Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló analitikai módszerek II. Áramlási citofluorimetria Konfokális lézerpásztázó mikroszkópia

Átírás

1 Antigén ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló analitikai módszerek II. Áramlási citofluorimetria Konfokális lézerpásztázó mikroszkópia Biológiai Intézet Immunológiai Tanszék Uzonyi Barbara

2 Fluoreszcens technikák érzékeny (10-12 mol is mérhető), nagy mérési tartományt tud lefedni térbeli és időbeli feloldást is lehetővé tesz nem veszélyes (vs. radioaktív technikák) egyszerre több jel mérhető ugyanabban a mintában élő sejtek vizsgálatára is alkalmas Módszerek / műszerek: spektrofluorimetria fluoreszcens scanner FLIA DNS-szekvenálás és DNS-detektálás (qrt-pcr) áramlási citometria fluoreszcens mikroszkópia (FISH, CLSM)

3 Az áramlási citométer felépítése BD FACSCanto II

4 Az áramlási citométer felépítése Fluidikai rendszer Hidrodinamikai fókuszálás: - lamináris áramlás - véd és irányít - mérendő részecskék rendezése minta köpenyfolyadék Molecular Probes Tutorial

5 Az áramlási citométer felépítése Lézer megvilágítás gerjesztés sárgászöld hullámhossz (nm) UV közeli UV violett sötétkék kék zöld narancs vörös 325/ / / Molecular Probes Tutorial

6 Az áramlási citométer felépítése optikai rendszer Lencsék, tükrök, szűrők fókuszálják a fényt gyűjtik és felosztják a szórt és emittált fényt Molecular Probes Tutorial

7 Az áramlási citométer felépítése Detektorok Számítógép citométer vezérlése adatgyűjtés és -tárolás analízis FL FSC SSC Detektorok fotodiódák vagy fotoelektronsokszorozók optikai jelet elektromos jellé alakítják jelerősítés Molecular Probes Tutorial

8 Mérés Fényút a mérőcellában minta: sejt/ml áramlási sebesség: µl/perc ~ sejt/másodperc >10000 sejt/minta mérésenként Molecular Probes Tutorial

9 Mért paraméterek Oldalra irányuló fényszórás (SSC) Előre irányuló fényszórás (FSC) Fluoreszcencia 1-6 (18) csatornában Molecular Probes Tutorial

10 Mért paraméterek Előre irányuló fényszórás (forward scatter, FSC) fényelhajlás arányos a sejt méretével a megvilágító fény tengelyén mérjük (megvilágító fény blokkolása!) Előre irányuló fényszórás (FSC) Oldalra irányuló fényszórás (side scatter, SSC) fényszórás és fénytörés arányos a sejt belső komplexitásával a megvilágító fényre merőlegesen mérjük Oldalra irányuló fényszórás (SSC)

11 Mért paraméterek Fluoreszcencia Gerjesztett állapot gerjesztés emisszió Abszorbeált fény Alapállapot Emittált fény

12 A fluoreszcencia forrása 1. autofluoreszcencia aromás aminosavak, NADH, NADPH jelölés direkt indirekt Fluorokróm Antitest Antigén DNS sejtfelszíni intracelluláris fixálás, permeabilizálás Fluoreszcens nukleinsav festékek Egyéb fluoreszcens próbák: ph intracelluláris ionok membránpotenciál reaktív oxigéngyökök organellum transzportfehérjék enzimszubsztrátok...

13 relatív intenzitás (%) A fluorofórok spektrális tulajdonságai FITC (fluoreszcein-izotiocianát) gerjesztő lézer (488 nm) detektált hullámhossztartomány gerjesztési spektrum emissziós spektrum hullámhossz (nm) melyik hullámhosszon optimális az adott fluorofór gerjesztése milyen hullámhossztartományban célszerű detektálni

14 Az adatok ábrázolása Hisztogram: egyparaméteres gyakoriság eloszlás x-tengely: mért szignálintenzitás y-tengely: adott intenzitáshoz tartozó eseményszám Eloszlás méret alapján Előre irányuló fényszórás (FSC) Eloszlás granuláltság alapján Oldalirányú fényszórás (SSC)

15 Az adatok ábrázolása Felhődiagram ( Dot-Plot ): kétparaméteres ábrázolás x- és y-tengelyen is egy mért paraméter intenzitás eloszlása van Humán vérminta FSC SSC képe a vörösvértestek lízise után granulociták monociták limfociták Molecular Probes Tutorial

16 Az adatok ábrázolása dot plot density plot contour plot

17 Sejtszám Az adatok ábrázolása fluoreszcencia jelöletlen sejtek (autofluoreszcencia) Relatív fluoreszcenciaintenzitás jelölt sejtek Az emittált fluoreszcens fény intenzitása arányos a sejtek által megkötött fluorokróm molekulák számával.

