A glikán-analízis a glikoproteinek glikán részének vizsgálatára szolgáló elemzés. Ez tartalmazhatja:

Átírás

1 01/2011: GLIKOPROTEINEK GLIKÁN-ANALÍZISE 1. BEVEZETÉS A glikán-analízis a glikoproteinek glikán részének vizsgálatára szolgáló elemzés. Ez tartalmazhatja: a teljes glikoprotein elemzést; a glikoform fehérjék elválasztását és meghatározását; a glikoproteinek enzimatikus kezelése után nyert glikopeptidek analízisét; a glikoprotein kémiai vagy enzimatikus kezelése után felszabaduló glikánok analízisét. A monoszaharidok elemzése kiegészítheti a glikán-analízissel nyert információkat. A glikoziláció meghatározó szerepet játszhat a bioterápiás szerek funkciójában, farmakokinetikájában, farmakodinamikájában, stabilitási és immungenetikai sajátságaiban. A glikoziláció, ellentétben a transzkripcióval, nem templát-vezérelt enzimatikus módosító folyamat, ami glikán-heterogenitást eredményez. A gyártási eljárás is befolyásolja a glikán-heterogenitást. Ezért a glikoprotein glikán-analízise fontos vizsgálat a glikoprotein-mintázat variációinak azonosításában és/vagy a glikoprotein mintázat állandóságának monitorozásában a gyártás során. A glikán-elemzés összehasonlító eljárás is lehet, mert a kapott információ, a megegyező módon kezelt referenciaanyaghoz hasonlítva, igazolhatja a készítmény állandóságát. Ez a fejezet a glikoproteinek glikán-elemzésére alkalmazott megközelítéseket, valamint a módszerek alkalmazásához szükséges követelményeket és a módszerek validálását ismerteti. A glikán-elemzés nem egyedüli általános módszer, hanem magában foglalja a speciális eljárások alkalmazását és mindegyik egyedi glikoprotein fajlagos glikán-térképének meghatározását is. A speciális eljárásokat ezért a vonatkozó egyedi cikkelyek tartalmazzák. 1-1.FEHÉRJE-GLIKOZILÁCIÓ A fehérjékben az enzimatikus glikozilációnak három fő típusa ismert: az N-glikoziláció, az oligoszaharidoknak az aszparagin terminális amid-csoportján levő nitrogénhez való kapcsolódása;

2 az O-glikoziláció, az oligoszaharidoknak a szerin, treonin és/vagy hidroxiprolin hidoxil csoportjaihoz való kapcsolódása; a C-glikoziláció, ami egy α-mannopiranóznak a triptofán indolgyűrűjének C2- szénatomjához való kapcsolódása. Nem-enzimatikus kapcsolódások pl. glikáció is ismertek, amikor a fehérjéket redukáló cukrokkal együtt inkubálják. Ez a fejezet a glikoprotein-gyógyszerekben leggyakrabban előforduló, N-, és O-kapcsolt glikozilációk meghatározására alkalmazott analitikai módszereket írja le A FEHÉRJE-GLIKOZILÁCIÓ HETEROGENITÁSA A glikoproteinek előállítása során a glikán-heterogenitás különböző fokozatai jelenhetnek meg. Ez a heterogenitás a következő eltérésekből eredhet: a kötőhelyek lefoglaltságának foka (teljes, részleges, le nem foglalt); a glikoziláció típusa (N- vagy O- kapcsolt); az oligoszacharid szerkezete (kiterjedések, elágazások és kötések). A glikoziláció heterogenitása valamely fajlagos glikoprotein számára egész készlet glikoformot eredményez. Ezek a variációk azért lépnek fel, mert - ellentétben a transzkripcióval és a transzlációval - a glikozilálás nem templát-függő poszttranszlációs módosítási folyamat. A glikozilációs-mintázat egy adott helyen számos tényezőtől függ, beleértve a Golgi apparátusban és az endoplazmás retikulumban található glikoziltranszferázok és exo-glikozidázok sejtspecifikus és/vagy növekedésfüggő hozzáférhetőségét. A fehérje-glikozilálást befolyásolja a fehérje szerkezete, a gyártási eljárás, a gazda-vektor expressziós rendszer és a sejttenyésztés körülményei is. 2. A GLIKÁN-ANALÍZISRE SZOLGÁLÓ ELJÁRÁSOK A glikoziláció heterogenitását 4 különböző és egymást kiegészítő megközelítéssel lehet meghatározni: az ép glikoprotein analízisével; a glikopeptidek analízisével; a felszabaduló glikánok analízisével; a monoszaharidok analízisével.

3 GLIKOPROTEIN AZ ÉP GLIKOPROTEINEK ANALÍZISE liánok MS IEF CE Ioncserélő kromatográfia Méretkizárásos kromatográfia SDS-PAGE GLIKOPEPTIDEK ANALÍZISE közvetlen elemzés proteolízis Elválasztás a közvetlen elemzés előtt LC/CE MS Az emésztett termék deglikozilálása ELŐKEZELÉS (izolálás és tisztítás) ha szükséges A FELSZABADULÓ GLIKÁNOK ANALÍZISE Jelöletlen glikánok analízise Glikánok felszabadu -lása O- és/vagy N-kapcsolt glikánok: enzimek vagy vegyszerek deszializálás Jelzett glikánok analízise Glikánok jelölése HPAEC-PAD PGC-MS MS kezelés exoglikozidázzal Elválasztás LC/CE MS CE MS LC MONOSZAHARIDOK ANALIZISE savas hidrolízis HPAEC-PAD PGC-MS fluorofór jelölés LC CE kolorimetriás módszerek

4 Ábraaláírások: CE: kapilláris elektroforézis; HPAEC-PAD: magas ph-n végzett anioncserélő kromatográfia pulzus amperometriás detektálással; IEF: izoelektromos fókuszálás; LC:folyadékkromatográfia; MS: tömegspektrometria, PGC: pórus grafit-kromatográfia SDS-PAGE: nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis ábra. A glikán-analízis eljárásainak áttekintése Ez a fejezet az N- és O-kapcsolt glikánokat tartalmazó glikoproteinek glikán-analízisére használt módszereket és az általános követelményeket adja meg. A glikán-analízis általában egy többlépéses eljárás. A glikán-analízisre számos módszertan létezik. Ez a változatosság a glikán-szerkezetek változatosságának és bonyolultságának, valamint a rendelkezésre álló technológiák és meghatározási módszerek valamint a szükséges információk szintjétől függő megközelítések széles tartományának következménye. A ábra a glikán-analízisnek azon analitikai eljárásairól ad áttekintést, amelyek a kiválasztott megközelítéssel/sekkel alkalmazhatók. A glikánok szerkezetétől és eredetétől függően ugyanazon technikáknak és feltételeknek számos változata áll rendelkezésünkre. Izolálás és tisztítás. Izolálásra és tisztításra szükség lehet az eljárást befolyásoló segédanyagokat tartalmazó ömlesztett gyógyszeranyagok vagy gyógyszerformák esetében, amennyiben ez követelmény az egyedi cikkelyben megtalálható AZ ÉP GLIKOPROTEIN ANALÍZISE Az ép glikoprotein analízise a glikoproteinek glikozilálásának általános mintázatáról ad információt. Amennyiben a molekula nagyméretű, és többszörös glikozilációs helyet tartalmaz, ez a megközelítés csak korlátozott információt szolgáltat. Olyan módszerek, mint a kapilláris elektroforézis (CE) (2.2.47) és a tömegspektrometria (MS) (2.2.43) használhatók. Méreten alapuló technikák, mint például a méretkizárásos kromatográfia ( ) és a nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) ( ) információt szolgáltathatnak a fehérje glikoziláltsági állapotáról. Ha a szializáció mértéke jelentősen hozzájárul a glikoprotein biológiai aktivitásához, ioncserélő kromatográfia (2.2.46), izoelektromos fókuszálás (IEF) (2.2.54) vagy CE (2.2.47) alkalmazható a szializálás nyomonkövetésére. A technikát úgy kell kiválasztani, hogy az alkalmas legyen a szializáció foka és a készítmény bioaktivitása közötti megbízható korreláció elérésére GLIKOPEPTIDEK ANALÍZISE A glikopeptidek analízise információt ad a hely-specifikus glikozilálási tulajdonságokról, a kötőhely lefoglaltságának mértékéről és az oligoszaharid szerkezetekről. Az analízis a

