Gyulladáscsökkentők meghatározása felszíni vizekből LC-MS-MS módszerrel

Átírás

1 Tudományos Diákköri Dolgozat NÁSZ SZILÁRD Gyulladáscsökkentők meghatározása felszíni vizekből LC-MS-MS módszerrel Témavezető: Dr. Eke Zsuzsanna, Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Analitikai Kémiai Tanszék Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2008

2 Tartalomjegyzék 1 Célkitűzés Irodalmi áttekintés Fájdalomcsillapítók, és gyulladáscsökkentők általános bemutatása A fájdalom gyógyszeres kezelésének alapelvei Fájdalomcsillapítók Gyulladáscsökkentők Szteroid gyulladáscsökkentők Nem szteroid típusú gyulladáscsökkentők Fontosabb NSAID gyógyszerek Nem-szteroid gyulladáscsökkentők mérésére alkalmazott módszerek Szilárd fázisú extrakció Folyadékkromatográfia Tömegspektrometria Elektroporlasztásos ionizáció Kvadrupól analizátor Detektor Vákuumrendszer Tandem tömegspektrometria Tandem tömegspektrometriás mérési technikák Kísérleti rész Az alkalmazott anyagok Készülék Standard oldatok Mintaelőkészítés Szilárd fázisú extrakció A minta térfogatának meghatározása Elúciós térfogat meghatározása Bepárlás Az oldószer összetétel hatása a kromatogramra Kromatográfiás körülmények Oszloptermosztát hőmérsékletének optimálása Detektálási paraméterek vizsgálata Validálás Szelektivitás Linearitás Érzékenység Torzítatlanság Pontosság Kimutatási és meghatározási határ Összefoglalás Köszönetnyílvánítás Irodalomjegyzék

3 1 Célkitűzés A gyulladásos betegségek kezelésére kifejlesztett gyógyszerek egyre nagyobb teret hódítanak világszerte. Elsősorban tabletta, kapszula és kenőcs formájában alkalmazott készítmények találhatóak meg. Gyógyhatásuk szájon át történő bevétellel, illetve a gyulladt testrészre való kenéssel érhető el. Problémát okoz, hogy a tablettaként vagy kapszulaként elérhető gyulladáscsökkentők az emberi, illetve állati szervezetből kiürülés útján, míg kenőcs formában alkalmazottak pedig lemosás után a szennyvizekbe, illetve a felszíni vizekbe kerülhetnek. A problémát fokozza, hogy a nem megfelelő hulladékkezelés által ugyancsak bekerülhetnek a vizeinkbe. A felszíni vizeink a tisztítási lépéseket követően kerülnek a háztartásokba, de a jelenleg alkalmazott tisztítási technológiák ezeknek a komponenseknek a hatékony eltávolítására nincsenek felkészítve. Ebből kifolyólag a háztartásokhoz eljutó vizek is tartalmazhatnak gyulladáscsökkentőket. Mivel jelenlétük a vízi élővilág és az ember számára egyaránt káros lehet, igen fontos tehát, hogy rendelkezésünkre álljanak olyan analitikai módszerek, melyek alkalmasak a szennyezettségek pontos felmérésére. Célom volt, egy olyan HPLC-MS-MS módszer kidolgozása, amely képes felszíni vizekből négy gyulladáscsökkentő komponens (Diclofenac, Ibuprofen, Ketoprofen, Naproxen) minőségi és mennyiségi meghatározására ng/ml-es koncentrációszinten. 2 Irodalmi áttekintés 2.1 Fájdalomcsillapítók, és gyulladáscsökkentők általános bemutatása A fájdalom, mint negatív érzet külső vagy belső okokra vezethető vissza. Hatására a szervezet motoros, vegetatív és pszichés válaszlépésre kényszerül. A fájdalom érzékelése lényegében egy fontos biológiai jelzőrendszer, amely az ártalmas ingerek, a szervezet károsodása, vagy megbetegedése elkerülésében játszik nagy szerepet. Ezekből következik, hogy a fájdalom egy vitális inger. Akut, krónikus, és tumoros fájdalmakat különböztethetünk meg a keletkezés körülménye, oka, és a fennállás tartama alapján. Ezen három csoport kórélettana, diagnosztikája, és kezelése folyamán sok hasonlóság tapasztalható, de lényeges különbségek is fennállhatnak [1]. 3