18 Fluoreszcenciaintenzitás 2 (narancs) Az adatok ábrázolása fluoreszcencia Jelölés többféle ellenanyaggal / festékkel Fluoreszcenciaintenzitás 1 (zöld)

19 Sejtszám SSC SSC Az adatok ábrázolása kapuzás Kapuzás ( gating ): egy adott sejtpopuláció kijelölése CD45+ limfociták granulociták monociták CD3 CD3+ Fluoreszcenciaintenzitás CD3 (CD3) CD3 B-sejtek NK-sejtek CD3+ T-sejtek CD45 CD3+ CD3 Fluoreszcenciaintenzitás (CD3)

20 Citométerrel mérhető minták Részecskék / sejtek szuszpenzióban (~300 nm 100 µm) alvadásgátolt vér, köldökzsinórvér, vérkészítmények testfolyadékok, pl. csontvelő, gerincvelői folyadék, ízületi folyadék, tüdőváladék, ejakulátum... szövetek (a sejtek szuszpenzióba hozása után) tenyésztett sejtvonalak gyöngyök (latexpartikulumok kalibráláshoz, szolubilis molekulák méréséhez) mikroorganizmusok (baktériumok, gombaspórák, egysejtűek) természetes vizekből, tenyészetekből, testfolyadékokból... exoszómák, mikrovezikulák kromoszómák...

21 CD4+ limfociták száma /µl vér Immunológiai vizsgálatok: HIV-fertőzöttek diagnosztizálása és monitorozása Opportunista fertőzések Idő (évek) Kent, Stephen J (June 2017) HIV Vaccine Approaches. In: els. John Wiley & Sons, Ltd: Chichester. Wilcox CM & Saag MS, Gut2008;57:

22 Immunológiai vizsgálatok: HIV-fertőzöttek diagnosztizálása és monitorozása Diagnózis: szerológiai vizsgálatok (pl. plazmában antitestek és virus kimutatása) + hematológiai vizsgálatok CD4+ > CD8+ Egészséges CD4+ < CD8+ Beteg

23 Immunológiai vizsgálatok: HIV-fertőzöttek diagnosztizálása és monitorozása CD3/CD4/CD8/CD45 Kalibrációs gyöngyök segítségével meghatározható az abszolút sejtszám. Normál tartomány: CD4+: %, sejt/µl* CD8+: %, sejt/µl* Abszolút CD4+ sejtszám szükséges - profilaktikus kezelés esetén (opportunista fertőzések) - antiretrovirális terápia megkezdése előtt * Bisset RL et al., 2004 Eur J Haematol. 72(3):

24 Immunológiai vizsgálatok: Mielóma multiplex malignus B-sejt limfóma monoklonális plazmasejtszaporulat a csontvelőben paraprotein / M-Protein (kóros immunglobulin) Diagnosztika: Labor vizelet- és vérvizsgálatok képalkotó eljárások immunfenotipizálás csontvelővizsgálatok Takeda Oncology

25 Immunológiai vizsgálatok: Mielóma multiplex betegségkövetés Plazmasejtek a csontvelőben Minimális reziduális betegség kimutatása Molekuláris biológiai módszerek: allélspecifikus PCR, NGS - érzékenyebbek lehetnek - drágábbak - diagnosztikai mintának kell lenni a terápia előtt - nem rutin laboratóriumi eljárások abnormális plazmasejtek normál plazmasejtek többi csontvelői sejt CD45 /CD38 dim /CD19 /CD56 + /CD27 /CD81 /CD117 + /cykappa + Jelinek et al., Blood Cancer J Oct; 7(10):e617.

26 Sejtaktivitás mérése fagocitózisteszt Neutrofil granulociták: veleszülett immunrendszer sejtjei fehérvérsejtek 65-70%-a baktériumok, gombák eliminációja kemotaxis, fagocitózis, reaktív oxigéngyökök termelése Funkciózavarok: veleszületett immundefektus tumor, krónikus fertőzések, AIDS, TBC iatrogén funkcióvesztés pl. immunszuppresszív kezelés

27 Sejtaktivitás mérése fagocitózisteszt Fagocitózis teszt Heparinos vér + opszonizált jelölt E. coli Inkubálás 37 C-on A festék cask akkor fluoreszkál, ha alacsony a közeg ph-ja vagyis bekerült a fagolizoszómába.

28 DNS-tartalom mérése DNS-festékek kötődése apoptózis sejtciklus analízis ploiditás vizsgálat ivarsejtek válogatása proliferáció beépült nukleotid-analóg jelölése fluoreszcensen mindig sztöchiometrikusan kötnek (mennyiségi meghatározás) membránpermeábilis és impermeábilis festékek

29 sejtszám sejtszám DNS-tartalom mérése proliferáció sejtciklus fluoreszcenciaintenzitás fluoreszcenciaintenzitás (PI) Hang & Fox, Methods Mol Biol. 2004;241:23-35.