5 glikopreoteinek enzimatikus bontását is magában foglalja. A fehérje alaplánc (gerinc) helyspecifikus hasításának megközelítéseit a Peptidtérkép-vizsgálat című általános fejezet tartalmazza. A glikoprotein proteolízisét követően a következő megközelítések választhatók. Közvetlen analízis tömegspektrometria (MS) (2.2.43) alkalmazásával. Figyelni kell arra, hogy a glikoprotein jelet más peptidek jelenléte nem nyomja-e el azokban az esetekben, amikor a glikoprotein a teljes peptid-elegynek csak kis hányada, és amikor a jel erőssége kisebb, mint a nem glikozilált peptideké. Az MS analízist megelőző elválasztás. Ez a kiegészítő lépés a fent említett problémát megoldja. A dúsítási vagy frakcionálási technikák a közvetlen analízissel párhuzamosan, vagy egymást követően alkalmazhatók. Olyan elválasztási technikák, mint a folyadékkromatográfia (LC) (2.2.29) és a kapilláris elektroforézis (CE) (2.2.47) megfelelőek. Ezeket a technikákat az MS-sel kapcsolva is lehet alkalmazni, lehetővé téve az online MS mérést. A glikopeptidek deglikozilálása. A glikoprotein különböző glikozilálási helyeinek azonosítását lehetővé teszi az ép glikoprotein proteolitikus emésztéssel nyert peptid-térképeinek összehasonlítása azokkal a térképekkel, amelyeket úgy nyertek, hogy a glikoproteineket a proteolitikus emésztés előtt, vagy ezt követően glikozilálták. A peptid tömege információt adhat a glikozilálási helyekről, az ép glikopeptid és a deglikozilált glikopeptid tömegének számított különbsége pedig információt szolgáltathat a kapcsolt glikánok összetételéről és heterogenitásáról. A fehérje alaplánc deglikozilálásának megközelítéseit a fejezet tartalmazza. Az elválasztási lépést a deglikozilálás előtt vagy után is el lehet végezni FELSZABADULÓ GLIKÁNOK ANALÍZISE A felszabaduló glikánok analízise megfelelő módot ad arra, hogy információt nyerjünk a fehérjében jelen levő (kettős-hármas-, négyes elágazási pontot antennát - tartalmazó) különféle glikánok mennyiségéről. A szializáció mértéke is vizsgálható ebben a lépésben. A kiválasztott módszertől függően előzetes derivatizálás/jelölés szükséges lehet a glikánok kimutatásához. A felszabaduló glikánok analízise általában magában foglalja a glikánoknak a reakcióelegyből történő felszabadulását és tisztítását, amit, ahol szükséges, a glikánok jelölése/derivatizálása követ; ezután történik a glikánok profilezése (frakcionálással vagy szeparációval) A glikánok felszabadulása A glikánok felszabadulására alkalmazott megközelítés kiválasztása a vizsgált glikoproteintől függ. A hasításra alkalmazott anyagot a szükséges hasítás típusa és a szükséges információ szintje szerint választják ki. Enzimatikus vagy kémiai hasítás alkalmazható. A táblázat az enzimatikus hasító anyagokat és specificitásukat mutatja be, nem mindenre kiterjedően. Az emésztési hatékonyság általában a fehérjén elhelyezkedő glikánok hozzáférhetőségétől függ, így a fehérjét denaturálni lehet annak érdekében, hogy a glikozilációs hely hozzáférése a

6 legnagyobb legyen, kivéve, ha a felszínen elhelyezkedő és elfedett glikánok közötti különbségtétel elvárás a rendszerben. Kémiai hasító anyagokat is lehet alkalmazni, például hidrazint vagy lúgos bórhidridet a β- eliminálásra Glikánok analízise A felszabaduló glikánokat kromatográfiás, elektroforetikus vagy tömegspektrometriás technikákkal vagy általában e technikák kombinált alkalmazásával lehet analizálni vagy profilezni. A módszerek választékát a glikánok természete, és a megkövetelt információ szintje szerint lehet csoportosítani. A glikánok analízise a fehérjéken jelen levő különböző glikánok mennyiségéről (nagy mannóz tartalmú, hibrid, komplex) ad információt. Az elágazó szerkezetek relatív mennyiségére vonatkozó információhoz a deszializált glikánok analízisével juthatunk. Elválasztási lépésre is szükség lehet. Ez a lépés, köztes technikaként, a folyadékkromatográfiát ( ) és a kapilláris elektroforézist ( ) foglalja magában. A folyadékkromatográfia ( ), vagy preparatív módon használható az egyedi frakciók gyűjtésével (általában jelölésre is szükség van), vagy közvetlen módon kapcsolható a tömegspektrometriával (2.2.43) táblázat. Példák az enzimatikus hasító anyagokra

7 Anyagok Specifikusság N-kapcsolt glikánok felszabadulása Peptid-N 4 -(N-acetil-β-glukózaminil)-aszparagin N 4 -(N-acetil-β-D-glukózaminil)-aszparagin amidáz (EC ) maradvány hidrolízise, amelyben a glukózamin maradványt tovább lehet glikozilálni, hogy (szubsztituált) N-acetil-β-D-glukózaminilamint és aszpartát-maradványt tartalmazó peptidet nyerjünk - Peptid-N-glikozidáz F (PNGáz F) N-glikán lánc felszabadulása, de nincs (α1-3)- kapcsolt mag-fukózt tartalmazó N-glikán lánc felszabadulás - Peptid-N-glikozidáz A (PNGáz A ) (α1-3)-kapcsolt mag-fukózt tartalmazó N-glikán lánc felszabadulása Mannozil-glikoprotein endo-β-nacetilglukózaminidáz (EC ) nagy mannóz tartalmú glikopeptidekben N,N -diacetilkitobiozil egység endohidrolízise /glikoproteinekben amelyek az - [Man(GlcNAc) 2 ASN szerkezetet tartalmazzák -Endo-β-N-acetilglukózaminidáz F (endo F) Nagy mannóz-tartalmú, hibrid és komplex -Endo-β-N-acetilglukózaminidáz H(endo H) O-kapcsolt glikánok felszabadulása Glikopeptid α-n-acetilgalaktózaminidáz (EC )* oligoszaharidok felszabadulása Nagy mannóz-tartalmú, hibrid oligoszaharidok felszabadulása A terminális D-galaktozil-N-acetil-α-Dgalaktózaminid maradvány hidrolízise * Ennek az enzimnek korlátolt a felhasználhatósága a nagyfokú szubsztrát-specificitása miatt.

