Sejtkultúra előállítása, steril munka feltételei Immunsejtek izolálása és funkcionális vizsgálata április 15. Kremlitzka Mariann, PhD

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Sejtkultúra előállítása, steril munka feltételei Immunsejtek izolálása és funkcionális vizsgálata április 15. Kremlitzka Mariann, PhD"

Zsuzsanna Vass
4 évvel ezelőtt
Látták:

1 Sejtkultúra előállítása, steril munka feltételei Immunsejtek izolálása és funkcionális vizsgálata április 15. Kremlitzka Mariann, PhD

2 Miért tartunk fenn sejtkultúrákat? Egy sejt vizsgálat Kontrollált körülmények Hatóanyagok környezettől független vizsgálata Hátrány: nem komplex, in vitro evolúció primér (elsődleges) ill. szekunder (másodlagos) kultúra: az eredeti szervből, szövetből frissen eltávolított sejtekből illetve azok egyszeri átoltása (passzálása) révén készült kultúra; sejttörzs: a primer kultúrából néhány passzálás után kialakult, véges élettartamu (kb passzálás) sejtkultúra; sejtvonal: genetikailag viszonylag homogén, megfelelo körülmények között korlátlan ideig fenntarthato sejtkultúra. A legtöbb esetben vagy normál sejtek in vitro (kultúrában történo ) transzformációjával (retrovirális transzdukciós onkogéntranszfekcio révén) vagy tumor sejtek felhasználásával nyerik a sejtvonalakat.

Limfoid sejtek: T-sejt és B-sejt kultúrák Letapadó sejtek: EDTA-s vagy

3 Sejtkultúrák fenntartása Szuszpenzióban növő sejtek: centrifugálás vagy egyszerű higítás Pl. Limfoid sejtek: T-sejt és B-sejt kultúrák Letapadó sejtek: EDTA-s vagy tripszines emésztés, centrifugálás Pl. Epitél és fibroblaszt sejtek, makrofágok, dendritikus sejtek Letapadó sejtek (kontakt gátlás) Szuszpenzióban növő sejtek

4 Sejtkultúra készítés és fenntartás: STERILEN, csíramentesen = fülke alatt Pipetták Steril tenyésztőedények CO 2 termosztát/inkubátor Steril fülke Steril tápfolyadék (savó (KHS,FCS),antibiotikum stb.)

5 Tápfolyadék (médium) Feladata: biztosítja a növekedéshez szükséges tápanyagokat Többféle (RPMI, DMEM, IMDM, stb.), sejttípustól függ (ATCC honlap) Összetétel: sóóldat glükóz esszenciális aminosavak: pl. hisztidin, leucin, izoleucin, stb. vitminok: pl. folsav, nikotinamid, kolin, pantoténsav, stb. Pufferrendszer: ph fenntartásához, általában CO 2 /bikarbonát (HEPES, 25mM) Fenolvörös: ph indikátor savas: sejtek túlnőttek CO 2 konc. növekedés, sárga a médium lúgos: sejtek nem nőnek, lila a médium Szérum: általában FCS (magzati borjú szérum/fetal calf serum), 5-20% mennyiségben, olyan faktorokat tartalmaz, mely nélkülözhetetlen a növekedéshez

6 Steril munkavégzés szabályai A sejtlaboratóriumi munkavégzés során mindig viseljünk lehetőleg erre a célra rendszeresített köpenyt. A munka megkezdése előtt és befejezése után mindig alaposan mossunk kezet. Az egészségre veszélyes sejtkultúrák esetén viseljünk kesztyűt. Használat előtt és után illetve különböző fajtájú sejtek kezelése között a munkafelületet mossuk le 70 %-os alkohollal. A felület lemosása a fülke belsejéből kifelé történjen. A médiumot illetve a különböző oldatokat tartalmazó üvegeket mossuk le alkohollal, mielőtt a fülkébe tesszük őket. Vigyázzunk arra, hogy a nyitott edények felett ne nyúljunk át, hogy se az edények szája, sem az alkalmazott egyéb eszközök (pl. pipetták) ne érjenek hozzá semmihez. Mycoplasma teszt!!!

Immunkompetens sejtek izolálása Primer sejtek (állati, emberi): lép tímusz csontvelő nyirokcsomó, mandula hasüreg, tüdő, bélrendszer VÉR Vér Vérplazma (60%) + alakos elemek (40%) - eritrociták

7 Immunkompetens sejtek izolálása Primer sejtek (állati, emberi): lép tímusz csontvelő nyirokcsomó, mandula hasüreg, tüdő, bélrendszer VÉR Vér Vérplazma (60%) + alakos elemek (40%) - eritrociták ( *10 6 /ml) - trombociták ( *10 6 /ml) - leukociták (5-10*10 6 /ml) Granulociták (neutr, bas, eos.) 65% Limfociták 30% monociták -5% Sejtvonalak: Korlátlanul osztódó állati és humán eredetű sejtek immortalizált sejtvonalak előny: könnyű fenntarthatóság

8 Immunsejtek aránya a különböző immun-szervekeben Fontos, hogy mit akarunk izolálni és mennyire könnyen hozzáférhető a forrás!!! B-sejt: csontvelő (m), mandula (h), lép(m), nyirokcsomók (m) T-sejt: tímusz (m), vér (h), lép (m), nyirokcsomók (m) NK sejt: vér (h) Monocita/Mf: vér (h), hasüreg (m) Dendritikus sejtek: alacsony sejtszám, izolálás lépből vagy differenciáció csontvelői sejtekből (m), vér-eredetű monocitákból (h, m) Neutrofilek: vér (h), csontvelő (m), tüdő (m) Tüdő, hasüreg, GALT, stb m: mouse, h: human

