8201 Veszprém, Egyetem u. 10. Pf: Innsbruck, Innrain 66.

Átírás

1 Glikoprotein szacharidok molekuláris szerkezetének meghatározása multikapilláris elektroforézissel, LED indukált fluoreszcens detektálással Molecular structure analysis of glycoprotein saccharides by multi-capillary analysis with LED induced fluorescence detection Olajos Marcell 1,2, Hajós Péter 1, Günther K. Bonn 2, Guttman András 2 1 Analitikai Kémia Intézeti Tanszék, Pannon Egyetem 8201 Veszprém, Egyetem u. 10. Pf: Horváth Laboratory of Bioseparation Sciences,University of Innsbruck, Austria 6020 Innsbruck, Innrain 66. Bevezetés A glikoproteinek szénhidrát szerkezeteinek biológiai szerepének megismerése napjainkban kiemelt jelentőséggel bír. Különösen a mikroheterogenitások biológiai felismerésében, receptor-ligandum, sejt-sejt kölcsönhatásokban, a fehérje magasabb rendű szerkezetének kialakulásában, az immunogenitás valamint bioaktivitás szabályozásában játszott szerepük megértése áll a tudományos érdeklődés középpontjában. A biofarmakológia igényei a rekombináns glikoproteinek szénhidrát részeinek nagy felbontású, reprodukálható elemzési módszerét kívánják meg. A humán vérkészítmények glikoproteinjeinek vizsgálata elsősorban a betegségekkel összefüggő és azokra jellemző glikoziláció változások megismerése kiemelt fontosságú a biomarker kutatás területén. A glikoprotein szénhidrát szerkezetek nagy komplexitása általában számos bioanalitikai technika alkalmazását követeli meg, mint az enzim reakciók, kromatográfia, tömeg spektrometria (MS), magmágneses rezonancia spektroszkópia (NMR), poliakrilamid vékonyréteg gél elektroforézis (PAGE), nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiás technikák (HPLC) elsősorban pulzáló amperometriás detektálással kapcsolt magas ph-jú anioncserélő kromatográfia (HPAEC-PAD) és kapilláris elektroforézis (CE). Ezek csatolt technikái, mint LC-MS vagy CE-MS, előnyös lehetőséget kínálnak a szénhidrát analízis számára. A fehérjékhez kapcsolódó cukorszerkezetek (glikánok) hagyományos vizsgálati módszereinek többsége enzimatikus vagy kémiai úton szabadítja fel a szénhidrát molekulákat a glikoproteinekből. Mivel a szénhidrátok kromofór vagy fluorofór csoportokat csak kivételesen tartalmaznak, a bioanalitikában széles körben alkalmazott UV vagy fluoreszcens detektálású, nagyfelbontású fordított fázisú HPLC (RP-HPLC) és CE bioszeparációs technikák az analízist megelőző mintajelölés nélkül nem alkalmazhatóak. Kapilláris elektroforézis céljára a töltéssel és kiváló fluoreszcenciával rendelkező 8-aminonaftalin-1,3,6-triszulfonsavat (ANTS) és 8-aminopirén-1,3,6-triszufonsavat (APTS) alkalmazzák általánosan fluoreszcens jelölésként. Majd hagyományos kapilláris elektroforézis, kapilláris sorozat elektroforézis vagy mikrofluidikai platformon kivitelezik a jelölt szénhidrátok elektromos tér vezérelt elemzését. A jelölés során felmerülő egyik nehézség a reakció kiváló kihozatalához szükséges nagy ANTS vagy APTS felesleg. Ez a fölös jelölőanyag a kisebb néhány cukor egységből álló oligoszacharidok detektálását zavarja, sőt elektrokinetikus injektálás alkalmazása esetén további problémát jelent, hogy kiszorítja az injektálás során a kisebb elektroforetikus mobilitású jelölt cukor molekulákat. Az előadás bemutatja az APTS jelölt N-glikán struktúrák poszt-derivatizációs tisztításának lehetőségeit és ezek összehasonlítását. Szintén

