BIOLÓGIAI HATÓANYAGOK TESZTELÉSE BIOTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREKKEL

Átírás

1 Az élettudományi-klinikai felsőoktatás gyakorlatorientált és hallgatóbarát korszerűsítése a vidéki képzőhelyek nemzetközi versenyképességének erősítésére TÁMOP C-13/1/KONV BIOLÓGIAI HATÓANYAGOK TESZTELÉSE BIOTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREKKEL 10. előadás PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR GYÓGYSZERÉSZI BIOTECHNOLÓGIA TANSZÉK

2 MIRE KELLENEK AZ EMBERI SZÖVETEK A GYÓGYSZERÉSZETBEN? TÁMOP C-13/1/KONV R&D Gyógyszerhatóanyagok toxicitásának és hatékonyságának tesztelésére In vitro klinikai előtesztelés (?)

3 HATÓANYAG SZELEKCIÓ FŐBB LÉPÉSEI 100 Komplex emberi szöveti rendszereken tesztelés beiktatása 30 19,5 10,7 5,8 4 1,9 1,3 1,3

4 EMBERI SZÖVETEK MODELLEZÉSE

5 JELENLEG ELŐÁLLÍTOTT SZÖVETEK Szívizom Vese Idegszövet Máj Tüdőszövet

6 FELHASZNÁLT SEJTEK FORRÁSA Embrionális őssejt (ES) Indukált őssejt (isc) Szöveti (felnőtt) őssejt Differenciált szöveti sejtek

7 AZ EMBERI EMBRIONÁLIS ŐSSEJTEKKEL JELLEMZŐI Halhatatlanság és telomeráz expresszió Pluripotencia és teratóma formálódás Normál euploid kariotípus fenntartása hosszú távú kultúrákban Klonalitás Kiemelt expressziós szintű transzkripciós faktorok: octamer binding protein 4 (Oct 4) és más, pluripotencia markerek, pl. specifikus embrionális antigének 3 és 4 (SSEA 3 +4), tumour-kilökődési antigen (TRA) 1-60 és 1-81, alkalikus foszfatáz, és sejtfelszíni antigének CD9, CD24 és Nanog Képesség a kiméra-formálódásra blasztociszta injekció segítségével (humán embriókban etikai okok miatt nem használják)

8 A FELNŐTT ŐSSEJTEK FORRÁSA Ectodermális szövetek: bőr, szemek, agy Endodermális szövetek: gasztrointesztinális rendszer, tüdő, máj és hasnyálmirigy Mesodermális szövetek: csontvelő, vázizomzat, zsír, szív és vese

9 EMBERI EMBRIONÁLIS (ES) ÉS FELNŐTT ŐSSEJTEK (ASC) ÖSSZEHASONLÍTÁSA TÁMOP C-13/1/KONV Hozzáférhetőség Stabilitás Differenciációs potenciál Etikai kérdések Regeneráló képesség in vivo Teratóma kockázat Telomeráz expresszió Humán embrió őssejtek A kezdeti tisztítás nehézkes, de amennyiben sikerül, úgy fenntartásuk viszonylag könnyű. Számos sejtvonal létezik. Normál kariotípus fenntartható sejtkultúrában, de abnormalitásokat már leírtak néhány sejtvonalon. Feltételezhetően a passage módszertani kivitelezése indukálhatja. Hosszútávú in vivo stabilitás nem ismert (nem tesztelt emberben). Pluripotens Számos országban probléma, vallási avagy morális okok miatt. Igen, néhány állat kísérletben. A meglévő sejtvonalak zöme nem használható emberi beültetésre A megfelelően tisztított sejtek képesek teratómát képezni in vivo Magas a sejtek határozatlan ideig képesek osztódni Humán felnőtt őssejtek Ezek a sejtek általában ritkák és nehéz a tisztításuk, izolálásuk. A belőlük készített kultúrák fenntartása nehéz. Sejtvonalak egyelőre nem léteznek. In vitro genetikai stabilitás nem ismert, de in vivo hosszútávú fenntarthatóságról vannak adatok (e.g. csontvelő transzplantáció). Mikrokörnyezet változik(hat) a kor előrehaladtával in vivo avagy betegség következtében, ami a sejtek differenciáltságát és számát befolyásolja. Multipotens, néhány ASC lehet pluripotens Sokkal kisebb az ES-hez képest, mert nem involválja egy embrió megsemmisítését. Igen, számos állatkísérlet bizonyítja. Továbbá autológ és allogén transzplantátumok emberben. Nem képeznek teratómákat in vivo transzplantációkor Alacsony elöregszenek, osztódóképességük korlátozott

10 A CSONTVELŐ EREDETŰ ŐSSEJTEK IZOLÁLÁSÁNAK LÉPÉSEI TÁMOP C-13/1/KONV Plazma / zsír Ficoll Ficoll Mononucleáris sejtek Kolónia formáló egység (CFU / Differenciációs assay Friss csontvelő aspirátum Vörös vértestek Mágneses jelölés után végzett sejt szortolás (MACS) Centrifugálás In vitro felszaporítás & betegbe juttatás Fluorescens jelölés után végzett sejt szortolás (FACS)

11 VÁLTOZATOS ELŐÁLLÍTÁSI MÓDSZEREK

12 ELŐÁLLÍTÁSI MÓDSZEREK Típusai: Előre elkészített váz alapú Előkészített váz mentes Szövet készítése szempontjából: Vázra szélesztett Nyomtatott Ülepített

13 AZ IDEÁLIS VÁZ (SZKAFFOLD) Elősegíti a sejtek interakcióját és szövetté alakulását Megfelelő mechanikai támogatást nyújt Megfelelő környezetet biztosít a sejtszabályozáshoz Degradációra képes a szövet formálódása után A degradációs termékek nem toxikusak és könnyen eltávolíthatók Elősegíti a vaszkularizációt és a tápanyagok sejtekbe jutását Elősegíti a sejtek adhézióját Elősegíti a normális ph és ozmolaritás fenntartását

14 A LEGGYAKRABBAN HASZNÁLT SZINTETIKUS VÁZ POLIMEREK TÁMOP C-13/1/KONV C H O 3 C H C O n Poly(lactic acid) (PLA) DL form degrades in approx 6months L form degrades in more than 1 year C H C 2 O O n Poly(glycolic acid) (PGA) Degrades in approx 1 month C H 3 O O C H C O n C H C 2 O n Poly(lactic acid-co- glycolic acid) (PLGA) Tuneable degradation of 2 weeks to 6 months

15 BIOPRINTER (SZÖVETNYOMTATÓ) Prof Forgács Gábor

16 CSŐ ( ÉR ) NYOMTATHATÓ TÁMOP C-13/1/KONV

17 A VÁZ ALAPÚ SZÖVET ELŐÁLLÍTÁSÁNAK KONCEPCIÓJA TÁMOP C-13/1/KONV Sejtek In vitro expanzió Forgatásos Szövet Jelek Sejtek a szkaffoldon Bioreaktor kultúrák Szkaffoldok Kevertetett 3D szövet terápiában

18 VÁZMENTES TÜDŐSZÖVET ELŐÁLLÍTÁSA No stem cells SAEC NHLF HMVEC-L SPC Nucleus 100μm

19 EMBERI TESZT-SZÖVETEK JELLEMZŐI IN VITRO Megbízható és reprodukálható sejtes szöveti összetétel Génállomány manipulálható, ha szükséges (pl. rekombináns vírusok felhasználásával) A gén expresszió és a sejttípusok lokalizációja nyomon követhető a szöveti rendszerben Betegségmodellek előállíthatóak beteg primer szövetekből izolált sejtek felhasználásával Betegség modellekben szelektív toxicitás és hatékonyság vizsgálható Immunrendszer is hozzáadható a szövetekhez kontrollált körülmények között

20 GÉNEXPRESSZIÓS VÁLTOZÁSOK AZ IN VITRO ELŐÁLLÍTOTT TÜDŐSZÖVETBEN A SEJTES ÖSSZETÉTEL ÉS SZÖVETKULTÚRA TÍPUSÁNAK FÜGGVÉNYÉBEN Gének SAEC 2D monolayer SAEC-NHLF 3D spheroid SAEC- NHLJ- HMVEC-L spheroid Pro-surfactant protein C Surfactant protein A Aquaporin Aquaporin 4,5 - -/+ + CC10 -/+ + + Proinflammatory cytokines (IL1b, IL6, IL8) ++ -/+ -/+ E-cadherin N-cadherin + -/+ -/+ VE-cadherin Drug tranporter

21 BETEGSÉG MODELLEK A TÜDŐBEN Tüdőrák epitél fibroblaszt Tüdőrákos sejtvonal COPD epitél COPD-epitél fibroblaszt Cisztás fibrózis epitél Cisztás fibrózisos sejtek fibroblaszt

22 IN VITRO KLINIKAI KIPRÓBÁLÁS? Kiértékelés Kezelés Dúsítás 3D Szövetek előállítása Betegséget hordozó szövetek Betegséget hordozó sejtek izolálása Szekvenálás Fluorescens mikroszkóp Áramlási citometria

23 KÖSZÖNÖM A FIGYELMET JELEN MUNKA AZ EURÓPAI UNIÓ TÁMOGATÁSÁVAL, AZ EURÓPAI SZOCIÁLIS ALAP TÁRSFINANSZÍROZÁSÁVAL VALÓSUL MEG, AZ ÉLETTUDOMÁNYI-KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE CÍMŰ, TÁMOP C-13/1/KONV AZONOSÍTÓSZÁMÚ PROJEKT KERETÉBEN.