9 Sejtek izolálása egérből tímusz lép csontvelő 1. vvs mentesítés - ACK 2. szervek dezintegrálása, szűrés 3. sejtek festése, számolása: tripán kék életképesség Elpusztult sejt élő sejtek

10 Sejt koncentráció beállítás sejtszámláló kamrák Típusok: Bürker kamra Neubauer kamra Thoma Bürker-Türk Fuchs-Rosenthal Etc. A BÜRKER kamra 0.1 mm Részecske/uL= számolt részecske / (a számolt felszín területe * a kamra mélysége * higítás)

11 Ember: immunsejtek fő forrása a vér!!! +mandula, szinoviális folyadék, tüdő, stb. Limfocita populációk megoszlása ember vérben

12 Sűrűség-grádiens centrifugálás: eltérő fajsúlyú sejtek elkülönítése cukoroldattal

Sűrűség-grádiens centrifugálás: eltérő fajsúlyú sejtek elkülönítése Centrifugálás PBMC=PMNS: Vér (alvadásgátolt) Sűrűséggradiens médium (Ficoll, Lymphoprep,

13 Sűrűség-grádiens centrifugálás: eltérő fajsúlyú sejtek elkülönítése Centrifugálás PBMC=PMNS: Vér (alvadásgátolt) Sűrűséggradiens médium (Ficoll, Lymphoprep, density:1.077g/ml VVT + granulociták + halott sejtek perifériás mononukleáris sejtek 85% T+B 15% Mo Adherens sejtek (Mo) eltávolítása: adherencia (kitapasztás) Monociták

Sűrűség-grádiens centrifugálás: alternatív módszerek RosetteSep módszer: https://www.stemcell.

14 Sűrűség-grádiens centrifugálás: alternatív módszerek RosetteSep módszer: A nemkívánt sejteket VVT-estekkel aggregáltatjuk ellenanyagok segítségével Előny: gyors, egylépéses folyamat, kis mennyiségű vér esetén is használható Hátrány: tisztaság

com/sepmate-hassle-free-pbmcs-in-just-15-minutes.

15 Sűrűség-grádiens centrifugálás: alternatív módszerek SepMate módszer (sejtizoláló csövek): 10perc Előny: gyors, egylépéses folyamat, kb. 20perc Hátrány: drága

16 Sűrűség-grádiens centrifugálás: Vérsejtek izolálása Monociták: PBMC rétegből, kitapasztás vagy mágneses sejtszortírozás vagy szortolás áramlási citométerrel B-sejtek: PBMC rétegből mágneses sejtszortírozással vagy szortolás áramlási citométerrel Monocita-mentes réteg: birkavvt rozettaképzés T-sejtek: PBMC rétegből mágneses sejtszortírozással vagy szortolás áramlási citométerrel Monocita-mentes réteg: birkavvt rozettaképzés, majd VVT lízis Neutrofil granulociták: Vérből VVT lízis után szortolás áramlási citométerrel Ficoll alatti réteg, VVT-k lízise vagy dextrán (1%) ülepítés Bazofil és eozinofil granulociták: Vérből Percoll oldattal, illetve mágneses sejtszeparálás Vérből VVT lízis után szortolás áramlási citométerrel

17 Mit tegyünk, ha CSAK 1-féle sejttípusra van szükségünk: JOLLY JOKER-ekJ Mágneses sejtszeparálás Sejtszortírozás áramlási citometriás módszerrel

18 Mágneses sejtszeparálás MACS: magnetic associated cell sorting 1. A sejteket azok sejtfelszíni molekuláira specifikus mágneses mikorgyöngyökkel kapcsoljuk össze 2. A sejtszuszpenziót mágneses térbe helyezzük 3. Pozitív vagy negatív szelekció révén tiszta sejtpopulációt nyerünk ki

Negatív szelekció: a nem-kívánt sejt(ek)hez kapcsoljuk a mikrogyöngyöt 3.

19 Mágneses sejtszeparálás MACS: magnetic associated cell sorting 1. Pozitív szelekció: a kívánt sejthez kapcsoljuk a mikrogyöngyöt 2. Negatív szelekció: a nem-kívánt sejt(ek)hez kapcsoljuk a mikrogyöngyöt 3. Depléció: az eltávolítandó sejthez kapcsoljuk a mikrogyöngyöt Pozitív szelekció Negatív szelekció Depléció

20 Sejtszortírozás áramlási citofluorimetriával FACS: fluorescence activated cell sorting 1. Áramlási citofluorimetrián alapszik: mágneses gyöngyök helyett fluoreszcensen jelölt ellenanyagokat alkalmazunk a sejtek jelölésére, elkülönítésére 2. Pozitív vagy negatív szelekció Előny: nagy tisztaság a többféle marker használatának közönhetően Hátrány: drága, speciális műszer

21 A sejtszeparálás hatékonyságának ellenőrzése Áramlási citofluorimetriás méréssel CD19, CD20: B sejt marker CD3: T sejt marker CD16 + CD56: NK sejt marker CD14 + CD16. monocita, Mf marker CD11c+, CD14-: DC marker

22 Köszönöm a figyelmet!!!

Hasonló dokumentumok

Lukácsi Szilvia

Immunológia II GY 2018.04.13. Lukácsi Szilvia 7. Sterilitás, in vitro sejttenyésztés Az immunrendszer sejtjeinek izolálása, azonosítása és funkcionális vizsgálata: I. Monociták, makrofágok, dendritikus