8 Nem jelzett glikánok analízise A natív glikánokat magas ph-jú anioncserélő kromatográfiával, pulzáló amperometriás detektálást alkalmazva (HPAEC-PAD), pórus grafit kromatográfiával (PGC) és MS-sel (2.2.43) lehet analizálni. A HPAEC-PAD nagy érzékenységű módszer és egyes kötési izomereket is el tud választani. A különböző oligoszaharid szerkezetekre vonatkozóan a különböző jelek válaszfaktora nem azonos. A glikánok abszolút tömeg-meghatározása csak abban az esetben lehetséges, ha az oligoszaharidok referencia könyvtára rendelkezésünkre áll. A mennyiségi elemzést vagy a vizsgált anyag jól meghatározott referenciaanyagával történő összehasonlítással végezhetünk, vagy minden egyes glikáncsúcs területét a térképen szereplő összes glikáncsúcs területének összegére vonatkoztatjuk. A PGC-t a natív glikánok elkülönítésére is fel lehet használni, mert szelektivitása nagyobb, mint a konvencionális nem-poláris oszlopoké. A PGC-elektrospray-ionizációval kombinált MS technika is alkalmazható a glikánok közvetlen analízisére Jelzett glikánok analízise A glikánok jelölése Az elvégzett derivatizálások típusa a glikánok meghatározására használt módszertől UV, vagy fluoreszcens jel függ. A fluoreszcens jelöléssel kombinált származékképzés a legáltalánosabban használt technika a glikánok redukáló végén történő, reduktív aminálással végzett jelölésére. Minden egyes mono-, és oligoszaharidra illeszthető egy jelölés, ily módon lehetővé téve a moláris mennyiségek meghatározását. A táblázat az általánosan használt fluoreszcens jelölések és a megfelelő analitikai technikák nem teljes körű listáját mutatja táblázat Példák a fluoreszcens jelölésekre és a megfelelő analitikai technikákra Név Betűszó Analitikai technika 2-aminobenzoesav 2-AA LC (2.2.29), MS (2.2.43) 2-aminobenzamid 2-AB LC (2.2.29), MS (2.2.43) 2-aminopiridin 2-AP LC (2.2.29), MS (2.2.43) 2-amino-9(10H)-akridinon AMAC Gél-elektroforézis (2.2.23) Trinátrium-8-aminopirén- 1,3,6-triszulfonsav APTS CE (2.2.47)

9 A glikánok permetilálását szintén lehet használni abban az esetben, ha a kimutatásra kizárólag MS-t (2.2.43) alkalmaznak. Ez a módszer az oligoszaharidok metilálásán alapul. Jelzett glikánok analízise A jelzett glikánokat különféle analitikai technikákkal, mint LC (2.2.29) CE ( ) és MS (2.2.43), lehet vizsgálni. A glikánok elválaszthatósági tulajdonságai szerint a glikánokat megfelelő jelölést alkalmazva számos LC rendszerrel ( ) lehet profilezni, és meghatározni a mennyiségüket: fordított fázissal (a hidofób tulajdonság alapján szétválasztva), normál fázissal (méret szerinti szétválasztással) és anioncserével (töltés szerint szétválasztva) MONOSZAHARID-ANALÍZIS A monoszacharid-analízis a glikoprotein monoszacharid-összetételéről ad felvilágosítást. A monoszacharidok analízisét vagy kolorimetriás vagy elválasztási technikákkal lehet elvégezni Kolorimetriás módszerek A kémiai festésen alapuló kolorimetriás módszerek a fajlagos cukorosztályok, mint a sziálsavak, semleges cukrok, illetőleg a hexózaminok mennyiségéről adnak felvilágosítást Elválasztási módszerek Az elválasztási módszerek segítségével információt nyerhetünk a teljes monoszacharid-összetétel mennyiségéről. A módszerek az analízis előtt az ép glikoprotein vagy a felszabaduló glikánok oligoszaharid láncának savas hidrolízises előkezelését igénylik. A sziálsav felszabadításához enyhe savas hidrolízist vagy enzimes kezelést alkalmaznak. A hidrolízis-lépésjelentős variabilitást okozhat, emiatt készítmény esetén specifikus validálásra is szükség lehet. A monoszaharidok elválasztása és mennyiségi meghatározása a következőket foglalja magában: a HPAEC-PAD és a PGC-MS használatát, ami lehetővé teszi a natív monoszaharidok (sziálsavak, semleges cukrok és cukoralkoholok) moláris mennyiségének meghatározását; a monoszaharidok fluorofór jelölését, amelyet elválasztási technika, mint például fordítottfázisú vagy ioncserélő kromatográfia vagy CE követ. 3. AZ ADATOK ÉRTÉKELÉSE ÉS ELEMZÉSE A glikán-analízisre alkalmazott analitikai módszerekből nyert adatokat 3 különböző célból lehet elemezni és értékelni: az egyedi szerkezetek vagy szerkezet-családok azonosságának igazolására; a vizsgált anyag minőségi megfelelésének igazolására;

10 a vizsgált anyag mennyiségi megfelelésének igazolására. Az analízis minden egyes szintjén, a referenciaanyagokra, valamint a módszerfejlesztésre vonatkozó sajátos megfontolásokat tartalmazza a 4. illetve az 5. fejezet AZ EGYEDI SZERKEZETEK VAGY SZERKEZET-CSALÁDOK AZONOSSÁGÁNAK IGAZOLÁSA Valamely glikán-analízis módszernek analitikai célja lehet egy egyedi monoszaharid (például sziálsav, fukóz), valamely meghatározott oligoszaharid szerkezet (például tertaszializált, négy elágazási pontot tartalmazó glikán) vagy közös analitikai tulajdonsággal rendelkező szerkezeti családok (például tertaszializált, három elágazási pontot tartalmazó glikánok, azonos töltésű glikoprotein izomerek) elemzése. Az analitikai azonosság igazolása alapvető fontosságú az elemzésében és az adatok értékelésében, ezt a molekulaszerkezet igazolásával, vagy megfelelő referenciaanyaggal történő összehasonlítással lehet elérni Az azonosság teljes mértékű igazolása A glikán-szerkezetek azonosságának teljes mértékű igazolását általában, a termék kifejlesztése során elvégzik, így nem szükséges a rutin analízis tárgyát képeznie. Az analitikai azonosságot a molekula ismert molekuláris tulajdonsága alapján adják meg. Az egyedi szerkezetek ilyen abszolút azonosítása enzimatikus és kémiai reakciókat, elválasztási technikákat és online vagy offline meghatározási módszereket felhasználó többlépéses megközelítést kívánhat meg. Általában a szerkezet-meghatározás végső alapjaként, megfelelő tömegspektrometriás módszert alkalmazva, a molekulaionok töltés-tömeg arányát használják fel Az azonosság összehasonlító igazolása Az analitikai módszer rutin alkalmazása során az analitikai minta azonosságát bizonyítani lehet a folyamat, vagy rendszeralkalmassági referenciaanyagokkal történő összehasonlítással. A referenciaanyagokat ismert, jól jellemzett glikoproteinekből nyerhetjük, amelyeket a vizsgált készítménnyel azonos általános osztályból (például komplex N-kapcsolt glikoproteinhez való fetuin) nyertek, vagy származhatnak a vizsgált készítmény jól jellemzett, referenciaanyagként használható gyártási tételéből. A szerkezeti azonosság összehasonlító igazolására a következő azonosítások alkalmazhatók: a retenciós idők nagyfokú validált reprodukálhatósága esetén az abszolút retenciós idők alkalmazhatók a pontos azonosítására; vagy egy glikán-markert lehet a vizsgálati szekvenciák elejére és végére injektálni, és a retenciós idők bármilyen elcsúszása ellenőrizhető; a referencia-kromatogramok alapján a vizsgálati minták glikánjai azonosíthatók;

11 azokban az esetekben, amikor referencia nem áll rendelkezésre a vizsgálati minta összes glikán csúcsának azonosítására, az azonosítatlan glikáncsúcsok monitorozására vagy jelölésére abszolút vagy normalizált retenciós időket lehet használni. 3-2 A VIZSGÁLT ANYAGOK MEGFELELŐSÉGÉNEK BIZONYÍTÁSA A MINŐSÉGI KÖVETELMÉNYEKNEK MEGFELELŐEN Az értékelésnek ezen a szintjén a vizsgált készítmény analitikai eredményeit abból a célból értékelik, hogy a specifikációnak való megfelelőségüket bizonyítsák. Ezt a célt tipikusan úgy érik el, hogy az eredményeket a vizsgált anyag referenciaanyagának párhuzamos vizsgálatakor kapott adatokkal hasonlítják össze. Az adatok értékelésekor fontos: annak megállapítása, hogy a referenciaanyaggal kapott analitikai eredmények széleskörűen összehasonlíthatók-e a várt eredménnyel, amihez a rendszer alkalmasságának igazolása szükséges; például egy glikán-térképezési eljárásban ezt úgy érik el, hogy a referenciaanyaggal nyert térképet összehasonlítják a referenciaanyag megállapítása során nyert mintatérképpel, biztosítva minden megállapított rendszeralkalmassági feltételnek való megfelelést; a referenciaanyaggal és a vizsgálati anyaggal nyert térképek hasonlóságának bizonyítása bármilyen, az egyedi cikkelyben megadott specifikus feltétel alkalmazása esetén. 3-3 A MENNYISÉGI KÖVETELMÉNYEKNEK MEGFELELŐEN VIZSGÁLT ANYAGOK MEGFELELŐSÉGÉNEK BIZONYÍTÁSA Az analit-szintek mennyiségi mérése és az eredmények kifejezése Bizonyos esetekben, például a sziálsav vagy más monoszaharidok mérésekor, az adatokat abból a célból is kifejezhetjük, hogy a sziálsav-glikoprotein moláris hányadost megkapjuk. Az adatokat a sziálsav referenciaanyagára, és a fehérje meghatározás egy validált módszerére vonatkoztatva számítják ki. Alkalmazható belső vagy külső standard módszer (lásd Kromatográfiás elválasztási technikák általános fejezet) Az elválasztási profil kvantitatív kifejezése A megoszlási arányokat számszerűen többféleképpen ki lehet fejezni, beleértve a nomalizációs eljárást; minden egyes analitikai célpont, például egy adott glikán százalékos tartalmát úgy számítják ki, hogy meghatározzák az adott glikán válaszát az összes glikán együttes válaszának százalékában, kivéve azokat a válaszokat, amelyek oldószerektől vagy más hozzáadott reagenstől származnak, valamint azokat, amelyek az elhanyagolási határérték alatt vannak. Használni lehet továbbá olyan numerikus kifejezéseket, mint pl. a Z-érték, amelyek módszer- és készítményspecifikusak, és az egyedi cikkelyek adják meg. 4 REFERENCIAANYAGOK

12 A glikánok analízisére való referenciaanyagoknak 2 funkciója van: a rendszer alkalmasságának igazolása és annak igazolása, hogy a vizsgált minta a megadott követelményeknek megfelel-e. A rendszeralkalmasságra használt referenciaanyagok lehetnek: a vizsgált anyagra vonatkozó referenciaanyag; a vizsgált anyag, teljes mértékben jellemzett referenciaanyagából felszabaduló glikán rész; a glikoproteinekből felszabaduló, jól jellemzett glikán-rész (például fetuin, IgG); az azonosság és a tisztaság szempontjából jellemzett glikán-markerek. A vizsgált glikoprotein megfelelőségére használt referenciaanyagot a vizsgálatba vont anyagból készítik. Figyelembe kell venni, hogy az egyedi cikkelyekben leírt glikán-elemzési eljárások előírják a vizsgált anyagra vonatkozó olyan referenciaanyag használatát, amelyre a glikánanalízis eljárását már validálták. 5. SZEMPONTOK, MELYEKET A MÓDSZER-FEJLESZTÉSNÉL FIGYELEMBE KELLL VENNI Ez a rész a kifejlesztés alatt álló módszer általános kivitelezésére vonatkozó lépéseket adja meg. A módszer kifejlesztésének és analitikai validálásának mértékét a specifikus készítményre vonatkozó megfelelősége alapján választják ki. A kiválasztott megközelítéstől függően a glikánanalízishez számos lépés szükséges, például: a glikoprotein izolálása és tisztítása (vagy sómentesítése); a glikoprotein enzimatikus (vagy kémiai) kezelése, az N- vagy O-kapcsolt glikánoknak a fehérje vázról történő szelektív felszabadulása céljából; a felszabadult glikánok izolálása és tisztítása; a felszabadult sziálsav és monoszaharid-maradék azonosítása; a felszabadult glikánok kromofór jelölése; a natív, vagy fluoreszcens jelöléssel ellátott glikánok elválasztása; a glikánok azonosítása és mennyiségi meghatározása (például a Z-érték meghatározása); a lefoglalt kötési helyek meghatározása a glikozilált és nem glikozilált peptidek relatív mennyisége alapján. Fehérje izolálás és tisztítás. A glikoproteineknek a mátrixtól való izolálása és tisztítása szükséges lehet az összes zavaró komponens (például segédanyagok, sók) eltávolításához és,

13 amennyiben ez követelmény, az egyedi cikkelyek ezt pontosítják. A fehérje mennyiségi visszanyerésének biztosítása érdekében, reprodukálható módon kell elvégezni. Az oligoszacharidok felszabadulása és izolálása. A glikán-felszabadulás választott megközelítése a vizsgált fehérjétől függ, és a glikozilálás típusán azaz, hogy N-vagy O-kapcsolt glikozilálás alapul. A glikán-felszabadulás nem gyógyszerkönyvi megközelítését optimalizálni kell abból a célból, hogy az összes jelen lévő glikán mennyiségét meghatározzuk. Azokat a tényezőket, amelyek a hasítási hatékonyságot befolyásolják, mint például az enzim-fehérje koncentráció aránya, a hőmérséklet, a reakcióidő hossza, valamint a fehérjék emésztés előtti denaturálása, optimalizálni kell. Figyelembe kell venni, hogy az enzimatikus/kémiai reakcióknak nem szabad megváltoztatniuk a glikán-összetételt, például nem semmisíthetik meg a sziálsav-maradékot. Ahol több, mint egy glikozilációs hely van, az enzimatikus kezelésnek arányosan kell a fehérjéhez kapcsolt összes oligoszaharidrészt felszabadítania, szerkezetüktől és a fehérjén belüli egyedi pozíciójuktól függetlenül. Bizonyítani kell az összes jelen lévő glikán esetében a reakcióelegyből történő reprodukálható visszanyerést. A felszabaduló glikánok derivatizálása. A derivatizálást általában nem gyógyszerkönyvi előírás alapján végzik el. Ezért az összes jelen levő glikán reprodukálható derivatizálását igazolni kell. Ezt a reakció körülményeinek, mint például a derivatizáló anyagok mennyisége, a reakcióhőmérséklet és a reakció-idő, optimalizálásával érhetjük el. A derivatizálási reakció semmiképp sem változtathatja meg a glikán-összetételt, például a sziálsav-maradékot nem semmisítheti meg. Elválasztás, azonosítás és rendszeralkalmasság. A glikán-analízisre alkalmazott módszereknek alkalmasnak kell lenniük a különböző glikán-részek kimutatására és szeparálására, hogy a megbízható azonosítást és mennyiségi meghatározást lehetővé tegyék. A rendszeralkalmasság elfogadási feltételei, amelyek egyúttal a glikán-hasítást, a visszanyerést és az analízist is magukban foglalják, azoktól a kritikus vizsgálati paraméterektől függenek, amelyek a kapott végeredményt befolyásolják. A vizsgált anyag és az azonos feltételek között kezelt referenciaanyag glikán-térképének összehasonlítása az analitikai eljárás teljesítményének ellenőrzésére szolgál. A kapott eredmények további igazolása céljából, az analíziseket egy ortogonális módszerrel is meg lehet ismételni. A referenciaanyag (például a vizsgált készítmény referenciaanyaga, egy rendszeralkalmassági glikán-marker) alkalmazása alapvető fontosságú a rendszeralkalmassági paraméterek megállapítása és az analitikai eljárás validálása szempontjából. A glikán-profilok menniyégi meghatározásának (például Z-érték becslés) reprodukálhatóságát igazolni kell. A lefoglalt kötőhelyek meghatározása a glikozilált és nem glikozilált peptidek relatív mennyisége alapján. Ahol a kötőhely foglaltságát enzimatikusan emésztett glikoproteinből származó glikozilált és nem glikozilált peptidek összehasonlításával becsülik meg, mindkét peptidforma reprodukálható hasítását bizonyítani kell.

14 6. A GLIKÁN-ANALÍZIS DÖNTÉSHOZÓ KERETRENDSZERE Ezt a döntéshozó rendszer csak tájékoztató jellegű, és nem alkotja az Európai Gyógyszerkönyv kötelező részét. A glikánok analízisére használt eljárások kiválasztását a glikoproteinek minőségbiztosításához szükséges információszintnek megfelelően állapítják meg, és ezt a készítmény kifejlesztése során állítják be. A ábra azon módszerek kiválasztásához nyújt útmutatást, amelyeket akkor alkalmazunk, ha a glikán-analízis követelmény ábra. Útmutató a módszerek alkalmazásához, ha a glikán-analízis követelmény Ha a glikoproteinek esetében szükséges a glikán-analízis A glikán-analízis módszereinek kiválasztása Kis fehérje, behatárolt glikoziláció és/vagy egyszerű szerkezetek igen Az ép glikoprotein vizsgálata (pl. tömegspektrometriás analízise) nem Nagy molekula, komplex elágazású glikánok és/vagy többszörös glikozilációs helyek VÉGE Követelmény-e a kötőhelyspecifikus glikoziláció ismerete igen A kötőhely-specifikus glikozilációs vizsgálat Negatív töltés mennyiségi meghatározása. Sziálsav és/vagy monoszaharidok meghatározása nem nem Követelmény-e a részletes glikán-analízis? A glikopeptidek proteáz-emésztése és elválasztása igen VÉGE VÉGE Módszerek kiválasztása a hasított glikánok vizsgálatára (pl. elágazási profil, egyedi szerkezetek azonosítása)

15 1 04/2010: MONOCITA-AKTIVÁLÁS VIZSGÁLAT 1. BEVEZETÉS A monocita-aktivációs vizsgálat (Monocyte Activation Test = MAT) olyan anyagok kimutatására vagy mennyiségi meghatározására használatos, amelyek aktiválás révén humán monocitákból vagy monociter sejtekből endogén mediátor anyagokat szabadítanak fel. Ilyen anyagok a gyulladást elősegítő citokinek, például a tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-α), az interleukin-1-béta (IL-1β) és az interleukin-6 (IL-6). Ezeknek a citokineknek szerepük van a láz patogenezisében, következésképpen a MAT a pirogének jelenlétét mutatja ki a vizsgált mintában. A MAT alkalmas arra, hogy termékspecifikus validálás után helyettesítse a nyúl pirogénvizsgálatot. A nem-endotoxin pirogéneket vagy gyulladást elősegítő szennyező anyagokat tartalmazó gyógyszerek az endotoxin dózis-hatás görbéjéhez képest gyakran igen meredek dózis-hatás görbét mutatnak. Az ilyen szennyezett termékek esetében a legnagyobb válasz gyakran a vizsgált készítmény hígítatlan vagy kis mértékben hígított oldatával nyerhető. Ezért azokat a készítményeket, amelyek nem-endotoxin szennyezőket tartalmaznak vagy tartalmazhatnak, olyan hígítási tartományban kell vizsgálni, amely a legkisebb hígítást is magában foglalja. A jelen fejezetben a következő 3 módszer leírása szerepel. A-módszer. Kvantitatív vizsgálat B-módszer. Félkvantitatív vizsgálat C-módszer. Referencia gyártási tétel összehasonlító vizsgálata. A vizsgálatot olyan módon kell elvégezni, hogy a pirogénnel való szennyeződés kizárható legyen. 2. DEFINICÓK A legnagyobb érvényes hígítás (Maximum valid dilution = MVD) valamely minta megengedhető legnagyobb hígítása, amelynél a szennyezési határérték meghatározható. Az MVD-t a következő kifejezés alkalmazásával kell meghatározni: CLC C, LOD ahol: CLC = a szennyező határérték-koncentrációja; C = a vizsgálati oldat koncentrációja; LOD = a kimutatási határ. A megfelelésről vagy nem megfelelésről hozott döntés elfogadási kritériuma a szennyező határértékkoncentrációja (CLC), amelyet endotoxin-egyenérték/milligrammban vagy endotoxinegyenérték/milliliterben, illetve a vizsgált készítmény biológiai aktivitásának egységeiben fejeznek ki. A CLC-t a következő kifejezés alkalmazásával kell számítani:

