Az alfa-1 savas glikoprotein mint biomarkerizoformjainak. Doktori tézisek Budai Lívia. Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola

Átírás

1 Az alfa-1 savas glikoprotein mint biomarkerizoformjainak HPLC-MS analízise Doktori tézisek Budai Lívia Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Vékey Károly osztályvezető, DSc. Hivatalos bírálók: Dr. Mincsovics Emil címzetes egyetemi docens, PhD. Dr. Jekő József főiskolai adjunktus, PhD. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Mátyus Péter egyetemi tanár, DSc. Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Zelkó Romána egyetemi tanár, DSc. Dr. Márk László egyetemi adjunktus, PhD. Budapest 2010

2 Bevezetés Az alfa-1 savas glikoprotein (AGP) a humán plazmában megtalálható, pozitív akut fázis fehérjék csoportjába tartozó glikoprotein. Az AGP öt N-glikozilációs hellyel rendelkezik, oligoszacharid-tartalma meghaladja a glikoprotein tömegének 40 %- át. Az AGP nagy szerkezeti variabilitással rendelkezik. Izoformjai származhatnak az aminosav-sorrendjének eltérő jellegéből, illetve az oligoszacharidok különböző szerkezetéből. Az aminosav-sorrendben megnyilvánuló eltérések a genetikai variánsokat eredményezik. Az oligoszacharidok szintjén megnyilvánuló szerkezeti heterogenitás az oligoszacharidok különböző monoszacharid összetételére, a monoszacharidok eltérő kapcsolódási sorrendjére, valamint a monoszacharidok kapcsolódási pozícióira és ezek sztereokémiájában mutatkozó különbségekre vezethető vissza. Az izoformok analízise nagy szelektivitással és ezzel egyidőben nagy érzékenységgel rendelkező technikákat igényel. A folyadékkromatográfiával kapcsolt tömegspektrometriás (HPLC- MS) analitikai módszerek a szerkezeti variánsok sokféleségére vonatkozóan nyújtanak információt. 2

3 Célkitűzés Kutatómunkám középpontjában egyrészt az AGP genetikai variánsainak analízise, másrészt az oligoszacharidok izoformjait analizálni képes módszer fejlesztése állt. A genetikai variánsok vizsgálatára kidolgozott HPLC-MS módszer alkalmazásával célom a genetikai variánsok expressziójának megismerése volt patológiás állapotokban. Az AGP genetikai variánsainak különböző megoszlása egészséges és daganatos betegségben szenvedő csoportokban a variánsok patológiás állapotban betöltött szerepét jellemzi. A korábbi kutatási eredmények alapján egymásnak ellentmondó adatok olvashatók arról, hogy az AGP mindkét lókuszán kódolt variánsok akut fázis jelleget mutatnak-e. Kutatásaimmal célom az volt, hogy patológiás folyamatokban meghatározzam a genetikai variánsok szerepét az AGP koncentrációjának emelkedésében. Céljaim második irányvonalát az AGP oligoszacharidok szintjén bekövetkező heterogenitások jellemzése képezte. A szerkezeti variabilitás leírására új analitikai módszer kifejlesztését tűztem ki célul, amely nemcsak a különböző monoszacharidösszetételű oligoszacharidok meghatározására alkalmas, hanem a megegyező molekulatömegű izoformok jelenlétéről is adatokkal szolgál. 3

4 Módszerek Az AGP genetikai variánsainak analízisére meglévő HPLC- MS módszert alkalmaztam. A tripszinnel hasított peptidek elválasztása fordított fázisú nanoáramlású HPLC oszlopon történt. A peptidek analízise Q-Tof Premier tömegspektrométerrel valósult meg. A HPLC oszlopon elváló peptideket pozitív ionizációs technikával vizsgáltam és tandem MS mérésekkel azonosítottam. Az ORM1 és ORM2 genetikai variánsok arányának vizsgálata egy-egy peptid kiválasztásával történt. A 139 NWGLS 144 VYADKPETTK 153 peptid, az ORM1 variánsok peptidje, míg az 139 NWGLS 144 FYADKPETTK 153 peptid az ORM2 expresszióját jellemzi. Az oligoszacharidok analízisére alkalmas mintaelőkészítési protokollt kutatómunkám során fejlesztettem ki. Az első lépés az oligoszacharidok glikoproteinről történő hasítása volt. Detergensek alkalmazását követően az oligoszacharidokat Protein-N glikozidáz F enzimmel (PNGáz F) hasítottam le az AGP-ről. A lehasított oligoszacharidokat tartalmazó minta tisztítása szilárd fázisú extrakcióval (SPE) történt. Az oligoszacharidok elválasztására grafitoszlopot alkalmaztam és folyadékkromatográfiás gradienst dolgoztam ki az optimális elválasztásra. Az azonosítást és a fragmensek analízisét Q-Tof Premier tömegspektrométerrel végeztem elektrospray ionforrás alkalmazása mellett, negatív ionizációs technikával. 4