30 fikoeritrin FI klorofill FI Klorofill fluoreszcencia klorofill FI klorofill FI Óceanográfia természetes fikobiliproteinek Fitoplanktonok azonosítása Mit eszik a kagyló? T 0 SSC FSC 20 h SSC fikoeritrin FI Marie D et al., Alice Longobardi Givan: Flow cytometry: first principles (Wiley, 2001) FSC

31 Antibiotikumrezisztencia mérése centrifugálás és reszuszpendálás Inokulálás DiBAC 4 (3): fluoreszcens festék a membránpotenciál változásának mérésére kontroll és 6 minta baktériumok növesztése Min Inkubálás: antibiotikum és DiBAC 4 (3) 120 Min citometria Nuding and Zabel. J Bacteriol Parasitol 2013, S:5

32 Antibiotikumrezisztencia mérése E. coli izolátum antibiotikumrezisztencia vizsgálata Kirby-Bauer korongdiffúziós teszt (24 h) Nuding and Zabel. J Bacteriol Parasitol 2013, S:5

33 Multiplex citometria citokinmérés Multiplex áramlási citometriás mérés CBA Cytokine Bead Array (Beckton Dickinson) Nagy számú analit mérése akár 1 mintából (vs ELISA, ahol sok mintából 1 analit mérése) Nem tudjuk, hogy melyik populáció termelte az adott citokint (ELISA-nál sem) Detektálható citokinek: IFNγ, IL-10, IL-6, IL-4, IL-2, TNFα... Felhasználható mintatípusok: szérum, plazma, sejtkultúra felülúszója gyöngyök minta mosás citometriás mérés koncentráció detektáló antitestek standardgörbe

34 Multiplex citometria citokinmérés citometriás mérés FITC (FL1) PE (FL2) + APC (FL3)

35 Sejtválogatás - szortírozás FACS: fluorescence-activated cell sorting

36 Fluoreszcens mikroszkópia szelektív csak a jelölt molekulákat látni térbeli és időbeli meghatározás minta: adherens és kitapasztott sejtek is jelölés gyakorlatilag azonos a citometriással detektor kamera fotoelektronsokszorozó Paramecium sp. emissziós filter fényforrás lézer lámpa excitációs filter dikroikus tükör minta

37 Lézer pásztázó konfokális mikroszkóp (CLSM) élő sejtek, folyamatok vizsgálata (live cell imaging) pontos lokalizáció kolokalizáció, FRET hátrányok, nehézségek: kevés sejtről ad információt (citometriához képest) lassabb (felbontástól függően) adott idő alatt kevesebb sejt mérése fluorofórok halványodása, kiégése max. 4 paraméter

38 Széles mező megvilágítás (WF) vs. pont szkennelés (CLSM) széles mező konfokális minta lyukdiafragma pinhole 0,25 0,8 µm széles 0,5 1,5 µm mély fényforrás

39 Lézer pásztázó konfokális mikroszkópia optikai szeletelés fokális sík < minta vastagsága kép több fokális síkból leképezi az egész mintát fókuszon kívüli jelek kizárása napraforgó pollen (széles mező, epifluoreszcens kép) cam.facilities.northwestern.edu µm nagy 0,5 µm-es szeletek

40 Kontrasztfelvételek Fibroblasztok fázis kontraszt sejtmag (DAPI) egymásra vetítve Külön felvételek, digitálisan egymásra vetítve (merge, overlay) A fluoreszcens jel lokalizációja Macska agyszövet, Criptococcus fertőzés differencia interferencia kontraszt neuron (FITC) Criptococcus (kongóvörös) egymásra vetítve Fázis kontraszt (PC): speciális kondenzor + fáziskontraszt objektív megnövelt kontraszt vékony (0,1 1 µm) mintáknál Differencia interferencia kontraszt (DIC): polarizátor + prizmák relief-szerű kép relatív vastag minták is vizsgálhatók így

41 Összefoglalás Áramlási citometria gyors multiparaméteres sok sejtről ad információt (statisztika) adherens sejtek, szövetek nem fiziológiásan lokalizáció nem mérhető időbeli folyamatok csak populációszinten adatok archiválása könnyű minta (szuszpenzió) Konfokális lézer pásztázó mikroszkópia lassabb (adott idő alatt kevesebb sejt mérhető) max. 4 paraméter kevesebb sejtről ad információt adherens sejtek, szövetek is fiziológiásan pontos térbeli lokalizáció időbeli folyamatok sejtszinten mérhetők adatok archiválása nehézkes (nagy méretű fájlok) minta (hordozón) fényszórás fluoreszcencia kontrasztkép fluoreszcencia

42 Köszönöm a figyelmet! www. cellcartoons.net