16 2 K, M ahol: K = az endotoxin pirogén adagjának testtömeg-kilogrammra vonatkoztatott küszöbértéke; M = a készítmény legnagyobb ajánlott izomba adott adagja, testtömeg-kilogrammonként. Amennyiben a készítményt gyakori időközökben alkalmazott injekcióként vagy folyamatos infúzió formájában kell beadni, az M az egyórás időtartamon belül beadható legnagyobb teljes adagot jelenti. Amennyiben valamely készítményre már meghatározták az endotoxin határérték-koncentrációt (Endotoxin Limit Concentration = ELC), a CLC, hacsak nincs más előírás, azonos az ELC-vel. Ebben az esetben a vizsgálati oldat koncentrációját a következőképpen kell kifejezni: mg/ml-ben, ha az endotoxin határértékét tömegre vonatkoztatva fejezték ki (NE/mg), Egység/ml-ben, ha az endotoxin határértékét biológiai egységekben (NE/egység) határozták meg, és ml/ml-ben, ha az endotoxin határértékét térfogategységként (NE/ml) határozták meg. A szennyező koncentrációjának endotoxin-egyenértéke leolvasható a standard endotoxin dózis-hatás görbéről (A-módszer), vagy a standard endotoxin oldatokra adott válasszal összehasonlítva megbecsülhető (B-módszer). A standard enxotoxin-törzsoldat olyan endotoxin referenciastandardból készül, amelyet a Nemzetközi Standardra, például BRP endotoxin standardra állítottak be. A mérés cut-off értékét a következő kifejezés alkalmazásával számítjuk: x + 3s, ahol: x = a vak mintára kapott 4 párhuzamos válaszérték (R 0 ) átlaga; s = a vak mintára kapott 4 párhuzamos válaszérték (R 0 ) szórása. A mérés cut-off értékét a kiértékelésnek megfelelő egységekben fejezzük ki. A kimutatási határ (limit of detection = LOD) az endotoxin standard görbe felhasználásával határozható meg. Az LOD a cut-off értéknek megfelelő endotoxin-koncentráció. A vizsgálatban az LOD-t endotoxinegyenérték/ml-ben fejezzük ki. 3. ÁLTALÁNOS ELJÁRÁS A vizsgált készítmény oldatát emberi monocita forrásból nyert sejtekkel, vagy humán monociter sejtekkel inkubálják. Ezek a sejtek származhatnak például humán heparinozott, lehetőleg négy óránál nem régebben levett perifériás vérből, vagy ugyanennek a vérnek a monocitákat tartalmazó frakciójából, például humán perifériás vérből (pl. sűrűséggradiens centrifugálással) nyert mononukleáris sejtekből (PBMC) vagy emberi monocita sejtvonalból. A humán heparinozott perifériás vért általában sejttenyésztő tápfolyadékkal vagy fiziológiás sóoldattal hígítják, például 2-50 %V/V végső koncentrációra. A PBMC-t vagy a monocita sejtvonalakat sejttenyésztő tápfolyadékban vagy a donor saját plazmájával, vagy AB savóval együtt tipikus esetben tenyésztőlyukanként, kémcsövenként, illetve egyéb tenyésztőedényenként 0,1-1, sejtkoncentrációban használják. A monocita sejtvonalak esetében az AB savó hővel kezelt embrionális borjúszérummal helyettesíthető. A sejtek tenyésztését 37±1 C-on, a tápfolyadéknak megfelelő atmoszférában, például 5% CO 2 -t tartalmazó nedves levegőben végzik el. A tenyésztési időtartamnak elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy a választott kiértékelési érték kellő megnövekedését lehetővé tegye. A választott kiértékelésnek a vizsgált készítmény oldatára adott válaszát, például a

17 3 gyulladást elősegítő vagy pirogén citokinek esetében, a standard endotoxinra vagy a vizsgált készítmény valamely referencia gyártási tételére adott válasszal hasonlítják össze. A kiválasztott kiértékelési módszert megfelelő standardok felhasználásával kalibrálják. 4. ESZKÖZÖK Minden üveget és egyéb hőálló eszközt hőlég-szárítószekrényben, validált eljárás alkalmazásával pirogénmentesíteni kell. Az általánosan használt legrövidebb idő és legalacsonyabb hőmérséklet 30 perc, illetve 250 C. Ha műanyag eszközöket, például mikrotiter lemezt és automata pipettákhoz tartozó pipettahegyeket alkalmazunk, olyan eszközt kell használni, amelyről bizonyították, hogy mentes a meghatározható pirogén anyagoktól, és amely nem zavarja a vizsgálatot. 5. A SEJTFORRÁSOK ÉS MINŐSÍTÉSÜK 5-1. TELJES VÉR A teljes vért egyedi donoroktól vagy egyesített teljes vérből nyerik, és az 5-3, illetve az 5-4 pontban meghatározott követelményeknek megfelelő módon minősítik PERIFÉRIÁS VÉRBŐL NYERT MONONUKLEÁRIS SEJTEK (PBMC) A PBMC-t egyedi donoroktól nyert teljes vérből vagy egyesített teljes vérből különítik el, és az 5-3, illetve az 5-4 pontban meghatározott követelményeknek megfelelő módon minősítik A VÉRADÓK MINŐSÍTÉSE A véradóknak, az egyéb hatályban levő követelmények mellett, amelyek a donor belegyezésére, egészségére, a biztonságosságra és az etikai tényezőkre vonatkoznak, meg kell felelniük a következő minősítési kritériumoknak. A véradóknak nyilatkozniuk kell arról, hogy egészségi állapotuk megfelelő, nem szenvednek semmiféle bakteriális- vagy vírusfertőzésben, és a véradást megelőző legalább 1 héten belül nem volt fertőzésre utaló tünetük. A donorok a véradást megelőző 48 órában nem vehettek be nemszteroid gyulladásgátló gyógyszert, valamint a véradást megelőző 7 napban szteroid gyulladásgátló gyógyszert. Azok az egyének, akik immunszuppresszív hatású vagy más olyan gyógyszert szedtek, amelyről ismert, hogy a kiválasztott kiértékelést befolyásolhatja, nem lehetnek véradók. A véradást a hazai transzfúziós egészségügyi követelményeknek megfelelően kell fertőzési markerekre vizsgálni TÖBB DONORBÓL SZÁRMAZÓ EGYESÍTETT SEJTEK MINŐSÍTÉSE A teljes vérből vagy vérfrakciókból, például PBMC-ből egyesített sejtek legalább 4, de lehetőleg 8 vagy több egyedi donor véréből származzanak; ha lehetséges, minden donortól megközelítőleg azonos térfogatú vért kell levenni, illetve a sejteket megközelítőleg azonos térfogatú vérből kell kinyerni. Az egyesített sejtek minősítése a következőképpen történik: a vérvételt követő 4 órán belül az egyesített sejtek felhasználásával felvesszük a dózis-hatás görbét, amelyhez standard endotoxint használunk, legalább 4, mértani sor szerint készített hígítás (például 0,01 4,0 NE/ml koncentráció) alkalmazásával. A dózis-hatás görbének a standard görbére megadott, 6.1 pontban leírt 2 követelménynek meg kell felelnie A FAGYASZTVA TÁROLT (KRIOKONZERVÁLT) SEJTEK MINŐSÍTÉSE A MAT meghatározás során felhasználandó sejtforrások, például a humán teljes vér, vérfrakciók (pl. PBMC) vagy monocita sejtvonalak fagyasztva tárolhatók. Egyesített fagyasztva tárolt sejtek a sejtek fagyasztás előtti egyesítésével vagy az egyedi fagyasztva tárolt vérminták közvetlenül a felolvasztás után való egyesítésével nyerhetők. Az egyesítetések legalább 4, de lehetőleg 8 vagy több egyedi donor véréből