5 Eredmények - tézisek 1. Meghatároztam a genetikai variánsok arányát egészséges egyének és daganatos betegek AGP mintájában. A daganatos betegcsoportokat a limfómás, ováriumtumoros és melanómás betegcsoportok képezték. Az alkalmazott HPLC-MS módszerrel az ORM1 és ORM2 variánsok expressziójának mértékét hasonlítottam össze. Megállapítottam, hogy az egészséges és a daganatos betegségben szenvedő csoportok között különbség található az AGP plazmaszintjében. Megállapítottam, hogy a daganatos betegcsoportokban négyszeresére emelkedett az AGP koncentrációja az egészséges csoporthoz képest [1]. 2. Szignifikáns különbséget határoztam meg varianciaanalízissel az ORM2 százalékos megoszlásában az egészséges csoport és a daganatos betegcsoportok között, ugyanakkor nem volt szignifikáns különbség a betegcsoportok összehasonlítása esetén [1. ábra, 5-8]. 5

6 4.0 Kontroll-csoport Control Limfómás csoport Lymphoma Gyakoriság Frequency Gyakoriság Frequency ORM2 percentage ORM2 percentage ORM2 aránya (%) ORM2 aránya (%) Ovary Tumor Melanoma Ováriumtumoros csoport Melanómás csoport 8 7 Gyakoriság Frequency Gyakoriság Frequency ORM2 ORM2 aránya percentage (%) ORM2 ORM2 aránya percentage (%) 1. ábra: Az ORM2 variáns aránya az egészséges csoportban és a daganatos csoportokban 3. Megállapítottam, hogy a különböző lókuszhoz rendelhető genetikai variánsok mennyisége nem azonos mértékben növekszik, hanem az ORM1 variánsok expressziója fokozottabb mértékű, mint az ORM2 variánsé. A daganatos betegcsoportokban az ORM1 variánsok növekedése 4,5-szeres, az ORM2 variánsé 2-szeres az egészséges csoporthoz képest [1]. 6

7 4. Az AGP komplex, N-glikánjainak hasítására mintaelőkészítési protokollt dolgoztam ki az enzimatikus hasítási módszer optimalizálásával és a lehasított oligoszacharidok tiszítására grafittöltetű szilárd fázisú extrakciós módszer kifejlesztésével [2, 15-16]. 5. Az oligoszacharidok szerkezetének jellemzésére HPLC- MS módszert dolgoztam ki. Megállapítottam, hogy a komplex oligoszacharidok analízisére a grafitoszloppal kapcsolt tömegspektrometria részletesebb szerkezeti információkat nyújt, mint a fordított fázisú oszloppal kapcsolt tömegspektrometria [2, 4]. 6. Tandem tömegspektrometriás mérésekkel meghatároztam az oligoszacharidok izoformjainak fragmenseit. Az izoformok eltérő sztereokémiája a spektrumokon a fragmensionok molekulaionhoz viszonyított eltérő intenzitásában nyilvánult meg. [12-14]. 7. Az AGP emésztményből tömegspektrometria segítségével 18 különböző monoszacharid-összetételű oligoszacharidot detektáltam. A grafitoszlop alkalmazásával és a folyadékkromatográfiás módszer optimalizálásával az oligoszacharidok egyes izoformjait is elválasztottam egymástól [1. táblázat, 4]. 7