2 ismertetésre kerül a vérkészítmények szabad monoszacharid tartalmának eltávolítása a jelölést megelőzően, glikoprotein tartalmuk affinitás kromatográfiás kinyerése. Továbbá bemutatjuk az illékony puffer-rendszeres exoglikozidáz enzimemésztésen alapuló szerkezetvizsgálat lehetőségeit is. Anyagok és módszerek Oligoszacharid minta-előkészítés 1μl denaturáló puffer (Endoglycosidase buffer pack, New England BioLabs, Ipswich, MA, USA) hozzáadása után a glikoproteineket (0,1mg 10μl vízben) 95 C-on 10 percig denaturáltuk. Ezt a glikánok enzimatikus felszabadítása követte peptid- N-glikozidáz F (PNGaseF, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA) emésztéssel, 2U enzimmel 37 Con 2 óra alatt 25μl térfogatban (2,5-2,5μl G7 és NP- 40 puffer oldatok, Endoglycosidase buffer pack New England BioLabs). A deglikozilált fehérjék eltávolítása háromszoros térfogatú jéghideg etanolos (Sigma-Aldrich) kicsapással és centrifugálással (11000rpm 10 perc, Labofuge 400R, Heraeus, Osterode, Németország) történt. Jelölési reakció A glikán tartalmú oldatok 200μl-es PCRcsövekben centrifugális vákuum bepárló (Savant Instrumnts Inc., Farmingdale, NY, USA) segítségével beszárításra kerültek. Ezt reduktív aminálási reakció követte 1μl 0,2M APTS 15% ecetsav oldatban és 1μl 1M NaBH 3 CN tetrahidrofuránban hozzáadásával 55 C-on 2 óráig inkubálva vagy 37 C-on egész éjszaka sziálsav tartalmú szerkezetek esetében. A reakció 100μl víz hozzáadásával került leállításra. Sziálsav lehasítása A sziálsav csoportok eltávolítását neuraminidáz (type VI, Clostridiu, perfringens, Sigma-Aldrich) emésztéssel végeztem 0,1M koncentrációjú illékony karbonát, formiát és acetát pufferben (ph 5,5-re állítva NH 4 OH hozzáadásával). Az exoglikozidáz reakció elegy magzati szarvasmarha fetuin glikánokat és 3,4mU neuraminidázt tartalmazott. A reakció 37 C-on egész éjszakán át tartó inkubálással játszódott le, és 10-szeres térfogatú jéghideg HPLC tisztaságú víz hozzáadásával került leállításra, amit centrifugális vákuum beszárítás követett az illékony pufferkomponensek eltávolítására. Mintatisztítási lépések A reagálatlan APTS feleslegének eltávolítására a reakcióelegyből Sephadex G10 (Sigma-Aldrich) méretkizárásos kromatográfiás állófázis került alkalmazásra MultiSreen filter plate (Millipore, Bedford, USA) segítségével. 100μl Sephadex G10 került felhasználásra 200μl APTS jelölt mintához. A szűrés és méretkizárásos tisztítás 15 perces 2500rpm centrifugálással (Hettich 30RF centrifuga, Tutlingen, Németország) történt. A Sephadex G10 gyöngyök kromatográfiás pipetta hegy (PhyNexus Inc,San José, CA, USA) formában is kipróbálásra kerültek automata, programozható 12 csatornás pipetta alkalmazásával. A hegyek 160μl G10 állófázist tartalmaztak. A kondicionálás és elúció 50% acetonitrillel (Sigma- Aldrich) történt. Ugyancsak kipróbálásra került a normál fázisú DPA-6S állófázis is az APTS eltávolítására, szintén PhyTip (PhyNexus Inc.) formátumban, 10μl kromatográfiás töltet felhasználásával. A megkötési lépést három mosólépés (95% acetonitril) követte, majd 20% acetonitrillel történt az elúció. Fordított fázisú pipetta hegyek (200μl össztérfogat, 5μl C-18 állófázis) kerültek kipróbálásra humán szérum minták glükóz (vércukor) tartalmának eltávolítására. A hegyeket acetonitrillel kondícionáltam, LC-MS tisztaságú víz került felhasználásra a mosó lépésekhez, az elúcióhoz pedig 50% acetonitrilt használtam, az oldatok 1-1% trifluor-ecetsavat (TFA) tartalmaztak. Ugyancsak a vércukor eltávolítására 3 és 10kDa pórusméretű Microcon (Millipore) ultraszűrő betétek is kipróbálásra kerültek centrifugális szűréssel (Labofuge 400R centrifuga, Hereaus). Több mosás és szűrés után nyertem vissza a vérszérum makromolekuláit. Multikapilláris elektroforézis A tízszeres hígítású jelölt, megtisztított glikánok CarbCE multikapilláris elektroforézis rendszerrel