4 2.2 A fájdalom gyógyszeres kezelésének alapelvei A gyógyszeres kezelések lehetőségei a fájdalomérzet különböző szintjein valósulhatnak meg. Egy lehetséges kezelés a fájdalomreceptorok érzékenységének csökkentése nem-szteroid és szteroid gyulladásgátlókkal. A korszerű, gyógyszeres fájdalomcsillapítás alapja a megfelelő gyógyszer(ek), megfelelő adagban, és a megfelelő időközönként való alkalmazása. Két kezelési fajtát különböztetünk meg: óra- és lépcső szerinti kombinációs kezelést. Az óra szerinti adagolás lényege, hogy a gyógyszereket folyamatosan, hatástartamuknak megfelelő rendszerben alkalmazzuk. A lépcső szerinti kezelésnél először gyengébb hatású készítményekkel indítunk, majd folyamatosan (lépcsőszerűen) haladunk az erősebb gyógyszerek felé. A kombinációs kezelés előnye, hogy az alkalmazott szerek egymás hatását kiegészíthetik, hatékonyabbá tehetik [1]. 2.3 Fájdalomcsillapítók A fájdalomcsillapítók csökkentik a fájdalmat okozó vegyületek, a prosztaglandinok termelését, valamint az agy fájdalomközpontjára hatnak. A legtöbb fájdalomcsillapító hatóanyag gyulladáscsökkentő és lázcsillapító hatással egyaránt rendelkezik, mivel hatásmechanizmusuk nagyban hasonlít egymáshoz. Osztályozásuk elsősorban kémiai szerkezetük alapján történik. Ez összefügg azzal, hogy melyik hatás erősebb: a gyulladáscsökkentő vagy a fájdalomcsillapító. A nem-szteroid gyulladáscsökkentők családjába tartozó gyógyszereknél a gyulladás mérséklése erősebb, és főleg reumatikus fájdalmak esetén használatosak. Alkalmazásuk műtétek utáni gyulladásos tüneteknél is gyakori. Ezenkívül lázcsillapító, vérlemezke-összecsapódást gátló hatással is rendelkeznek [2]. Lázcsökkentő analgetikumok azok a vegyületek, amelyek lázcsökkentő és fájdalomcsillapító hatással rendelkeznek, de nincs gyulladáscsökkentő hatásuk. E vegyületek szelektív módon csökkentik a lázas hőmérsékletet anélkül, hogy lázcsillapító adagban a normális hőszabályozást lényegesen befolyásolnák. Hatásmechanizmusuk a mai napig nem tisztázott. Elfogadott az a nézet, hogy hatásukat a központi idegrendszeren keresztül fejtik ki a hipotalamusz hőszabályozási központjában [3]. 4

5 2.4 Gyulladáscsökkentők Szteroid gyulladáscsökkentők A szteroid gyulladáscsökkentők célja, hogy az allergiás reakciók során kialakuló gyulladásos folyamatokat gátolják, csökkentsék a szervezet immunválaszát függetlenül a kiváltó okoktól. A gyulladást mérséklik, a későbbi gyulladásos folyamatok gátolva lesznek, mivel csökkentik az erek tágulatát, a szövetekben létrejövő felmelegedést, az ödémát, és a fájdalomérzetet. A gyulladásos mediátorok megjelenésének a megakadályozása az arachidonsav gátlására vezethető vissza. Az allergiás reakciót követő néhány órán belül észlelhetőek az első gyulladásos tünetek. A szteroidok ezeket a gyulladásos tüneteket akadályozzák meg és gátolják az eozinofil immunsejtek működését. A szervezeten belül is termelődik egy szteroid gyulladáscsökkentő: a kortizon. Szerkezete nagy hasonlóságot mutat a szintetikus úton előállított kortikoszteroidokhoz. A kortizont a mellékvese állítja elő, gyulladáscsökkentő szerepén kívül veseműködést szabályzó hatása is van [4] Nem szteroid típusú gyulladáscsökkentők A nem szteroid gyulladáscsökkentők (Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs, NSAIDs) nem szteránvázas vegyületek, hatásukat a ciklooxigenáz enzimek (COX-1 és COX- 2) aktivitásainak csökkentésével érik el. Ezen enzimek szintetizálják a prosztaglandinokat, amelyek a gyulladás kialakulásáért felelősek. Jelenleg a COX-2 gátló hatású készítményeket alkalmazzák elsősorban, így nem jelentkeznek a COX-1 gátló gyulladáscsökkentőkre jellemző mellékhatások (fekélyek kialakulása). Ezeknek nincs akut fájdalom- és lázcsillapító hatása, de tartós gyulladáscsökkentésre vagy éjszakai fájdalom csökkentésére alkalmasak [1,5]. 5

6 Fontosabb NSAID gyógyszerek Szalicilsav származékok A szalicilsav származékokat enyhe vagy közepes erősségű fájdalmak csökkentésére használják. Erős gyulladáscsökkentő, láz- és fájdalomcsillapító hatásuk van. Az egyes származékok hatásai közötti különbségek a kémiai szerkezetük különbségeiből adódik. Az acetilált származékok (aszpirin) irreverzibilisen gátolják a COX enzimet, ezzel 8-11 napig gátolják az aggregációt. A nem acetilált származékok (pl. kolin-szalicilát, Naszalicilát) reverzibilisen gátolják a COX enzimet, kevesebb gasztrointesztinális mellékhatást okoznak, ritkábban fordul elő allergiás reakció [1]. 1. ábra: Az acetil-szalicilsav képlete Az acetil-szalicilsavat, vagy másnéven Aszpirint, 1827 óta használják. Először egy fűzfa (Salix Alba) kérgében található szalicin nevű anyagot használtak, amiből a szervezeten belül acetil-szalicilsav szintetizálódik ban Kolbe előállította szintetikusan is nátriumfenolát és szén-dioxid reakciójával. Tisztán először 1838-ban állították elő és használata az orvostudományban a mai napig nagyon elterjedt. Más NSAID gyógyszerrel együtt adva a mellékhatások fokozódnak [3,5] Propionsav származékok 2. ábra: A propionsav képlete 6

7 Vizsgálataimat négy elterjedt hatóanyagra végeztem: naproxen, melyet főleg reumás fájdalmak esetén alkalmaznak; diclofenac, ami mozgásszervi megbetegedések esetén javítja a mozgásképességet; ibuprofen és származékai (ketoprofen), amelyek még viszonylag új keletű gyógyszerek [5]. A négy komponens közül az ibuprofen hatóanyagot tartalmazó készítmények kaphatóak vény nélkül is. Naproxen CAS: ábra: Naproxen szerkezeti képlete Diclofenac CAS: ábra: Diclofenac szerkezeti képlete 7