18 4 származzanak; ha lehetséges, minden donortól megközelítőleg azonos térfogatú vért kell levenni, illetve a sejteket megközelítőleg azonos térfogatú vérből kell kinyerni. A fagyasztva tárolt vér vagy vérsejtek minősítését a felolvasztás (és szükség esetén egyesítés) után azonnal el kell végezni: a fagyasztva tárolt vér vagy vérsejtek feleljenek meg a standard görbére megadott, 6.1 pontban leírt 2 követelménynek FOLYAMATOSAN FENNTARTOTT MONOCITA SEJTVONALAK A humán monocita sejtvonalat azért tenyésztik folyamatosan, hogy a MAT céljára megfelelő készletet biztosítsanak. A módszer optimalizálására a sejtvonalból származó klónok használhatók. A sejteket steril körülmények között kell fenntartani, és rendszeresen vizsgálni kell mikoplazma szennyezés jelenlétére. Ezen felül, a sejteket rendszeresen vizsgálni kell azonosság (például kettőződési idő, morfológia és funkció), valamint stabilitás szempontjából. A sejtvonal funkcionális stabilitását olyan módon határozzák meg, hogy a továbboltások számához viszonyított teljesítőképességét folyamatosan ellenőrzik a rutin vizsgálatok során. A funkcionális stabilitás kritériumait meg kell határozni, ami magában foglalhatja a növekedési kritériumokat, a vizsgálat során kapott legnagyobb jelet, a háttérzajt és a receptor kifejeződést. A receptor kifejeződést specifikus ligandokkal, például a toll-like receptor 4 (TLR4) esetében lipopoliszaharidokkal (LPS), a toll-like receptor 2 (TLR2) esetében lipoteikonsavval (LTA), a TLR2-TLR1, illetve a TLR2-TLR6 esetében pedig szintetikus bakteriális lipoproteinnel lehet vizsgálni. 6. ELŐKÉSZÍTŐ VIZSGÁLATOK Abból a célból, hogy a vizsgálat pontosságáról és érvényességéről meggyőződjünk, előkészítő vizsgálatokat kell elvégezni annak biztosítására, hogy a standard görbére vonatkozó kritériumok teljesülnek, hogy az oldat nem befolyásolja a vizsgálatot, hogy a vizsgálat endotoxinokat, valamint nemendotoxin jellegű szennyezéseket mutat-e ki, továbbá hogy az oldat nem befolyásolja a kimutatási rendszert A STANDARD GÖRBÉRE MEGADOTT KRITÉRIUMOK BIZTOSÍTÁSA A standard görbe felvételéhez a standard endotoxin legalább 4 különböző töménységű oldatát használjuk. A vizsgálatot a standard endotoxin oldat valamennyi hígítása esetében legalább 4 párhuzamos mintával kell elvégezni. A kiválasztott kiértékelésnél (vak érték) az alap kibocsátást a hozzáadott standard endotoxin jelenléte nélkül olyan módon kell optimalizálni, hogy az a lehető legalacsonyabb legyen. A standard görbe elfogadhatóságának két kritériuma van: A log dózis válasz (utóbbi szükség esetén megfelelően transzformálva) függvény regressziója statisztikailag szignifikáns ( p<0.01) legyen; A log dózis válasz függvény regressziója nem térhet el szignifikánsan (p >0.05) a linearitástól. Ha az analízist 4 paraméteres logisztikai görbére végezzük el, az észlelt görbe, a szokásos statisztikai módszereket (lásd az 5.3. általános fejezetet) alkalmazva, nem térhet el szignifikánsan az elméleti görbétől A ZAVARÓ TÉNYEZŐK VIZSGÁLATA A vizsgálat érvényességének biztosítása céljából előzetes vizsgálatokat kell végezni annak igazolására, hogy a vizsgálati oldat nem befolyásolja vizsgálat eredményét. A vizsgálati módszert minden olyan esetben validálni kell, amikor a kísérleti feltételek úgy változnak, hogy az befolyásolhatja a vizsgálat eredményét. Megfelelő hígítószerrel a vizsgálandó készítményt mértani sor szerint hígítjuk, olyan módon,

19 5 hogy egyetlen hígítás se haladja meg az MVD-t. A vizsgálandó készítményből azonos módon még egy hígítási sort készítünk, és az endotoxint a standard görbe középértékének megfelelő vagy ahhoz közeli koncentrációban (A-módszer), illetőleg a LOD kétszeresének megfelelő koncentrációban (B-módszer) adjuk hozzá. Más lehetőségként olyan hígító oldatot is használhatunk, amely a standard görbe közepértékének megfelelő vagy ahhoz közeli koncentrációban (A-módszer), illetőleg a LOD kétszeresének megfelelő koncentrációban (B-módszer) hozzáadott endotoxin tartalmaz. Ezeket a hígítási sorozatokat egy kísérleten belül párhuzamosan vizsgáljuk. Minden egyes oldat endotoxin-egyenérték koncentrációjának kiszámítására a standard görbét használjuk. Az oldathoz hozzáadott endotoxin átlagos visszanyerését úgy számítjuk ki, hogy az oldat átlagos endotoxin-egyenérték koncentrációját (ha egyáltalán tartalmaz endotoxint) levonjuk a hozzáadott endotoxint is tartalmazó oldatéból. A vizsgálati oldat akkor tekinthető a vizsgálatot befolyásoló tényezőktől mentesnek, ha a vizsgálati körülmények között a mért endotoxin egyenérték-koncentráció abban a vizsgálati oldatban (miután levontuk belőle a hozzáadott endotoxint nem tartalmazó oldatban mért endotoxin-egyenérték koncentrációt), amelyhez endotoxint adtunk, a hozzáadott koncentráció %-a között van. Amennyiben ez a kritérium nem teljesül, az A- vagy a B-módszer alkalmazásával szemben a C-módszert kell előnyben részesíteni. A C-módszerben a vizsgálandó készítmény oldatát három hígításban kell vizsgálni: abban a legnagyobb koncentrációban (legkisebb hígításban), amely a választott kiértékelésnél a legnagyobb kibocsátást serkenti, valamint a közvetlenül e feletti és alatti kétszeres hígításban. Minthogy az a koncentráció, amely a kiválasztott kiértékelésnél a legnagyobb kibocsátást serkenti, egyaránt függhet a donortól és a gyártási tételtől, a termékspecifikus validálást legalább három független vizsgálatban kell elvégezni, amelyekben más-más donoroktól származó sejteket kell felhasználni. A legmagasabb koncentrációt (legkisebb hígítást), amelyről úgy gondolják, hogy a kiválasztott kiértékelésnél a donorok többségében a legnagyobb kibocsátást serkentette, valamint a közvetlenül e feletti és alatti kétszeres hígítást, további vizsgálatokban kell validálni. Amennyiben a nem hígított vizsgálati oldat serkenti a legnagyobb kibocsátást a kiválasztott kiértékelésnél, a PBMC-hez való hozzáadás előtt további vizsgálatokat kell végezni a nem hígított vizsgálati oldat, valamint annak 1:2 és 1:4 arányú hígításainak felhasználásával. Az egymást követő vizsgálatokban felhasznált 3 hígítás nem haladhatja meg az MVD-t; ennek a három hígításnak a hígítási faktorát f 1 -gyel, f 2 -vel és f 3 -mal jelöljük. A termékspecifikus validálást követően a vizsgálatot rutinszerűen vagy 4 egyedi donorból származó sejteken, vagy egyetlen, egyesített sejteket tartalmazó szuszpenzión, vagy humán monocita sejtvonal egyetlen passzázsából származó sejteken végezzük el A NEM -ENDOTOXIN JELLEGŰ? MONOCITA-AKTIVÁLÓ SZENNYEZÉSEK MEGHATÁROZÁSI MÓDSZERÉNEK VALIDÁLÁSA Az előkészítő vizsgálat során azt is bizonyítani kell, hogy a kiválasztott vizsgálat, a bakteriális endotoxinok kimutatásán felül, a nem-endotoxin jellegű, gyulladást elősegítő vagy pirogén szennyezőket is kimutatja. Ezt olyan, korábban már vizsgált gyártási tételek felhasználásával lehet elvégezni, amelyekben nem-endotoxin jellegű szennyezőket mutattak ki, és amelyek a nyúl pirogén vizsgálatban pozitív reakciót adtak, illetőleg emberben nem várt gyógyszerreakciót váltottak ki. Amennyiben ilyen gyártási tételek nem állnak rendelkezésre, az előkészítő validálásnak magában kell foglalnia a vizsgáló rendszer validálását is, a toll-like receptorok specifikus ligandjainak (például peptidoglikánok, lipoteikolsavak vagy szintetikus bakteriális lipoproteidek) felhasználásával. 6-4 A KIMUTATÁSI RENDSZERT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZŐK Amikor a vizsgálandó készítmény oldatának a további vizsgálatok céljára legmegfelelőbb hígítását már meghatározták, a meghatározási rendszerben (például ELISA) előforduló interferáló tényezők vizsgálatára a választott kiértékelés során ezt a hígítást alkalmazzák. A választott kiértékelésben a standard hígítási sorozatoknak, a vizsgálandó készítmény jelenlétében vagy a vizsgálandó készítmény nélkül, 20 százalékon belüli egyezést kell mutatniuk.

20 6 7. MÓDSZEREK 7-1. A MÓDSZER: KVANTITATÍV VIZSGÁLAT Az A-módszer alapja a vizsgálandó készítmény standard endotoxin dózis-hatás görbével történő összehasonlítása. A vizsgálandó készítmény akkor felel meg a vizsgálat követelményének, ha szennyezőinek koncentrációja kisebb, mint a CLC érték A vizsgálat menete A validált vizsgálati módszert alkalmazva a táblázat alapján oldatokat készítünk, és minden egyes oldatból 4-4 párhuzamos mintát tenyésztünk, amit végezhetünk külön-külön 4 egyedi donor sejtjeivel, egyetlen egyesített sejtszuszpenzióval vagy humán monocita sejtvonal egy passzázsából származó sejtekkel táblázat Oldat Oldat Hozzáadott endotoxin (NE/ml) Párhuzamos minták száma A vizsgálati oldat/f nincs 4 B vizsgálati oldat/2f nincs 4 C vizsgálati oldat/4f nincs 4 D R 0 R 1 -R 4 vizsgálati oldat/f pirogénmentes fiziológiás sóoldat vagy a vizsgálatban használt hígítószer pirogénmentes élettani sóoldat vagy a vizsgálatban használt hígítószer az endotoxin standard görbe szerinti középadag (R 3 ) nincs ( negatív kontroll) 4 4-féle töménységű standard endotoxin 4 minden egyes koncentrációból 4 db A-oldat = A vizsgálandó készítmény oldatának az a hígítása (itt f-fel jelölve), amellyel a zavaró tényezőkre vonatkozó vizsgálatot elvégezték, tehát az a legnagyobb töménység (legkisebb hígítás), amelynél az endotoxin visszanyerése % közé esik. B-oldat = Az A-oldat kétszeres hígítása, amely nem haladja meg az MVD értéket. C-oldat = A B-oldat kétszeres hígítása, amely nem haladja meg az MVD értéket. D-oldat = Hozzáadott standard endotoxint (az endotoxin standard görbe szerinti középadagot (R 3 )) tartalmazó A-oldat. R 0 oldat = negatív kontroll. R 1 -R 4 oldat = standard endotoxin oldatok, a zavaró tényezők meghatározására szolgáló vizsgálatban használt koncenrációkban Számolás és értelmezés Minden elemezendő adatnak olyan sejtekre kell vonatkoznia, amelyek megfelelnek a standard görbe két kritériumának. Az endotoxin-egyenérték visszanyerése, amit a D-oldatban az A-oldat endotoxinegyenértékének levonása után számítunk ki, % között legyen. Az A-, B- és C-oldatok párhuzamos mintái endotoxin-egyenértékének kiszámításához minden egyes különböző sejtforrás esetén (pl. egyedi vérminták, egyesített donorsejtek vagy sejtvonal) az R1-R4 endotoxin standard görbét használjuk fel. A vizsgált készítmény akkor felel meg az adott sejtforrásra vonatkozó vizsgálat követelményeinek, ha az A-, B- és C-oldatok párhuzamos mintáiban mért endotoxinegyenérték-koncentráció középértéke, a hígításra és koncentrációra történő korrekció után kisebb, mint a vizsgált készítményre előírt CLC érték.

21 A készítmény megfelelési/nem megfelelési kritériumai Amennyiben egyedi donorok sejtjeit használjuk, a vizsgálandó készítménynek mind a négy különböző donor sejtjei esetében meg kell felelnie a vizsgálat követelményeinek. Ha a vizsgált készítmény a 4 donor közül 3 sejtjeivel végzett vizsgálatban megfelel (egy donort kizárnak a vizsgálatból a vizsgálat követelményeinek való meg nem felelés miatt, vagy azért mert pozitív reakciót mutatott), a vizsgálatot további 4 olyan donorból származó sejtekkel kell folytatni, ahol egyetlen donor sejtjei sem szerepeltek az első számú vizsgálatban, és a vizsgált készítménynek a 8 donor közül hétnek a sejtjeivel megfelelő eredményt kell adnia (azaz 8 donorból legfeljebb egy pozitív reakció engedhető meg.) Amennyiben a monociták több egyedi donor sejtjeinek egyesítéséből származnak, a vizsgált készítménynek az egyesített sejtekkel végzett vizsgálat követelményének kell megfelelnie. Amennyiben a vizsgálatban humán monocita sejtvonalat használnak, a vizsgált készítménynek a sejtvonal egyetlen passzázsán vizsgálva meg kell felelnie a követelményeknek. 7-2 B-MÓDSZER, FÉL-KVANTITATÍV VIZSGÁLAT A B vizsgálati módszerben a vizsgálandó készítményt standard endotoxinnal hasonlítjuk össze. Az eredmény elfogadásához a vizsgált készítmény szennyezőanyag-koncentrációjának kisebbnek kell lennie, mint a CLC. Indokolt és engedélyezett esetektől eltekintve a felszabadítási döntéshez az A-oldatot kell választani A vizsgálat menete A validált vizsgálati módszer felhasználásával a táblázat szerint oldatokat készítünk, és minden egyes oldatból 4 párhuzamos tenyészetet készítünk, külön-külön 4 egyedi donor sejtjeivel, egyetlen egyesített sejtszuszpenzióval vagy humán monocita sejtvonal egy passzázsának sejtjeivel táblázat. Oldat Oldat Hozzáadott endotoxin (NE/ml) Párhuzamos minták száma A vizsgálati oldat/f nincs 4 B vizsgálati oldat/f 1 nincs 4 C vizsgálati oldat/f 2 nincs 4 D vizsgálati oldat/f E vizsgálati oldat/f 1 F vizsgálati oldat/f 2 R 0 R 1 R 2 R 3 R 4 pirogénmentes fiziológiás sóoldat vagy a vizsgálatban használt hígítószer pirogénmentes fiziológiás sóoldat vagy a vizsgálatban használt hígítószer pirogénmentes fiziológiás sóoldat vagy a vizsgálatban használt hígítószer pirogénmentes fiziológiás sóoldat vagy a vizsgálatban használt hígítószer pirogénmentes fiziológiás sóoldat vagy hígító folyadék A vizsgálati rendszerre számolt LOD 2-szeresének megfelelő töménységű standard endotoxin A vizsgálati rendszerre számolt LOD 2-szeresének megfelelő töménységű standard endotoxin A vizsgálati rendszerre számolt LOD 2-szeresének megfelelő töménységű standard endotoxin nincs (negatív kontroll) 4 A vizsgálati rendszerre számolt LOD 0,5-szeresének megfelelő töménységű standard endotoxin A vizsgálati rendszerre számolt LOD 1-szeresének megfelelő töménységű standard endotoxin A vizsgálati rendszerre számolt LOD 2-szeresének megfelelő töménységű standard endotoxin A vizsgálati rendszerre számolt LOD 4-szeresének megfelelő töménységű standard endotoxin