3 (egene, Irvine, CA, USA) kerültek analízisre. A rendszer kék fényemittáló diódával (LED; nm csúcshullámhossz) lett felszerelve. A fluoreszcencia fotodiódákkal kerül detektálásra 520nm-es szűrő alkalmazásával. Az elválasztások 10 (12 csatornás) és 30 cm-es (4 csatornás) kapillárisokkal lettek kivitelezve (20μm i.d.). A kapillárisok Carb Separation Solution (egene) pufferrel voltak töltve, az injektálás elektrokinetikusan történt (2kV 20sec). Az elválasztások 2-8 kv feszültség mellett történtek. Eredmények A jelölőanyag feleslegének eltávolítása kapilláris gél elektroforézis előtt Kapilláris gél elektroforézis alapú szénhidrát analízis esetén elektrokinetikus injektálással a nagy jelölőanyag felesleg zavarja a minták detektálását, sőt a kisebb jelölt cukormolekulák elválasztása a túltelített APTS csúcstól szintén nehézségeket okoz. Így amennyiben nyomással való injektálásra nincs lehetőség (ilyen a legtöbb kézi rendszer és több kereskedelmi készülék viszkózus gélekkel), a minták tisztítása alacsony koncentrációjú minták, illetve kisméretű cukrok esetén nélkülözhetetlen. Kétféle módszer került kipróbálásra Sephadex G10 állófázis alkalmazásával, valamint egy normál fázisú kromatográfiás módszerrel. Az 1. ábra szemlélteti a módszerek összehasonlítását APTS jelölt különböző polimerizáció fokú maltooligoszacharid létra jelölés utáni tisztításán. 1. ábra: Jelölőanyag eltávolítási módszerek összehasonlítása Az ábrán jól látható, hogy mindhárom módszer javította a detektálhatóságot a tisztítatlan mintával összehasonlítva. Ugyanakkor a normál fázisú DPA- 6S kromatográfiás pipetta hegyek eredményezték a legjobb hatékonyságot. Így ez a módszer került a továbbiakban alkalmazásra PNGaseF emésztett, APTS jelölt glikoprotein minták (immunoglobulin G, magzati szarvasmarha fetuin, ribonucleáz B, α- 1-savanyú glikoprotein) elemzés előtti tisztításához. Az előadás részletesen bemutatja a jelölt glikánok analízisének eredményeit összehasonlítva az elválasztás hatékonyságát 10 és 30cm effektív hosszúságú kapillárisok alkalmazásával. Eredményeink azt mutatják, hogy a 30cm-es kapillárisokkal a szerkezeti izomerek (ribonukleáz B magasabb rendű mannóz struktúrái, fetuin tri- és tetraszializált triantennáris szerkezetei) felbontása nagymértékben javítható. Biológiai minták szabad cukortartalmának eltávolítása Könnyen belátható, hogy a komplex biológiai minták (vérkészítmények, szövetminták) glikozilációjának vizsgálatának során a minta mátrix hatásaival is számolni kell. Például a humán szérum mintákban jelenlévő relatív magas szabad glükóz tartalom a szabad jelölőanyaghoz hasonló problémákat eredményez az analízis során, mivel a felszabadított glikánokhoz hasonlóan részt vesz a reduktív aminálási reakcióban, azokkal analóg módon megjelölődik glikozidos hidroxil csoportján keresztül. A jelölt glükóz tartalom nagymértékben túltelített csúcsot eredményez, és az injektálás során a jelölt glikánokat is kiszoríthatja. Ez szükségessé tette a kimutatás hatékonyságának növelése érdekében a vércukor eltávolítását még a fluoreszcens jelölés előtt. Erre a célra fordított fázisú kromatográfiás állófázist (C18 funkcionalizált töltet) tartalmazó pipettahegyek kerültek kipróbálásra. Ez a módszer a kevésbé hidrofil fehérje jellegű molekulák kinyerését célozta a hidrofil szabad cukrokat nagy mennyiségben tartalmazó mintákból. Mivel a vizsgálni kívánt glikoproteinek relatív kis mennyiségben vannak jelen a többi fehérjéhez (például az albumin) illetve más fordított fázishoz