8 Ibuprofen CAS: ábra: Ibuprofen szerkezeti képlete Ketoprofen CAS: ábra: Ketoprofen szerkezeti képlete Pirazolon származékok Fenilbutazon, fenazon, aminofenazon, noraminofenazon. Nagyon erős hatásuk miatt ritkán alkalmazzák őket [5]. 8

9 Antranilsav származékok Mefenaminsav, flufenaminsav, nifluminsav. Ízületi és más egyéb gyulladásos betegségek kezelésére használják őket [5] Anilin származékok Az acetanilid és a fenacetin alkalmazása manapság háttérbe szorult. Paracetamol (para-acetaminofenol): a fent említett két vegyület aktív metabolitja. Az egyik legnépszerűbb és legelterjedtebb lázcsökkentő gyógyszer, gyerekek esetén is megfelelő biztonsággal alkalmazható [5]. 2.5 Nem-szteroid gyulladáscsökkentők mérésére alkalmazott módszerek A felszíni vizekbe közvetett vagy közvetlen úton bejutó szennyezések miatt megjelenhetnek a gyulladáscsökkentő komponensek is. Ezen komponensek mérése több szempontból is nehéz feladat. Nagyon alacsony koncentrációban vannak jelen felszíni vizekben, így csak egy érzékeny és szelektív analitikai módszer kidolgozásával lehet meghatározni pontos mennyiségüket. A NSAIDs mérésére több különböző mintaelőkészítés terjedt el. Szilárd fázisú extrakciós technika (Solid Phase Extraction, SPE) [6,7,8,9,10,11,12], és szilárd fázisú mikroextrakció (Solid Phase Microextraction, SPME), ahol egy vékony szálra felvitt állófázison kötődnek meg a komponensek [13,14,15]. Lehet folyadék-folyadék extrakcióval is vizsgálni az anyagokat, ebben az esetben a felhasznált oldószer mennyisége, és a bepárlásra szánt idő megnövekedhet. A leggyakrabban alkalmazott mintaelőkészítés a szilárd fázisú extrakció. Mivel a vizsgálandó komponensek nagyon kis koncentrációban vannak jelen a mintákban, így további dúsítási lépés alkalmazása szükséges [6,7,8,9,10,11]. Ez inert atmoszférában történő bepárlással érhető el. A kapott oldatok mérésére is több lehetőség van. Gázkromatográfiás analízis, származékképzési reakciót követően [9,11,12], vagy folyadékkromatográfiásan, származékolás nélkül [6,7,8,10]. A gázkromatográfiában gyakori a diazometánnal történő származékolás [11,12], de rendelkezésre állnak adatok N,Obisz(trimetilszilil)trifluoracetamiddal (BSTFA), N-metil-N-(trimetilszilil)trifluoracetamiddal (MSTFA), N-metil-N-terc-butildimetilszililtrifluoracetamiddal (MTBSTFA), és hexametildiszilazán (HMDS), trifluorecetsav (TFAA) keverékével történő reakciókra is [16]. A 9

10 folyadékkromatográfiás eljárások azért nem alkalmaznak származékképzést, mert a molekulák anélkül is megfelelően vizsgálhatóak. Folyadékkromatográfiában kétfajta detektálást használnak az irodalmak alapján: UV-VIS detektálást [8], és tömegspektrométert [6,7,10]. A tömegspektrometria használata előnyt élvez az UV-VIS detektorral szemben, mivel jobb kimutatási határt érhetünk el vele és nagyobb a szelektivitása Szilárd fázisú extrakció A mintaelőszítés egyik legelterjedtebb fajtája az SPE. Ez egy kis szemcseméretű állófázisból (1-5 μm) és egy olyan oszlopból áll, amibe betöltik ezt az állófázist. A patronokat legtöbbször alacsony nyomású vákuumkáddal együtt használják, amivel az áramlási sebességet lehet megnövelni és szabályozni. A rendelkezésre álló töltetek listája nagyon széles. Lehetnek szervetlen vagy szerves fázisú töltetek, normál vagy fordított fázisú, ioncserés, affinitás és akár vegyes kémiájúak is a megfelelő analitikai cél elérése érdekében. Az extrakció a következő lépésekből áll: kondicionálás, mintafelvitel, mosás, szárítás, leoldás. A kondicionálás során előkészítjük a töltetet a minta befogadására. A mintafelviteli lépésben megkötődnek a töltettel kölcsönhatásba lépő komponensek. Mosás során eltávolíthatjuk a zavaró szennyezőket. A töltet szárítása után leoldjuk az analizálandó vegyületeket (8. ábra). Két elvi lehetőség kínálkozik a célvegyületünk tisztítására, dúsítására. Az egyik lehetőség a minta felvitele közben, hogy a vizsgálni kívánt komponensünk erősen megkötődik a tölteten, a szennyezők pedig nem, vagy szelektív leoldással eltávolíthatóan kötődjenek. Végül a célvegyületet a lehető legkisebb térfogatú, a célvegyületet oldó oldószerrel leoldjuk. A másik lehetőség, amikor minden szennyező anyag megkötődik a tölteten, egyedül a vizsgált komponens halad át zavartalanul a töltetágyon. 10

11 7. ábra: SPE patron általános felépítése 8. ábra: SPE mintaelőkészítés sematikus ábrája Folyadékkromatográfia Folyadékkromatográfiáról akkor beszélünk, ha a kromatográfiás eljárás során a mozgófázis folyadék. Napjainkban az egyik legfontosabb analitikai módszer a HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Alapvető feltételei, hogy a mozgófázis folyamatosan áramoljon a rendszerben, legkevésbé kötődjön az állófázison, és a mintát dugószerűen juttassuk be.

12 9. ábra: Folyadékkromatográf felépítése A 9. ábrán látható egy folyadékkromatográf általános felépítése. Az oldószertároló egységből az áramlás a pumpa felé halad. A pumpa végzi az egyes oldószerek keverését és a megfelelő áramlási sebesség beállítását. Az injektor végzi a minta bejuttatását az eluensáramba. Injektálás után célunk a komponenseink elválasztása, ami az analitikai oszlopon történik meg. A szétválasztott komponensek egy jól megválasztott, szelektív detektorban értékelhető csúcsot adnak számunkra, így a hozzá kapcsolt számítógépen megtörténhet az eredmények kiértékelése. Nagyon gyors analitikai eljárás, sok komponensű elegyek analízise sem tart tovább néhány percnél. A korszerű készülékek teljesen automata berendezések. Számítógép által irányított on-line kapcsolatban történik a teljes elválasztás. A pumpák széles áramlási sebességgel és nagy nyomástartományban képesek dolgozni. Egyre inkább a fordított fázisú, gyors kromatográfiás oszlopok kapnak szerepet az elválasztás során, amiket a kis szemcseméret és nagy nyomásesés jellemez Tömegspektrometria A tömegspektrométer a mai korszerű elválasztástechnikával kombinálva az egyik leghatékonyabb analitikai módszer. A tömegspektrometria egy olyan vizsgálati módszer, ahol egy ionforrás segítségével töltött ionokat hozunk létre, fajlagos tömegük (m/z) alapján elektromos illetve mágneses terekkel vákuumban elválasztjuk őket. Az egyes ionok intenzitását folyamatosan követjük, így kapjuk a tömegspektrumot (ionáram intenzitás fajlagos tömeg). A tömegspektrum a minőségi kiértékelés alapját képezi, mivel meglehetősen kevés azon molekulák száma, amelynek a legintenzívebb ion intenzitására normált, 12

13 úgynevezett karakterisztikus tömegspektruma is azonos lenne [17]. Dinamikus tartományát tekintve g tartományban lévő anyagok vizsgálhatóak vele. 10. ábra: A tömegspektrométer általános felépítése Elektroporlasztásos ionizáció 11. ábra: ESI ionforrás Az elektroporlasztásos ionizációs technikánál (Electrospray Ionization, ESI) a HPLCből érkező mintát folyadékfázisban juttatjuk egy kapillárison keresztül az ionforrásba. Az alkalmazott elektromos tér és a fűtött porlasztógáz (N 2 ) hatására cseppek képződnek. Az ellenelektród és a kapilláris közötti feszültségkülönbség hatására töltések alakulnak ki az egyes cseppek felületén. A szárítógáz hatására az oldószer kipárolog a cseppből, így a csepp egyre jobban összezsugorodik. A csepp összetartásáért a felületi feszültség felelős, viszont az elektrosztatikus taszítás egyre jobban erősödik, mivel a cseppek egyre kisebbek. A csepp zsugorodása a Rayleigh-féle instabilitási határig folytatódik, ahol a felületi feszültség már 13

14 nem tudja kompenzálni az elektrosztatikus taszítóerőt, így Coulomb robbanás jön létre. Ha ez a folyamat elegendően sokszor megismétlődik, akkor a folyamat legvégén a mintánk ionizált molekuláit kapjuk meg [18]. 12. ábra: Ionizáció mechanizmusa Kvadrupól analizátor A kvadrupól analizátor felépítését tekintve 4 darab egymással párhuzamos rúdból áll. 13. ábra: Kvadrupól szerkezete Az egymással szemben lévő rudak elektromosan össze vannak kötve. Ezt egy finomműszeres technikával vezérelve, rádiófrekvenciás teret kapunk a rudak között. Ezen a 14

15 téren csak a megfelelő m/z töltésű ion haladhat át zavartalanul. Amikor az analizátort a mérés folyamán egy vagy több adott m/z értékkel jellemezhető ionok áteresztésére állítjuk be, SIM mérési üzemmódról beszélünk. A másik mérési lehetőség, hogy az analizátor egy meghatározott folyamat szerint végigpásztázza a teljes, előre megadott tömegtartományt, amit SCAN mérési módnak nevezünk Detektor A detektor feladata a becsapódó ionok számával arányos intenzitású jel szolgáltatása. Ion- vagy fotoelektron-sokszorozó detektorok terjedtek el leginkább. A detektor lemezébe becsapódó ionok elektronemissziót váltanak ki. A keletkező elektronok egy újabb elektródhoz érkezve újabb szekunder elektronokat vált ki. Ez a folyamat addig folytatódik amíg el nem érjük a megfelelő jel erősítést Vákuumrendszer A 14. ábra mutatja a vákuumrendszer szakaszos felépítését. A mai tömegspektrométerek legalább 2 fokozatú vákkumrendszerrel rendelkeznek. Az első pumpa általában egy rotációs szivattyú, míg a második többnyire turbomolekuláris szivattyú. A rendszer célja, hogy az ionizáció során keletkezett molekulák közepes szabad úthosszát megnöveljék annyira, hogy a keletkezett ionok többsége ütközés nélkül eljuthasson a detektorba Tandem tömegspektrometria A tömegspektrometriás detektálás legnagyobb előnye, hogy majdnem minden ionizálható anyag vizsgálható vele. Előnye még, hogy egyszeri detektáláson kívül szerkezeti információval is ellát. Hátránya, hogy destruktív detektor, így a vizsgált anyag nem marad meg eredeti formában. Tandem tömegspektrometriáról akkor beszélünk, ha anyaion-leányion kapcsolatot feltételezhető. Leányion az anyaionból származó fragmentáció után keletkezett kisebb tömegű ion. 15