8 1. táblázat: Az oligoszacharidok megoszlása az AGP mintában és izomereinek száma Sorszám Név Az oligoszacharidok megoszlása %-ban Izomerek száma 1 BiS2 16,8 4 2 BiS2F1 1,3 4 3 TriS TriS2F1 3,6 2 5 TriS3 29,2 5 6 TriS3F1 10,1 4 7 TriS3F2 0,3 2 8 TetraS2 4,2 2 9 TetraS2F1 1, TetraS TetraS3F1 3, TetraS4 5, TetraS4F1 4, TetraS4F2 0, PentaS3 0, PentaS PentaS4F1 0, HexaS3 1 4 Az 1. táblázatban az oligoszacharidok rövidített nevének előtagja az antenna számát jelöli. Az S a sziálsav tartalomra vonatkozik és az S-t követő szám a sziálsav mennyiségére, az F a fukóz tartalomra vonatkozik és az F-et követő szám a fukóz mennyiségére. 8

9 Következtetések Az AGP genetikai variánsainak kutatása során kapott eredmények alapján megállapíthatjuk, hogy az egyes patológiás elváltozásokban bekövetkező AGP koncentráció-emelkedésért és az AGP akut fázis fehérje jellegéért nagyobb mértékben az ORM1 variánsok tehetők felelőssé. A glikozilációs mintázat jellemzésére kidolgozott HPLC- MS módszer alkalmas az N-glikánok szerkezetének leírására. A kifejlesztett grafitoszlopos folyadékkromatográfiás analízis egyes oligoszacharidok izoformjainak elválasztását is lehetővé teszi. A bemutatott módszerrel lehetővé válik biológiai minták glikozilációjának részletes jellemzése, a glikoproteinekről lehasított komplex oligoszacharidok szerkezeti mikroheterogenitásainak analízise. 9

10 Az értekezés témájában megjelent közlemények Publikációk 1. Lívia Budai, Olivér Ozohanics, Krisztina Ludányi, László Drahos, Tibor Kremmer, Judit Krenyácz, Károly Vékey: Investigation of genetic variants of α-1 acid glycoprotein by ultra-performance liquid chromatography mass spectrometry Analytical and Bioanalytical Chemistry 393 (2009) IF: Lívia Budai, Ferenc Pollreisz, Olivér Ozohanics, Krisztina Ludányi, László Drahos, Károly Vékey: Analysis of complex oligosaccharides using graphitized carbon liquid chromatography/mass spectrometry European Journal of Mass Spectrometry 14 (2008) IF: Előadások 3. Károly Vékey, Olivér Ozohanics, Lívia Budai, László Drahos: Glycosylation, mass spectrometry and informatics 8. Igler MS Tage organized by the Institute of Organic Chemistry, University of Innsbruck Obergurgl, február Budai Lívia: Az alfa-1 savas glikoprotein oligoszacharid-struktúráinak tömegspektrometriás analízise IX. Clauder Ottó Emlékverseny - Különdíj Budapest, április

11 5. Ozohanics Olivér, Budai Lívia, Krenyácz Judit, Ludányi Krisztina, Kremmer Tibor, Vékey Károly, Drahos László: Az alfa-1 savas glikoprotein genetikai variánsainak vizsgálata Kutatóközponti Tudományos Napok MTA Kémiai Kutatóközpont Budapest, december Ozohanics Olivér, Krenyácz Judit, Budai Lívia, Ludányi Krisztina, Kremmer Tibor, Vékey Károly és Drahos László: Az alfa-1 savas glikoprotein genetikai variánsainak vizsgálata Elválasztástudományi Vándorgyűlés 2008 Sárvár, november Ozohanics Olivér, Krenyácz Judit, Budai Lívia, Ludányi Krisztina, Kremmer Tibor, Vékey Károly és Drahos László: Analysis of genetic variants of α-1 acid glycoprotein in cancer Second Central and Eastern European Proteomic Conference Jéna, október Károly Vékey, László Drahos, Olivér Ozohanics, Lívia Budai, Judit Krenyácz, Krisztina Ludányi, Júlia Visy, Tibor Kremmer: Mass spectrometric investigation of structural variants of alpha-1 acid glycoprotein MTA Kémiai Kutatóközpont Nemzetközi Tudományos Tanácsadó Testületének nyilvános tudományos ülése Budapest, május Budai Lívia, Pollreisz Ferenc, Ozohanics Olivér, Imre Tímea, Pavel Rehulka, Helena Rehulkova, Kremmer Tibor, Ludányi Krisztina, Drahos László, Vékey Károly: Az alfa-1 savas glikoprotein oligoszacharid-struktúráinak tömegspektrometriás vizsgálata Semmelweis Egyetem PhD Tudományos Napok - Különdíj Budapest, április