4 kötődő molekulához viszonyítva, és az állófázis kapacitása korlátozott, ez a módszer kevéssé bizonyult hatékonynak. Egy másik eljárás, a 3 és 10 kda pórusméretű ultraszűrő eszközök alkalmazása, is kipróbálásra került, melyek kis térfogatú minták kezelését könnyedén kivitelezhetővé teszik. Ez a megközelítés a minták molekula méret szerinti elválasztását célozza a kismolekulák oldószerrel a membránon való átjutásán alapulva. Így a maradék glükóz vízzel való kimosása után a makromolekulák a membránról visszanyerhetőek. Mindkét pórusméret kiváló hatékonyságot eredményezett, és a nagyobb pórusméretű szűrővel sem volt jelentős mintaveszteség kimutatható. Ugyanakkor a kisebb pórusméretű betét nagyobb ellenállása megnövekedett szűrési idővel járt. A 2. ábra szemlélteti a glükóz eltávolítás szükségességét egy kezeletlen és egy ultraszűréssel kezelt minta elektroferogramjának bemutatásán keresztül. Jól látható glikán csúcsok intenzitásának növekedése, és a jel-zaj viszony javulása. formátumban (PhyNexus). Az előadásban e kísérletek eredményei is részletesen bemutatásra kerülnek. Az affinitás kromatográfiás mintakezelés lehetővé tette a glikoproteinek szelektív kinyerését, feldúsítását komplex biológiai mintákból, jelentősen növelve vizsgálatok során nyert információ mennyiségét (kimutatható glikán csúcsok számát). Ugyanakkor, mivel az alkalmazott affinitás kromatográfiás állófázisok a glikoproteineket a szénhidrát részeiknél kötik meg, a glükóz (szintén szénhidrát molekula jó affinitással az állófázisokhoz) eltávolítása ezeknél a kísérleteknél is szükséges volt. A módszer alkalmasnak bizonyult normál vérszérum és prosztata karcinómában szenvedő beteg szérumának glikozilációs profilja közt különbségek kimutatására. Exoglikozidáz emésztés illékony pufferrendszerrel A glikánok szénhidrát szerkezetének és kapcsolódásainak feltérképezése specifikus exoglikozidáz enzimek emészésével 2. ábra: Humán vérplazma minta APTS jelölt glikánjainak multikapilláris gél elektroferogramja glükóz eltávolítás nélkül (A) és 10kDa pórusméretű ultraszűrés alkalmazásával (B) A továbbiakban affinitás kromatográfián alapuló glikoprotein dúsítási módszerek is kidolgozásra kerültek, boron sav és különböző lektinek, valamint ezek kombinációinak alkalmazásával kromatográfiás pipetta hegy megvalósítható. Ez módszer kompatibilis bármilyen kapilláris elektroforézises elemzési technikával, beleértve a multikapilláris gél elektroforézist is. Így gondosan megválasztott exoglikozidáz enzimek keverékeivel szénhidrát-szekvenálás valósítható meg. Ugyanakkor amennyiben az elektrokinetikus

5 injektálás az egyetlen opció, a nagy ionerősségű puffer-komponensek zavaró hatásának kiküszöbölése nélkülözhetetlen. Ebben az esetben az ultraszűréssel való eltávolításuk nem jöhet szóba, mivel a jelölt glikánok jó része a pórusméretet nem haladja meg, így jelentős mintaveszteséggel kell számolni. A hagyományos foszfát pufferek alkalmazása helyett ilyen esetekben illékony pufferkomponensekkel való helyettesítése kínálkozik lehetőségként. Acetát, formiát és karbonát pufferekben (0,1M koncentráció, ph 5,5 értékre beállítva ammónium hidroxiddal) végezve az enzim reakciókat, a reakció lejátszódása után a mintákat vákuumban beszárítva az illékony komponensek is távoznak. A módszer hatékonysága fetuin glikánok sziálsav csoportjainak neuraminidáz enzimmel való lehasításán került igazolásra. A 3. ábra mutatja be a kísérlet eredményeit, összehasonlítva a kereskedelemben beszerezhető aszialofetuin glikánok elemzésével és a hozzárendelhető kémiai struktúrákkal. Irodalomjegyzék [1] Olajos, M., Hajós, P., Bonn, G. K., Guttman, A. Analytical Chemistry 80 (11) [2] Olajos, M., Monzo, A., de Benedictis, L., Rivera, Z., Bonn, G. K., Guttman, A. Analytical and Bioanalytical Chemistry 392 (1-2) ábra: Fetuin glikánok sziálsav eltávolítása neuraminidázzal való emésztéssel ammónium-acetát reakció puffer alkalmazásával; felső elektroferogram: APTS jelölt fetuin glikánok, középső: neuraminidáz emésztett APTS jelölt fetuin glikánok, alsó: APTS jelölt aszialofetuin glikánok

6