16 14. ábra: Hármas kvadrupól tömegspektrométer A 14. ábrán látható hármas kvadrupól rendszerben valójában csak két kvadrupól található, a második kvadrupól egy hexapól. Ez a hexapól látja el az ütközési cella funkcióját. Inert gázzal ütköztetjük ionjainkat, és a fragmensek intenzitását figyeljük. A tömegspektrométeren belül megtalálható még egy oktopól is, az első kvadrupól előtt, ami az ionok megfelelő fókuszálásáért felelős Tandem tömegspektrometriás mérési technikák Az egyes technikák közötti különbségek a két kvadrupól mérési módjaiban különböznek. Mindkét kvadrupól képes SIM és SCAN módban is működni, így a technikák a következők: Technika Szülőion analízis Első kvadrupól SCAN Harmadik kvadrupól SIM 15. ábra: Szülőion analízis (Pecursor ion scan) 16

17 Technika Első kvadrupól Harmadik kvadrupól 16. ábra: Termékion analízis (Product Termékion analízis SIM SCAN ion scan) Technika Első kvadrupól Harmadik kvadrupól Állandó 17. ábra: Állandó semleges tömegvesztés (Constant-neutral semleges tömegvesztés SCAN SCAN loss scan) Technika Első kvadrupól Harmadik kvadrupól Kiválasztott ionfolyamat SIM SIM 18. ábra: Kiválasztott ionfolyamat követés követés (Selective Reaction Monitoring, SRM) Az említett technikákon kívül a készülék képes egyszerű SIM és SCAN mérési módokban is dolgozni. Ilyenkor az első kvadrupólnak és a hexapólnak érdemi szerepe nincs. A 18. Ábrán látható SRM technikát gyakran nevezik MRM technikának abban az esetben, ha egyszerre több átmenetet szimultán vizsgálunk a készülékkel. 17

18 3 Kísérleti rész 3.1 Az alkalmazott anyagok A következő standard anyagokat használtam: diclofenac-na (C 14 H 10 Cl 2 NNaO 2, Sigma Aldrich, CAS: ), ketoprofen (C 16 H 14 O 3, Sigma Aldrich, CAS: ), naproxen (C 14 H 18 O 2, Sigma Aldrich, CAS: ), ibuprofen (C 13 H 18 O 2, Sigma Aldrich, CAS: ), és az ibuprofen-d 3 (C 13 H 15 D 3 O 2, Dr. Ehrensorfer, CAS: ). Oldószerek tekintetében nagytisztaságú metanol (HPLC Grade, Merck), acetonitril (HPLC Gradient grade, Merck), és Milli-Q víz. Az eluens vizes fázisához 0,04% ecetsavat (Fluka) adtam. 3.2 Készülék A mintaelőkészítés megkönnyítése érdekében egy vákuumkádat (Visiprep, Supelco) használtam, ami gyorsítja a szilárd fázisú extrakciós lépést. Egy Agilent 1200 Series RRLC típusú folyadékkromatográfot, és egy Agilent 6410 QQQ ESI tömegspektrométert használtam a módszerfejlesztés során. A komponensek elválasztása egy Zorbax SB-C18 (50 mm x 2.1 mm, 1.8 μm) típusú oszlopon történt, amit a készülék termosztátjában helyeztem el. 3.3 Standard oldatok A törzsoldatokat oldással, majd hígítással készítettem el a szilárd standard anyagokból. Minden komponensből külön készítettem egy 2 mg/ml-es standard oldatot, majd ezekből a 20 μg/ml-es törzsoldatot, ami tartalmazta a mérendő komponenseket, kivéve a belső standardot. A mérések folyamán belső standardként Ibuprofen-d 3 -t használtam. A hígításokat metanollal készítettem, és az oldatokat 4 C-on, hűtőben tároltam. A kalibrációs tartomány öt különböző koncentrációjú kalibrációs pontot tartalmazott. Az oldószer 1:1 arányú metanol: víz, mivel a később említett minták, amiből történik az 18

19 injektálás megközelítőleg ugyanilyen összetételű oldószerben készültek. A koncentrációk a következők: 10, 150, 300, 450 és 600 ng/ml. 3.4 Mintaelőkészítés Szilárd fázisú extrakció Első lépésben a 100 ml térfogatú vízmintákhoz adalékoltam a megfelelő mennyiségű belső standardot 3 ng/ml-es koncentrációban. Mivel felszíni víz vakminta nem állt rendelkezésemre, így vakmintaként csapvizet használtam a módszer kifejlesztése során. A belső standard hozzáadása után ismert mennyiségre adalékoltam a mintákat a komponensekkel. Homogenizálást követően az SPE tölteteket felhelyeztem a vákuumkádra. Egyszerre 8 párhuzamos mintát lehet előkészíteni. A töltet kondicionálásához 3 különböző oldószert használtam; 3 ml acetonitril, 3 ml metanol, 3 ml Milli-Q víz, átfolyatása után következhetett a mintafelvitel. A 100 ml térfogatú mintákat megközelítőleg 10 ml/perc-es áramlási sebességgel áramoltattam át a patronon. A leoldáshoz használt oldószer minőségét illetően több fajta oldószert is kipróbáltam: acetonitrilt, etilacetátot, és metanolt. Ezek közül az utolsó volt a legjobb a kapott eredmények szempontjából, így a metanolt választottam. A komponensek leoldását 3x1 ml térfogatú részletekben végeztem metanollal. A metanolos oldatokat a vákuumkádban elhelyezett 3 ml-es mintaszedőkbe engedtem. Az így kapott oldatokat egy bepárlási lépés követte, ennek leírása a es pontban található. 19. ábra: A mintaelőkészítésre használt készülék ábra: A használt SPE patronok

20 A minta térfogatának meghatározása Elsődleges szempont volt a minta nagyfokú dúsítása, a kimutatási határ csökkentése. Vizsgálataim 10 cm 3 -től 1000 cm 3 -es tartományig terjedtek ki. Tapasztalataim azt mutatták, hogy a 10 cm 3 -es mintamennyiségnél nem tudjuk elérni a kívánt dúsítási értéket, míg 1000 cm 3 -nél az extrakciós patron folyamatos eldugulása miatt előszűrést kellett alkalmaznom. A megfelelő előszűrő kiválasztásával a teljes 1000 cm 3 -ert át lehetett folyatni a tölteten, viszont a kapott eredmények azt támasztották alá, hogy az előszűrő nem teljesen inert, mivel megkötődik rajta a vizsgált komponensek egy része. Az optimált mintamennyiség 100 cm 3 lett, mivel nem kell alkalmazni előszűrést és el lehet érni a kívánt dúsítási értéket is Elúciós térfogat meghatározása Miután megállapítottam, hogy a metanol a megfelelő elúciós oldószer, a komponensek maximális visszanyerése és a gyors bepárlás érdekében meg kellett vizsgálni a legmegfelelőbb mintaleoldási térfogatot. Ezt ismert mennyiségre adagolt mintával hajtottam végre. Felvittem a töltetre az ismert mennyiségű anyagokat, majd 5x1 ml-es frakciókat szedtem. A 21. ábra szemlélteti a kapott értékeket ketoprofen naproxen diclofenac ibuprofen ábra: Metanol leoldási térfogatának az optimálása

21 Az ábrából jól kivehető, hogy a 3. frakció után már érdemi növekedés a kinyerésben nem észlelhető, így a leoldást 3x1 ml-es részletekben végeztem a továbbiakban Bepárlás A 3 ml térfogatú metanolos mintákat elhelyeztem a bepárló készülékbe. Egyszerre 8 mintát lehetett elkészíteni párhuzamosan a készülék segítségével. Szobahőmérsékleten a mintákat megközelítőleg 500 μl-re pároltam be N 2 gáz alatt. Az 500 μl-es végtérfogat mellett azért döntöttem, mert ez a mintamennyiség még megfelelően kezelhető. A pontos térfogatra azért nem volt szükség, mert a minták tartalmaztak belső standardot. Az injektálást azonban nem lehetett elvégezni ebből az 500 μl-ből, mivel az így kapott oldat erősebb elúciós oldószer, mint az alkalmazott eluens, így a csúcsok eltorzulhatnak, esetleg felhasadhatnak. A ábrák mutatják a tiszta metanolból injektált mintát és a 50:50% metanol-víz összetételű oldószerből injektált minta kromatogramjait. 22. ábra: Tiszta metanolból injektált standard 23. ábra: 1:1 arányú metanol:vízből injektált standard Ezért a bepárlás után kapott metanolos oldatokhoz 500 μl Milli-Q vizet pipettáztam a megfelelő oldószererősség beállítása végett. 21

22 Az oldószer összetétel hatása a kromatogramra Bepárláskor a pontos 500 μl végtérfogat nem biztosítható, ezért a hozzáadott 500 μl Milli-Q víz után sem biztos, hogy 1:1 arányú metanol:víz oldószertartalmú oldatot eredményez. Kísérletet végeztem különböző oldószer összetételű, a mérendő komponenseket 200 ng/ml, a belső standardot pedig 300 ng/ml koncentrációban tartalmazó mintákra. 30, 50, és 70% metanolt tartalmazó vizes oldatokból injektáltam feltérképezve a csúcsokra gyakorolt hatását. 24. ábra: Különböző oldószer összetételű oldatokból injektált minták A 24. ábrán 3 kromatogramot láthatunk egymásra fektetve. Megállapítható, hogy 30-70% metanol tartalmú minták esetén az oldószer összetétel nincs hatással a kromatográfiás csúcsokra. 1. táblázat: Az egyes oldatok oldószer összetétele Minta sorszáma Metanol Milli-Q víz 1. 30% 70% 2. 50% 50% 3. 70% 30% 22

23 3.5 Kromatográfiás körülmények LC körülmények - Eluens: 55:45, acetonitril: Milli-Q víz (0.0.4% ecetsav), izokratikus - Áramlási sebesség: ml/perc - Mintatér termosztát: 4 C - Oszloptér termosztát: 60 C - Injektálási térfogat: 10 μl MS körülmények - Ionforrás hőmérséklete: 200 C - Gázáram: 9 l/perc - Porlasztónyomás: 40 psi - Kapilláris feszültség: 3500 V - Polaritás: Negatív 25. ábra: 150 ng/ml-es standard oldat és 300 ng/ml belső standard 23

24 3.5.1 Oszloptermosztát hőmérsékletének optimálása Az optimálást 300 ng/ml koncentrációjú standard oldattal végeztem. 4 injektálást végeztem 4 különböző termosztát hőmérsékleten. A vizsgált hőmérsékletek: 30 C, 40 C, 50 C, 60 C. A 26. ábrán láthatóak a kapott kromatogramok. 26. ábra: Különböző termosztát hőmérsékleten mért kromatogramok Mivel az egyik célom az analízisidő csökkentése volt, és a legszebb csúcsalakokat is 60 C-on kaptam, a mérésekhez 60 C-ra rögzítettem a termosztát hőmérsékletét Detektálási paraméterek vizsgálata A tömegspektrometriás detektálás során az egyes komponensek standard oldatainak injektálásával állítottam be a megfelelő paramétereket. Vizsgáltam a fragmentor feszültséget, az ütközési cella feszültségét, és az ionforrás hőmérsékletét. Az MRM átmeneteket (Multiple Reaction Monitoring) a következő módon választottam meg: 24

25 1: Injektáltam az egyes komponensek standard oldataiból, amelyekről SCAN módban tömegspektrumokat vettem fel. Kiválasztottam az intenzív deprotonált molekulaionokat. 2: A fragmentor feszültségét változtatva vizsgáltam mely értéknél a legintenzívebb a csúcs, majd ezt az értéket használtam tovább. 3: Következő lépésként termékion analízis módban fragmentáltam a deprotonált molekulaionokat és megvizsgáltam a keletkező leányionokat. Kiválasztottam a legmagasabb tömegű és intenzitású leányiont. 4: A kiválasztás után az ütközési cella feszültségét változtatva megfigyeltem a leányion intenzitásának a változását. A legnagyobb intenzitást eredményező ütközési cella feszültség mellett döntöttem. 5: Az optimálást minden komponens esetében elvégeztem, majd táblázatba írtam a kapott eredményeket. 2. táblázat: A detektálási paraméterek táblázatosan Komponens Dwell Collision Anyaion Leányion Fragmentor neve time (ms) energy Polaritás Diclofenac negatív Naproxen negatív Ketoprofen negatív Ibuprofen negatív Ibuprofen-d negatív 3.6 Validálás A validálási lépéseket a 3.4.1, 3.4.2, és 3.5-ös fejezetekben leírt módszer szerint hajtottam végre. 25

26 3.6.1 Szelektivitás Egy adott módszer szelektivitásán értjük, hogy képes megfelelően meghatározni a komponenseket az adott zavaró körülmények mellett. A ábrák mutatják a vakminta és a 300 ng/ml-re adalékolt minta kromatogramjait. 27. ábra: Vakminta 28. ábra: 300 ng/ml-re adalékolt minta A két ábrából jól látható, hogy a kifejlesztett módszer kellően szelektív az összes komponensre nézve Linearitás Egy adott módszer linearitásán értjük, hogy az analitikai görbe meghatározott tartományában, a linearitási tartományban egyenesnek feltételezhető. A linearitást a teljes tartományt lefedő koncentrációjú kalibrációs pontok elemzésével vizsgáljuk. Ezekre a pontokra a legkisebb négyzetek módszere szerint egyenest illesztünk, az úgynevezett regressziós egyenest és meghatározzuk a paramétereit. A módszeremben az illesztést 1/x-es súlyozással végeztem. A kalibrációs tartomány minden komponensre nézve ng/ml. A kalibrációs egyenesek grafikonjai és reziduálisai a ábrákon láthatók. Az illesztett egyenes paramétereit a 3. táblázat tartalmazza. 26

27 29. ábra: Ketoprofen kalibrációs egyenese 31. ábra: Diclofenac kalibrációs egyenese 30. ábra: Naproxen kalibrációs egyenese 32. ábra: Ibuprofen kalibrációs egyenese Ketoprofen reziduálisai Diclofenac reziduálisai ábra: Ketoprofen reziduálisai 35. ábra: Diclofenac reziduálisai Naproxen reziduálisai Ibuprofen reziduálisai ábra: Naproxen reziduálisai 36. ábra: Ibuprofen reziduálisai

28 3. táblázat: Az illesztett egyenesek paraméterei Komponens neve Tengelymetszet Meredekség R 2 érték ketoprofen naproxen diclofenac ibuprofen átlag: Érzékenység Egy adott módszer érzékenységén (S) értjük a kalibrációs egyenes meredekségét, tehát az egységnyi koncentrációváltozásra (c 2 -c 1 ) eső jelváltozást (x 2 -x 1 ): S = (c 2 -c 1 )/(x 2 -x 1 ) Az érzékenységadatokat a 3. táblázat tartalmazza Torzítatlanság Egy adott módszer torzítatlanságán azt értjük, hogy a módszer rendszeres hibával terhelt-e. Torzítatlanság vizsgálatakor egy vakmintához ismert mennyiségű vizsgálni kívánt komponens adalékolunk, végrehajtjuk a mintaelőkészítést, és megmérjük az így kapott oldatokat. A torzítatlanságot a kapott mérési eredmények az adalékolás alapján várt eredmények százalékában megadva jellemezhetjük. Méréseim során 3 különböző koncentrációszinten 5 párhuzamos mintaelőkészítéssel vizsgáltam a komponensek torzítatlanságát. A 4. táblázat foglalja össze a kapott eredményeket. Az eredmények az 5 párhuzamos mérés átlagértékét mutatják.

29 4. táblázat: A mért torzítatlanság adatok Ketoprofen Adalékolva (ng/ml) torzítatlanság % % % Naproxen Adalékolva (ng/ml) torzítatlanság % % % Diclofenac Adalékolva (ng/ml) torzítatlanság % % % Ibuprofen Adalékolva (ng/ml) torzítatlanság % % % Pontosság Egy adott módszer pontosságán azt értjük, hogy a módszer véletlen hibával terhelt-e. Pontosság vizsgálatakor hasonló módon készítettem elő az oldatokat a pontban leírtakkal. Vizsgáltam az adott szintre adalékolt minta 5 párhuzamos oldatának a pontosságát (az eredményeket RSD%-ban adtam meg). 29

30 5. táblázat: A mért pontosság adatok egy napon belül Ketoprofen Adalékolva (ng/ml) RSD% Naproxen Adalékolva (ng/ml) RSD% Diclofenac Adalékolva (ng/ml) RSD% Ibuprofen Adalékolva (ng/ml) RSD% Napok közötti pontosságvizsgálatot is végeztem, a mintákat 3 ng/ml-es koncentrációszintre adalékolva 3 különböző napon 5 párhuzamos mintaelőkészítéssel. (A szórást a 15 mintából számoltam) 6. táblázat: Napok közötti pontosság adatok Ketoprofen 300ppb re adalékolva Naproxen 300ppb re adalékolva Diclofenac 300ppb re adalékolva Ibuprofen 300ppb re adalékolva RSD% 6.8 RSD% 8.6 RSD% 9.8 RSD%

31 3.6.6 Kimutatási és meghatározási határ A kimutatási határ (LOD: Limit of detection) és a meghatározási határ (Limit of quantitation) kimérését a megfelelő standard oldatok hígításával végeztem. A kimutatási határ minden komponensre nézve 0,01 ng/ml, míg a meghatározási határ 0,1 ng/ml. 4 Összefoglalás Kutatásom során sikerült kifejlesztenem egy LC-MS-MS módszert felszíni vizekben ng/ml koncentrációban jelenlévő nem-szteroid gyulladáscsökkentők meghatározására. A vizsgált komponensek: Ketoprofen, Naproxen, Diclofenac, Ibuprofen. A nagyfokú szelektivitás eléréséhez a tömegspektrométer MRM módszerét használtam. A módszer további előnye, hogy nem kell származékképzést alkalmazni, ezzel is csökkentve az analízisidőt. Módszerfejlesztésem során többek között vizsgáltam a megfelelő mintatérfogatot, az elúciós oldószer minőségét és leoldási térfogatát, a bepárlás során az oldószer összetételét. Műszeres oldalról meghatároztam a megfelelő oszloptermosztát hőmérsékletet, vizsgáltam az ionforrás hőmérsékletét és a detektálás paramétereit. Vizsgáltam a módszer analitikai teljesítményjellemzőit: szelektivitást, linearitást, érzékenységet, torzítatlanságot, pontosságot, kimutatási és meghatározási határt. A teljes meghatározás mintaelőkészítéssel együtt megközelítőleg 120 percet vesz igénybe. 5 Köszönetnyílvánítás Köszönettel tartozom Dr. Eke Zsuzsannának, Dr. Torkos Kornélnak, Csernyák Izabellának, és Tölgyesi Lászlónak, akik értékes szakmai tapasztalatukkal segítették a dolgozatom megírását. Köszönettel tartozom még a Wessling Kht-nek és a Kromat Kft-nek a rendelkezésemre álló műszerek és az eszközök biztosításáért. 31

32 6 Irodalomjegyzék [1] Borvendég J., Váradi A.: Hatóanyagok készítmények terápia, Melinda Kiadó, [2] Lázcsillapítók és fájdalomcsillapítók, [3] Tőke L., Szeghy L.: Gyógyszerkémia II., Tankönyvkiadó, Budapest, [4] Gyógyszerek, hatóanyagok, [5] Nem- szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszerek, [6] Xiu-Sheng Miao, B. G. Koenig, C. D. Metcalfe: J. Chromatogr. A 952 (2002) [7] Gros, M. Petrovi c, D. Barceló: Talanta 70 (2006) [8] J. L. Santos, I. Aparicio, E. Alonso, M. Callejón: Analytica Chimica Acta 550 (2005) [9] F. Sacher, F. T. Lange, Heinz-Jürgen Brauch, I. Blankenhorn: J. Chromatogr. A 938 (2001) [10] A. Kloepfer, J. B. Quintana, T. Reemtsma: J. Chromatogr. A 1067 (2005) [11] S. Öllers, H. P. Singer, P. Fässler, S. R. Müller: J. Chromatogr. A 911 (2001) [12] T. A. Ternes: Trends in analytical chemistry, vol. 20, no. 8, [13] M. Möder, S. Schrader, M. Winkler, P. Popp: J. Chromatogr., A 873 (2000) 95. [14] J. Radjenovic, M. Petrovic, D. Barceló: Trends Anal. Chem. 26 (2007) [15] L. Araujo, J. Wild, N. Villa, N. Camargo, D. Cubillan, A. Prieto: Talanta 75 (2008) 111. [16] Á. Sebők, A. Vasanits-Zsigrai, Gy. Palkó, Gy. Záray, I. Molnár-Perl: Talanta 76 (2008) [17] Balla Gy.: Tömegspektrometria, [18] Török J., dr. Kéki S., dr. Deák Gy., dr. Zsuga M.: Műanyag és gumi, évfolyam, 8. szám. 32