Állatkísérletek Elmélete és Gyakorlata B kurzus

Átírás

1 Állatkísérletek Elmélete és Gyakorlata B kurzus Function specific modul 11/3 Állatkísérletek helyettesítése, ún. "alternatív" módszerek Erős Gábor Sebészeti Műtéttani Intézet SZTE ÁOK I. szemeszter

2 Az alternatívák szükségessége Élő modellek kiváltása Társadalmi megítélés, az igény egyre nő Szervezeti fellépések Törvényi szabályozás Költségek, ellenőrzés étől Európai Unió megtiltotta a kozmetikai ipar számára folytatott állatkísérletek végzését SEURAT-1 (50 millió )

3 In vitro modellek előnyei Csak a vizsgált mechanizmusra fókuszálnak Egyszerűbb kezelni, kisebb a kockázat, felelősség Sokszor szükségesek a publikáláshoz Időmegtakarítás, elemszám Hátrányok Nem feltétlenül költséghatékonyabb Nem igazán életszerű Sejttenyészet: fertőződés (mycoplasma) Krónikus, szisztémás reakciók vizsgálatára nem alkalmas

4 A 3 R: Russell and Burch Replacement Reduction Refinement

5 A helyettesítés egyre hatékonyabb

6 Lehetőségek élő állatmodellek helyettesítésére Csak kémiai komponensek Szöveti homogenizátum, izolált organellum Ex vivo kísérletek Sejt-és szövetkultúrák Mesterségesen növesztett szövetek, szervek Invazív beavatkozás helyett kezelés

7 Biokémiai tesztek Immunkémiai technikák (bakteriális toxinok azonosítására) Szerv, szövet vagy sejtkultúrák (biokémiai kutatások céljára) Mikroorganizmusok (karcinogén ill. mutagén anyagok tesztelésére) Magasabbrendű növények Néhány metazoa parazita Komputer szimulációs modellek

8 Sejttenyésztés 1907 óta létező technika 50-es évektől kezdve elterjedt eljárás Áttörések: antibiotikumok, médium, tripszin Társaságok, sejt-és szövetbankok Izolált-és mai napig fenntartott sejtvonalak (HeLa) Tenyésztő eszközök rohamos fejlődése (gyógyszergyártás) Gén-és biotechnológia alappillére (klónozás) Rákkutatás (nanotechnológia) Őssejt-és génterápia (etikai kérdések) Szintetikus biológia (mesterséges szervek, programozott sejtek) Virológia (vakcinák készítése)

9 Vizsgálati lehetőségek Az adott sejt életfolyamatainak nyomonkövetése (sejtanalízis) sejt-sejt kölcsönhatások, a sejtkommunikáció vizsgálata (neuronok) a sejtek különböző kémiai anyagokra adott válaszának analízise (gyógyszerfejlesztés) különböző sejteredetű fehérje termékek előállítására (biotechnológiai ipar) tissue engineering céljára Sejttenyészetek eredete: szöveti explantok ("explant kultúrák") sejtszuszpenzió ("szuszpenziós kultúrák")

10 Sejttenyészetek típusai Primer tenyészetek: embrionális ill. felnőtt szövetből korlátozott ideig tarthatók fenn élettartamuk véges (hetek, néhány hónap) előnyük: a sejtek nem tekinthetők módosított ill transzformált sejteknek, mivel a tenyésztés kezdő lépéseként alkalmazott enzimatikus, vagy mechanikus disszociáción kívül a sejteket más hatás nem éri. hátrányuk: a kultúrák korlátozott élettartama minden egyes preparátum kicsit eltér egymástól, teljesen homogén idegen sejtet nem tartalmazó tiszta tenyészetről nem beszélhetünk. Sejtvonalak: abnormális, gyakran transzformált sejtek homogén sejtpopuláció élettartamuk korlátlan Leggyakrabban rákkutatási célok Könnyebb velük dolgozni, már nem kell izolálni

11 Ami nélkül nem megy Laminaris fülke HEPA filter - steril levegő-áramot biztosít Horizontális A levegő horizontálisan, a tenyésztő irányába áramlik veszélyes anyagokkal való munkára nem alkalmas Vertikális A levegő felülről lefelé áramlik veszélyes anyagokkal való munkára ez a típus a legalkalmasabb CO 2 Inkubátorok (5-10 %, 100%-os páratartalom) Fáziskontraszttal ellátott invert mikroszkóp

12

13 Ablaktalan, fertőtlenített helység (meszelés) Steril öltözet UV-védelem Speciális tenyésztőedényekedények Saját eszközök Vízfürdő, hűtőszekrény 70%-os alkohol Dezinficiens Speciális tápfolyadék (médium) Ionikus homeosztázis Vitaminok, kofaktorok, fémek Fehérjék, lipidek Energia Szérum Bakteriocid-fungicid koktél

14

15

16 A tenyésztőedények felületének kezelésére használjuk: Kollagen (kötőszöveti fehérje) Fibronectinek (sejtfelszíni és plazma fehérjék) Laminin (heteromer glycoprotein) Poly L-lysine (erősen pozitív töltésű polikationos polimer) Poly-L-Ornithin (polikationos poliaminosav) A tenyésztést segítő, a sejttenyésztő oldatokhoz adott szuplementumok: Foetal bovine vagy calf serum Növekedési faktorok Insulin

17 Alkalmas sejttípusok Általában bármilyen sejt, a legmacerásabbak az izom-és idegsejtek Vérsejtek: a keringési rsz.-be kerülve már nem osztódnak, rövid élettartam Fibroblaszt (kötőszövet): jól szaporodnak, generációs idejük rövid,gyorsan nőnek nek Epithel (hám): egyszerű dolgozni velük, gyorsan nőnek Embrionális sejtek: jól szaporodnak, kényesebbek Sejtvonalak: már régóta fenntartott sejtek, rengeteg információ, már izolált sejtek (HeLa, HEK, CHO)

18

19 Sejtkultúra megválasztása Izolálás: szerv kiválasztása sejtciklus, sejtorganellum, sejtkapcsolatok, mozgás alapján, esetleg anyagi és metodikai korlát miatt Konkrét állatmodell mellé in vitro bizonyítékok neonatalis v. adult sejtek,embrionális sejtek, esetleg hibridómák, transzformált sejtek Kezdeti sejtszám, életképesség ideje, növekedés üteme különböző A felnőtt sejtek csak adherens módon képesek növekedni: laminin, vagy kollagén plate, coated-plate (akár recept alapján)

20 Szövetek szétválasztása sejtekké: emésztőenzimekkel vagy mechanikusan (hőfok, időtartam!), nyírőerő minimalizálása (potter) Mosás, szűrés Sejtek médiumba ágyazása, kezelése Sejtnövesztés inkubátorban Sejtszámolás időről-időre (epetri) Minden típus esetén szükséges a rendszer kititrálása Kevert kultúrák esetén figyelem a fibroblasztokra Passzálás Viabilitási-tesztek Proteomika, fagyasztás-felengedés (DMSO!)

21

22 ERROR: stackunderflow OFFENDING COMMAND: ~ STACK: