Dr. Kelemen Péter György. Ph.D. Tézis

Átírás

1 Ph.D. Tézis Tolerogén dendritikus sejtek: monocita eredetű dendritikus sejtek immunmodulációja n-butiráttal, pirrolidin ditiokarbamát (PDTC) NFκB-gátlószerrel, valamint WHI-P-154 Janus-kináz 3-gátlószerrel Dr. Kelemen Péter György Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola Tudományági Doktori Iskola: 7. Molekuláris Orvostudományok Program: 7/5. Elméleti és klinikai immunológia Témavezető: Prof. Gergely Péter Opponensek: Dr. Pócsik Éva, Dr. Prohászka Zoltán Szigorlati Bizottság Elnöke: Prof. Fekete Béla Tagok: Dr. Benczúr Miklós, Dr. Sármay Gabriella 2005.

2 A TÉMÁVAL ÖSSZEFÜGGŐ SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 1.Säemann MD*, Kelemen Peter*, Böhmig GA, Hörl WH, Zlabinger GJ. Hyporesponsiveness in alloreactive T-cells by NF-κB inhibitor-treated dendritic cells: resistance to calcineurin inhibition. American Journal of Transplantation 2004; 4: (*Co-first authors: Errata. American Journal of Transplantation 2004; 4: ) 2.Säemann MD, Kelemen Peter, Zeyda M, Böhmig G, Staffler G, Zlabinger G.J. CD40 triggered human monocyte-derived dendritic cells convert to tolerogenic dendritic cells when JAK3 activity is inhibited. Transplantation Proceedings 2002; 34: Säemann MD, Diakos C, Kelemen Peter, Kriehuber E, Zeyda M, Böhmig GA, Hörl WH, Baumruker T, Zlabinger GJ. Prevention of CD40-triggered dendritic cell maturation and induction of T-cell hyporeactivity by targeting of Janus Kinase 3. American Journal of Transplantation 2003; 3: Ph.D. Tézis Tolerogén dendritikus sejtek: monocita eredetű dendritikus sejtek immunmodulációja n-butiráttal, pirrolidin ditiokarbamát (PDTC) NFκB-gátlószerrel, valamint WHI-P-154 Janus-kináz 3-gátlószerrel 4.Säemann MD, Parolini O, Böhmig GA, Kelemen Peter, Krieger PM, Neumüller J, Knarr K, Kammlander W, Hörl WH, Diakos C, Stuhlmeier K, Zlabinger GJ. Bacterial metabolite interference with maturation of human monocyte-derived dendritic cells. Journal of Leukocyte Biology 2002; 71: Säemann MD, Zeyda M, Diakos C, Szekeres A, Böhmig GA, Kelemen Peter, Parolini O, Stockinger H, Prieschl EE, Stulnig TM, Baumruker T, Zlabinger GJ. Suppression of early T-cell receptor-triggered cellular activation by the Janus Kinase 3 inhibitor WHI-P-154. Transplantation 2003; 75: Dr. Kelemen Péter György Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola Tudományági Doktori Iskola: 7. Molekuláris Orvostudományok Program: 7/5. Elméleti és klinikai immunológia Témavezető: Prof. Gergely Péter Opponensek: Dr. Pócsik Éva, Dr. Prohászka Zoltán Szigorlati Bizottság Elnöke: Prof. Fekete Béla Tagok: Dr. Benczúr Miklós, Dr. Sármay Gabriella

3 Eredményeink azt mutatják, hogy a Janus-kináz 3 tirozin-kinázt célzó immunszuppressziós terápiák a mieloid sejtek funkcióját is befolyásolják. A Janus-kináz 3-gátlószerek ezen sajátsága egy újabb hatásmódot mutat be, mely a már jól ismert közös gamma-lánc jelátviteli út gátlásával együtt lehetnek felelősek a klinikai hatásukért. Bemutattuk, hogy a T-sejt receptoron (TCR) keresztül WHI-P-154 jelenlétében történő T-sejt stimuláció károsodik a jelátvitel korai szakaszában, amely nagymértékben csökkent T-sejt aktivációhoz vezet. A perifériás T-sejtek Janus-kináz 3 aktivitásának szelektív gátlása fontos szerepet tölthet be a jövő immunoszuppressziós terápiájában. AZ EREDMÉNYEK GYAKORLATI HASZNOSÍTÁSA Eredményeink szerint az érésében gátolt in vitro modulált dendritikus sejtekkel való immunizációs stratégiák hasznosnak ígérkeznek az allograft kilökődésének szabályozásában. 9

4 AZ EREDMÉNYEK ÖSZEFOGLALÁSA BEVEZETÉS A modulált dendritikus sejtek hasonlóak fenotípusukat és citokin termelésüket, illetve allogén stimulációs képességüket tekintve az éretlen dendritikus sejtekhez. A CD80, CD86, CD40 kostimulációs molekulák, az MHC antigének, valamint a dendritikus sejtek érésére specifikusan jellemző CD83 marker expressziója nagymértékben csökkent. Érdekes módon az endocitózis és a makropinocitózisés, valamint az ezzel összefüggő receptorok expressziója gátlódott a vizsgált esetekben az érett dendritikus sejtekhez hasonlóan. Az immunstimuláns hatású interleukin-12 citokin termelődése egyértelműen lecsökkent, akárcsak a T-sejt stimuláló képesség a primer MLC-ben. Szekunder MLC-ben ezen modulált dendritikus sejtek hiporeaktív állapotot hoztak létre az alloreaktív T-sejteken. CsA adása a primer MLC-hez allogén T-sejt proliferáció gátláshoz vezetett. A CsA jelenléte az alloantigén immunválasz beindításakor nem befolyásolta a modulált dendritikus sejtek által létrehozott hiporeaktív állapotot a szekunder MLC-ben. A dendritikus sejtek, mint hivatásos antigen-bemutató sejtek, a T-sejtes immunválasz leghatékonyabb beindítói. A sejtfelszínen lévő MHC molekulákhoz kötött peptideket mutatják be adhéziós és kostimulációs molekulák jelenlétében. Bizonyos dendritikus sejttípusok képesek immuntoleranciát kiváltani in vitro és in vivo. Számos próbálkozás történt azzal a céllal, hogy tolerogén tulajdonságú antigén-bemutató sejtekké alakítsanak dendritikus sejteket. Ezekben a kísérletekben főleg a dendritikus sejtek érését befolyásolták. A tolerogén dendritikus sejtek létrehozása nagy előrelépést jelenthet az allograft tolerancia megvalósításában. A T-sejt hiporeaktivitás hosszútávú fenntartásával elősegíthetik a graft megtapadását és kilökődésének elkerülését. CÉLKITŰZÉSEK MEGBESZÉLÉS A fiziológiásan előforduló n-butirát nagymértékben gátolja a monocita eredetű dendritikus sejtek fejlődését és érését in vitro, mind fenotípusát, morfológiáját, mind funkcióját tekintve. A gyulladásellenes hatásán túl felvetődik az in vivo immunmoduláns szerep lehetősége a dendritikus sejtek funkciójának befolyásolásával az emésztőrendszerben. Újfajta tolerogén dendritikus sejtet hoztunk létre az éretlen dendritikus sejt PDTC jelenlétében való aktivációjával. A sikeres allogén hiporeaktivitás létrejöttét nem akadályozta meg a kalcineurin gátlás sem in vitro vizsgálva, sem pedig ex vivo CsA-val kezelt veseátültetett betegek T-sejtjein alkalmazva. Eredményeink alapján a modulált dendritikus sejtes kezelés valószínűleg alkalmas arra, hogy beépüljön a hagyományos immunszuppressziós protokollba anélkül, hogy a sejtterápiás mód veszítene feltételezett előnyéből. A Janus-kináz 3 tirozin-kinázt gátló WHI-P-154 megállította érésükben a CD40-en keresztül aktivált dendritikus sejteket és funkcionálisan éretlen dendritikus sejteket eredményezett. Célul tűztük ki, hogy in vitro állítsunk elő tolerogén dendritikus sejteket humán monocitákból az éretlen alakok gátlószerek jelenlétében való aktiválásával. Három kísérletsorozatot terveztünk, három különböző vegyülettel. Először a béltraktusban fiziológiásan előforduló n-butiráttal, majd a pirrolidin ditiokarbamát (PDTC) NFκBgátlószerrel, végül pedig a WHI-P-154 Janus-kináz 3 gátlószerrel. A modulált dendritikus sejteket és az általuk kiváltott allogén T-sejtes immunválaszt kívántuk vizsgálni. A kérdésünk az volt, hogy a modulált dendritikus sejtek hiporeaktivitást idéznek-e elő. Amennyiben igen, úgy befolyásolja-e in vitro a Cyclosporin A (CsA) a PDTC-modulált dendritikus sejtekkel stimulált allogén T-sejtek válaszképességét primer és szekunder kevert limfocita kultúrában (MLC). Illetve, létrehozható-e PDTC-modulált donor dendritikus sejtekkel ex vivo T-sejtes hiporeaktivitás CsA immunszuppressziós kezelés alatt lévő vesetranszplantált betegekből származó allogén T-sejteken. 8 1

5 Jelen értekezésben az alábbi konkrét célokat tűztük ki: A.) Baktérium anyagcseretermék hatása humán monocita eredetű dendritikus sejtek érésére 4 1.) Jellemezni n-butirát jelenlétében a monocita-eredetű humán dendritikus sejtek baktérium stimulusra (lipopoliszacharid / LPS) adott in vitro válaszát tekintettel fenotípusukra, morfológiájukra, antigenfelvevő és allostimuláló képességükre. B.) NFκB gátlószerrel kezelt dendritikus sejtekkel létrehozott T-sejtes hiporeaktivitás: független a kalcineurin gátlástól 1 1.) Létrehozni olyan tulajdonságú tolerogén monocita eredetű dendritikus sejteket az éretlen dendritikus alakok PDTC jelenlétében való aktiválásával, amelyek fenotípusukat és citokin termelésüket tekintve az éretlen dendritikus sejtekre hasonlítanak. 2.) Jellemezni a PDTC-modulált dendritikus sejtek allostimuláló képességét primer MLC-ben, valamint az allogén T-sejtek aktivációs markereinek expresszióját és citokin termelésüket. 3.) Előidézni PDTC-modulált dendritikus sejtekkel allogén T-sejtes hiporeaktivitást, és ezt az allogén immuntoleranciát vizsgálni szekunder MLC-ben. 4.) Vizsgálni primer és szekunder MLC-ben a CsA hatását olyan T-sejteken, amelyeket PDTC-modulált dendritikus sejtekkel stimuláltunk a primer MLCben. 5.) Létrehozni T-sejtes hiporeaktivitást PDTC-modulált donor dendritikus sejtekkel CsA immunszuppressziós kezelés alatt lévő vesetranszplantált betegekből származó allogén T-sejteken. C.) A CD40-en keresztül aktivált dendritikus sejtek érésének gátlása és T-sejtes 2, 3, 5 hiporeaktivitás létrehozása a Janus-kináz 3 befolyásolásával 1.) WHI-P-154 hatása a CD40-en keresztül aktivált dendritikus sejtek fenotípusára A CD80, CD86 és CD40 kostimulációs molekulák, az MHC I és II molekulák, valamint a dendritikus sejt érési marker CD83 sejtfelszíni expressziója nagymértékben csökkent. WHI-P-154-gyel kezelt dendritikus sejtek nem alakultak vissza monocita/makrofág irányba. 2.) WHI-P-154 hatása a CD40-en keresztül aktivált dendritikus sejtek antigénfelvételére A FITC-cel jelölt dextránnal és lucifer yellow festékkel meghatározott endocitózis és makropinocitózis mértéke nagymértékben eltért az éretlen és az érett dendritikus sejtek esetén. Érdekes módon a modulált dendritikus sejtek endocitotikus és makropinocitotikus képessége hasonló volt az érett dendritikus sejtekéhez. Hasonlóan az antigénfelvételhez, mind az érett, mind a modulált dendritikus sejtek mannóz receptor sejtfelszíni expressziója csökkent. 3.) WHI-P-154 hatása a CD40-en keresztül aktivált dendritikus sejtek allostimuláló képességére primer MLC-ben és a létrehozott hiporeaktivitás leírása A WHI-P-154-gyel modulált dendritikus sejtek stimuláló képessége lecsökkent. A modulált dendritikus sejtek nem antigén-specifikus T-sejt hiporeaktivitást hoztak létre szekunder MLC-ben vizsgálva. IL-2 adása teljesen helyreállította a T-sejt proliferációt. 4.) WHI-P-154 hatása a CD40-en keresztül aktivált dendritikus sejtek homotípikus összecsapzódására 8 óra elteltével a CD3 és CD28 molekulákon keresztül aktivált T-sejtek feltűnő sejtcsoportosulásokat képeztek, míg a WHI-P-154 Janus-kináz 3-gátlószerrel kezelt sejtkultúrában ezt nem figyelhettük meg. 2 7

6 3.) Allogén hiporeaktivitás létrehozása PDTC-modulált dendritikus sejtekkel A PDTC-modulált dendritikus sejtekkel stimulált T-sejtek nem proliferáltak sem az eredeti, sem egy harmadik donorból származó éretlen vagy érett dendritikus sejtekkel való ismételt stimulációkor. Az antigén bemutató sejtektől független T-sejt stimuláció érintetlen volt PMA-val és OKT3-mal. A rekombináns human IL-2 részben állította helyre a sejtproliferációt a szekunder MLC-ben. A hiporeaktív T-sejtek nem gátolták szignifikánsan a szingenikus T-sejtek allogén aktivációját, ami a regulátor T-sejtek hiányára utal. A PDTC-modulált dendritikus sejtek nem gátolták meg az azonos donorból származó érett dendritikus sejtek által kiváltott alloreaktivitást. 4.) A CsA hatása a PDTC-modulált dendritikus sejtekkel előidézett hiporeaktivitásra A CsA adása a primer MLC-hez az allogén T-sejt proliferáció gátlásához vezetett mind az éretlen, mind az érett, valamint a modulált dendritikus sejtek esetén. A CsA adása a primer MLC-hez nem befolyásolta a T-sejt proliferációt a szekunder MLC-ben. Megállapítható tehát, hogy az immunválasz beindításakor a primer MLC-ben jelenlévő CsA nem befolyásolta a PDTC-modulált dendritikus sejtekkel való hiporeaktív állapot létrehozását. 5.) CsA kezelt veseátültetett betegek T-sejtjein létrehozott hiporeaktivitás PDTC-modulált donor dendritikus sejtekkel Nagymértékben csökkent a proliferáció mértéke a primer MLC-ben. T-sejtes hiporeaktivitást figyeltünk meg a szekunder MLC-ben. A poliklonális stimulusok alkalmazásakor a T-sejtek reakcióképessége nem csökkent. A PDTCmodulált dendritikus sejtekkel létrehozott alloantigénekkel szembeni T-sejtes hiporeaktivitás független volt a kalcineurin aktivációtól. Sikerült T-sejtes hiporeaktivitást létrehozni ex vivo a CsA-kezelt betegekből származó allogén T-sejteken a PDTC-modulált donor dendritikus sejtekkel. C.) A CD40-en keresztül aktivált dendritikus sejtek érésének gátlása és T-sejtes 2, 3, 5 hiporeaktivitás létrehozása a Janus-kináz 3 befolyásolásával 1.) Vizsgálni a WHI-P-154 befolyását a CD40-en keresztül aktivált humán monocita eredetű dendritikus sejtek fenotípusára. 2.) Jellemezni a WHI-P-154-gyel kezelt dendritikus sejtek receptorközvetített endocitózisát, makropinocitózisát és mannóz receptor expresszióját. 3.) Jellemezni a WHI-P-154-gyel kezelt dendritikus sejtek stimuláló képességét primer MLC-ben, T-sejtes hiporeaktivitást idézni elő, és ezt az immuntoleranciát vizsgálni szekunder MLC-ben. 4.) Leírni a CD3 és CD28 antitestekkel aktivált T-sejtek WHI-P-154 jelenlétében történő homotipikus sejtcsoportosulását. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK Betegek A vizsgálatba bevont betegek legalább 2 évvel a kísérletek előtt részesültek kadaver vesetranszplantációban. A betegek CsA alapú immunszuppressziós kezelést kaptak. Az allograftok funkciója stabil volt. Sejtszeparálás Perifériás vér mononukleáris sejtjeinek (MNC) szeparálását véradók fehérvérsejt koncentrátumából végeztük Lymphoprep-en történő sűrűség grádiens centrifugálással. A monocitákat a MNC-ből nyertük T-sejt deplécióval, rozettaképző birka vörösvérsejt felhasználásával. A T-sejteket mágnes szelekciós módszerrel izoláltuk MNC-ből. A vesedonorokból származó lépsejtekből sűrűség grádiens centrifugálással szeparáltunk mononukleáris sejteket (MNC). 6 3

7 Dendritikus sejttenyésztés Az egészséges donorokból származó monocitákat és a kadaver lépből szeparált MNC-t 24-lyukú tenyésztő lemezre ültettük ki 5x10 5 sejt/ml koncentrációban 10% FCS-t tartalmazó RPMI tápfolyadékban. A sejteket 5 napig tenyésztettük rekombináns humán GM-CSF és IL-4 jelenlétében. A végső éréshez a következő 48 óra idejére LPS-t vagy CD40L-t adtunk, illetve a keresztkötéshez anti-flag antitestet használtunk. A gátlószereket 2-48 órával a dendritikus sejteket érlelő stimulus előtt adtuk. Áramlási citometria (FACS) és citokin termelés mérése A sejtfelszíni antigének (MHC I and II, CD40, CD80, CD86, CD83) expressziójának mérését és analízisét áramlási citométeren (FACS) végeztük. A mannóz-receptor közvetített endocitózist FITC-cel jelölt dextránnal, a folyadékfázisú endocitózist lucifer yellow festék sejtfelvételével mértük meg. A citokinek ELISA-val kerültek meghatározásra az összegyüjtött felülúszókból. Allogén kevert limfocita kultúra és tolerancia vizsgálat A stimuláló sejteket besugaraztuk és allogén T-sejtekhez adtuk 96-lyukú tenyésztő emezen 10% FCS-t tartalmazó RPMI tápfolyadékban. T-sejt proliferáció meghatározás céljából 4 nap múlva [ 3 H]-thymidint adtunk. A sejteket 18 óra múlva összegyüjtöttük és a radioaktivitást szcintillációs számlálóval mértük meg. A DNS szintézis mértékét a triplikátumok cpm-értékéinek átlagával jellemeztük. Szekunder MLC-hez T-sejteket vagy MNC-t (a vese allograft recipiensből) használtunk különbözőképpen előkezelt dendritikus sejtek hozzáadásával. A hetedik napon megmostuk a sejteket és újból kiültettük 96-lyukú tenyésztő lemezre. Stimulátornak az eredeti vagy egy harmadik donorból származó besugárzott sejteket alkalmaztunk. Bizonyos kísérletekben a szekunder MLC-hez IL-2-t adtunk. Az általános T-sejt reaktivitás meghatározására phorbol myristát acetátot (PMA) és OKT-3-at használtunk. Statisztika A statisztikai összehasonlító analízisekhez a Student-féle párosított t-próbát alkalmaztuk. Az eltéréseket p < 0.05 esetén tekintettük szignifikánsnak. EREDMÉNYEK A.) Baktérium anyagcseretermék hatása humán monocita eredetű dendritikus sejtek érésére 4 1.) Az n-butirát hatása a dendritikus sejtek fenotípusára, morfológiájára és funkciójára A CD25 és CD83, valamint a CD40, CD80 és CD86 kostimulációs molekulák, illetve az MHC I és II molekulák sejtfelszíni expressziója egyértelműen csökkent. A sejtek kismértékben vagy egyáltalán nem képeztek szigetszerű összecsapzódásokat a sejttenyészetben, sőt, a sejtek többsége hosszan elnyúló citoplazmatikus nyúlványokat növesztett. Az allostimuláló képesség szignifikánsan és koncentráció-függően csökkent. Az antigénfelvevő CD32 molekula és a mannóz receptor sejtfelszíni expressziójának gátlását figyeltük meg. Csökkent a lucifer yellow festék makropinocitózisa és a dextrán molekula receptor közvetített endocitózisa. B.) NFκB gátlószerrel kezelt dendritikus sejtekkel létrehozott T-sejtes hiporeaktivitás: független a kalcineurin gátlástól 1 1.) A PDTC hatása a dendritikus sejtek fenotípusára és citokin termelésére Az MHC II molekulák, a CD83 érési marker, valamint a CD40, CD80 és CD86 kostimulációs molekulák sejtfelszíni expressziója lényegesen csökkent. Az immunstimuláló hatású IL-12 és TNF-α citokinek termelődése nagymértékben és koncentáció-függően csökkent. 2.) PDTC hatása a dendritikus sejtek allostimuláló képességére és a primer MLC T-sejtjeire PDTC-vel való előkezelés csökkent stimuláló képességű dendritikus sejteket eredményezett. A modulált dendritikus sejtekkel stimulált T-sejtek nem expresszálták a CD69 antigént, illetve nagymértékben csökkent a CD25 aktivációs marker sejtfelszíni megjelenése. Az IL-2 és IFN-γ termelődésének gátlását figyeltük meg a primer MLC-ben, a dendritikus sejtek előkezelésének PDTC-koncentrációjának függvényében. 4 5