás módszerrel.

18 A mérési feladat az elválasztás A szudán-iii-at és az erioglaucin festékek eltérő polaritásúak, így adszorpciós kromatográfiával elválaszthatók. szudán-iii erioglaucin

19 A kromatográfiás oszlop és az eluensek Az állófázis: alumínium-oxid A mozgófázis: etanol víz elegyek

20 Az oszlop elkészítése 1. kb. 1 cm vastagságban vatta a Witt-lemezre 2. a vatta nedvesítése 96%-os etanollal 3. az oszlop töltetének elkészítése: 1. egy 25 ml-es főzőpohárba mérjünk ki kb. 10 ml alumínium-oxidot (két kanálnyi) 2. töltsünk hozzá egy másik főzőpohárból kb. 7 ml 96%-os etanolt 3. fémspatulával azonnal keverjük össze 4. adjunk hozzá még annyi etanolt (kb. 3ml), hogy homogén állagú, önthető (palacsintatészta-szerű) legyen 4. töltsük rá a szuszpenziót a vattára 5. tömörítsük az oszlopot vízsugárszivattyú segítségével, ügyelve arra, hogy rövid időre se száradjon ki!

21 Az elválasztás sorrendje polaritási sorrend: H 2 O > erioglaucin > CH 3 CH 2 OH > szudán-iii 96%-os etanol 30%-os etanol

22 Az összeállított berendezés

23 A festékelegy elválasztása Töltsünk 96%-os alkoholt az oszlop fölé kb. 0,5 cm magasságban. Pipettázás előtt alaposan homogenizáljuk a kapott mintát! Adagoljunk automata pipettával pontosan 1,0 cm 3 mintát az oszlopra.

24 A festékelegy elválasztása 96% etanol Először a Szudán-III eluálását végezzük el 96%-os etanollal. Fontos: a szívatás kezdetétől a végéig mindig legyen 1 cm folyadékréteg az oszlop fölött, egyébként az oszlop megrepedezik, és újra kell készíteni.

25 A festékelegy elválasztása 96% etanol Ügyeljünk arra, hogy festékenként maximum 25 cm 3 lehet a végtérfogat (a lombikok mérete miatt)! Igyekezzünk minél kevesebb alkohollal dolgozni!

26 A festékelegy elválasztása 96% etanol Kb. 15 ml alkohol az elválasztásra, 10 ml az átmosásra/szűrésre.

27 A festékelegy elválasztása 96% etanol Az oszlopot a piros szín eltűnéséig mossuk.

28 A festékelegy elválasztása 96% etanol 30% etanol Az erioglaucin eluálása előtt csatlakoztassunk tiszta, száraz mintagyűjtő szívópalackot az oszlophoz. Töltsünk az oszlopra 30%-os etanolt és végezzük el a leoldást.

29 A festékek mérőlombikba vitele Ha az oldat opálos a szívópalackban, az alumínium-oxidot üvegszűrő segítségével válasszuk el (bármelyik festék esetén). A szívópalack tartalmát kvantitatív módon mossuk át a megfelelő koncentrációjú etanollal egy 25 ml-es mérőlombikba. A szívópalackok tartalmát úgy mossuk át a mérőlombikba, hogy közben az oszlop alján lévő üvegharangot is a lehető legalaposabban átöblítjük!

30 Fényabszopció -> koncentráció: a Lambert Beer-törvény Lambert Beer-törvényről részletesen a Perger, Szalma, Takács: Fizikai-kémia gyakorlatok (Semmelweis Kiadó, 2006) 11.1 Kétkomponensű keverék koncentrációjának spektrofotometriai meghatározása az UVtartományban. (16.) mérésénél lehet olvasni! Ebben az előadásban csak igen egyszerűen tárgyaljuk.

31 A Lambert Beer-törvény Adott hullámhosszon a mintában abszorbeálódó fény mennyisége arányos a fényelnyelő komponens koncentrációjával: A = lg(i 0 /I) = ε l c ahol A az abszorbancia, I 0 a mintába belépő fény intenzitása, I a kilépő fény intenzitása, ε a moláris abszorpciós együttható, l az optikai úthossz (itt ez a minta rétegvastagsága), c az anyagmennyiség koncentráció.

32 A Metertech SP-880 egysugárutas, látható tartományban mérő spektrofotométer Spektrofotométer: fényabszopciót mér a hullámhossz függvényében Egysugárutas: a fényútba a referencia és a minta csak felváltva tehető

33 Az egysugárutas spektrofotométer blokkdiagramja

34 Hol érdemes mérni? Ott, ahol a legpontosabban tudunk! - Nagy jel/zaj arány. - A hullámhossz beállítás hibája a lehető legkisebb legyen. Ismerni kell az anyag spektrumát! - Nagyon kicsi és nagyon nagy abszorbanciák pontatlanul mérhetők.

35 Spektrumok felvétele Az elválasztott festékek spektrumának felvétele nm-es tartományban történik. Az alapvonal felvételénél a minta oldószerét használjuk referenciának. Vegyük fel az eredeti festékelegy 25-szörös hígításának spektrumát is (hogy össze tudjuk hasonlítani az elválasztás utáni spektrumokkal)!

36 A festékek spektruma Az elválasztott festékek nagy moláris abszorbanciájú csúcsokat adnak. A koncentrációk meghatározása ezeken történik λ max 1.6 Abszorbancia Szudán III Erioglaucin Hullámhossz / nm

37 Kalibráció Ismert koncentrációjú oldatokat készítünk. A maximális elnyelésnél mért abszorbanciákat a koncentrációk függvényében ábrázoljuk és egyenest illesztünk rájuk. Ennek meredeksége a Lambert-Beer törvényben szereplő moláris abszopciós együttható, a kapott egyenes a kalibrációs egyenes. Szudán III kalibrációs görbéje 509 nm-en Erioglaucin kalibrációs görbéje 630 nm-en 1,6 2,0 1,2 1,6 1,2 A 0,8 y = E ,41642x A 0,8 0,4 0,4 y = ,06961x 0,0 0,000 0,004 0,008 0,012 0,016 0,020 c / g/l 0,0 0,004 0,008 0,012 0,016 c / g/l A festékek kalibrációját a leírás tartalmazza, azt megmérni nem kell! EZEK A 2014-ES SZÁMOK!

38 Számolás A mért abszorbanciákból a koncentrációkat a kalibrációs egyenesek segítségével számoljuk. Vegyük figyelembe, hogy az elválasztás során 25-szörös hígítás történt! Beadandók: - a festékek leolvasott λ max értéke - a megadott hullámhosszakon leolvasott abszorbanciák - az eredeti oldatra vonatkozó számolt koncentrációk g/100 cm 3 egységben 3 értékes jegyre - az ismeretlen minta elválasztás utáni és eredeti (25-szörösre hígított) spektruma ugyanazon a grafikonon ábrázolva