12 10. Drahos László, Krenyácz Judit, Nagy Kornél, Ozohanics Olivér, Budai Lívia, Kremmer Tibor, Ludányi Krisztina, Imre Tímea, Vékey Károly: Glikoprotein biomarkerek tömegspektrometriás vizsgálata XXXVIII. Kromatogáfiás továbbképző tanfolyam MTA Szegedi Akadémiai Bizottság Székháza Szeged, január Drahos László, Krenyácz Judit, Ozohanics Olivér, Budai Lívia, Kremmer Tibor, Ludányi Krisztina, Vékey Károly: Glikoprotein biomarkerek tömegspektrometriás vizsgálata A Magyar Proteomikai Társaság Vándorgyűlése Villány, november Poszterek 12. Budai Lívia, Ozohanics Olivér, Ludányi Krisztina, Drahos László, Vékey Károly: Az alfa-1 savas glikoprotein glikozilációs mintázatának vizsgálata Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XIV. Budapest, november Lívia Budai, Ferenc Pollreisz, Oliver Ozohanics, Krisztina Ludányi, László Drahos, Károly Vékey: Glycosylation pattern analysis with mass spectrometry OBEKON symposium Budapest, október Lívia Budai, Ferenc Pollreisz, Olivér Ozohanics, Krisztina Ludányi, László Drahos, Károly Vékey: Mass spectrometric analysis of oligosaccharides of alpha-1 acid glycoprotein 27th Informal Meeting on Mass Spectrometry Austria, Retz, május

13 15. Budai Lívia, Pollreisz Ferenc, Ozohanics Olivér, Ludányi Krisztina, Drahos László, Vékey Károly: Oligoszacharidok tömegspektrometriás analízise Semmelweis Egyetem PhD Tudományos Napok Budapest, március Budai Lívia, Pollreisz Ferenc, Ozohanics Olivér, Kremmer Tibor, Budai Marianna, Ludányi Krisztina, Drahos László, Vékey Károly: Komplex oligoszacharidok elválasztása grafitoszlopon Elválasztástudományi Vándorgyűlés, 2008 Sárvár, november 5-7. Egyéb közlemények jegyzéke 17. Marianna Budai, Mária Hajdú, Lívia Budai, István Antal, Katalin Lenti, Imre Klebovich: Liposomal hydrogels and soft contact lenses for the delivery of antibiotics in ophthalmology Nova Science Publishers, Inc., USA Hydrogels: Properties, Preparation and Applications Book chapter, In press (2009) 18. Marianna Budai, Patricia Chapela, Lívia Budai, Melinda E. Wales, Ilona Petrikovics, Andreas Zimmer, Pál Gróf, Imre Klebovich, Maria Szilasi: Liposomal oxytetracycline and doxycycline: studies on enhancement of encapsulation efficiency Drug Discoveries and Therapeutics 3 (2009) Petrikovics, M. Budai, S.I. Baskin, G.A. Rockwood, J. Childress, L. Budai, P. Gróf, I. Klebovich, M. Szilasi: Characterization of liposomal vesicles encapsulating rhodanese for cyanide antagonism Drug Delivery 16 (2009) IF:

14 20. Kaszás Nóra, Budai Marianna, Budai Lívia, Gróf Pál, Andreas Zimmer, Klebovich Imre: A bezárási hatásfok növelésének lehetőségei liposzómába zárt lomefloxacinnál Acta Pharmaceutica Hungarica 78 (2008) Lívia Budai, Mária Hajdú, Marianna Budai, Pál Gróf, Szabolcs Béni, Béla Noszál, Imre Klebovich, István Antal: Gels and liposomes in optimized ocular drug delivery: Studies on ciprofloxacin formulations International Journal of Pharmaceutics 343/1-2 (2007) IF: