Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Átírás

1 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A

2 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és tissue engineering 15. Előadás SEJT-AGGREGÁCIÓS KULTÚRÁK

3 Aggregációs sejtkultúrák Az aggregáció segítségével gyorsan alakíthatunk ki kisméretű szövetdarabkákat Az aggregáció szoros kapcsolatot alakít ki a sejtek között, amely segít növelni a sejtek túlélését és megfelelő élettani funkcióinak végrehajtását

4 Alapvető feltételek az aggregációs kultúrák kialakításához Sejtadhéziós molekulák (CAM, cellular adhesion molecule) jelenléte a sejtfelszínen Mátrix vagy mesterséges összetapadást segítő molekulák jelenléte, amely serkenti azon sejtek aggregációját, amelyek egyébként nem tapadnának össze

5 Sejtadhézió Sejt-sejt interakciók Oldott állapotú ECM Kadherinek Sejt-mátrix interakciók Integrinek Statikus ECM

6 A sejt-aggregáció kialakításának módszerei Aggregáció alacsony tapadóképességű anyagokhoz Aggregáció scaffoldokon vagy kémiailag módosított felszínű anyagokon Aggregáció forgó vagy szuszpenziós kultúrákban Aggregáció bioreaktorokban Aggregáció gravitációs kultúrákban

7 Gravitációs sejtkultúrák A sejtek gömböcskék -ké, ún. szferoid-okká állnak össze természetes módon, természetes nagyságú vagy megnövelt gravitációs mezőben Gravitációs kultúrák típusai: Szuszpenziós kultúrában kialakuló aggregátumok bioreaktorokban Függőcsepp-kutúrák Centrifugált aggregátumok

8 Szuszpenzióban kialakuló aggregátum kultúrák Magas sűrűségű sejtszuszpenziók szükségesek a kialakuláshoz A tenyésztés dinamikusan mozgásban levő kultúrákban lehetséges, a sejt-sejt kapcsolatok kialakulásához szükséges találkozások számának növelése érdekében A dinamikusan mozgásban levő sejtkultúrák kialakítására a sejtszuszpenziókat lehet mozgásban levő lemezeken, petricsészékben vagy bioreaktorokban tenyészteni

9 Aggregáció forgó bioreaktorokban Forgó bioreaktor Sejtszuszpenziókhoz Forgó bioreaktor Adherens sejtekhez Gravitációs erő Töltőnyílás Mintavevő nyílások Gravitációs erő Mintavevő nyílások Forgásirány Forgásirány Töltőnyílás NG LSMMG

10 Bioreaktorok és sejt-aggregáció Rotációs bioreaktor: speciális bioreaktor, amelyben a sejtekre ható erők egyensúlya tartja szuszpenzióban a az aggregátumokoat. A nyíróerők minimálisak. Típusok: High aspect rotation vessel (HARV) Slow turning lateral vessel (STLV) Kevertetett bioreaktorok: különböző térfogatú edények léteznek, ipari célokra akár több, mint 100 l térfogat

11 Különböző sejttípusok aggregátumainak tenyésztése bioreaktorban Bioreaktor típus Forgó bioreaktor Kevertetett bioreaktor Sejttípus HepG2 sejtek, humán őssejtek, humán bőr fibroblasztok, humán embrionális vesesejtek Porcsejtek, primer egér és patkány májsejtek, L6 mioblasztok, CHO sejtek

12 Sejt-aggregátumok felhasználása Sejt-aggregátumok CHO Felhasználás Rekombináns fehérjék szintézise Humán embrionális őssejtek Embrionális test (EB) kialakulása és differenciáció

13 Microgravitációs sejtkultúra Függőcsepp I. TÁMOP /1/A A mintát kaccsal a fedőlemezre helyezzük Vazelin Vájt tárgylemez 180 Olajcsepp

14 Microgravitációs sejtkultúra Függőcsepp II. TÁMOP /1/A Idő (napok) Az embrionális testek növekedése és a spontán csíralemez-differenciálódás megkezdődik

15 Egyforma embrionális testek tenyésztéséhez és az intercelluláris kapcsolatok szabályozásához szükséges mikrolemezek 40 mm 150 mm

16 Aggregáció alacsony adherenciájú felszínhez Az alacsony adherenciájú felszín segíti a szuszpenziós sejtkultúrák kialakulását A sejt-sejt kapcsolatok növekednek Néhány ECM-származékkal (pl. Martigel) borított felszín növeli a sejtek motilitását és sejtek közötti aggregációt.

17 Természetes aggregáció Májsejt HGF-R EGF-R Integrin Egyéb Epevezeték E-Kadherin ASGP-R Fas PVLA potenciálisan jól használható mesterséges máj kialakítására a különböző koncentrációjú borítások révén PVLA (Poli-N-p-vinil venzil D-laktóz lakton amid) A magas proliferációs képességgel rendelkező májsejtek szelekciója Sejtalak szabályozása +EGF Szferoid kialakulása Májsejtek ASGP-R alacsony gyors proliferáció Kitapadás Lekerekedés Szferoid Májsejtek ASGP-R magas lassú proliferáció ng/ml PVLA-val borított edény 1 mg/ml PVLA bevonat 100 mg/ml PVLA bevonat 100 mg/ml PVLA-val borított edény PVLA bevonat koncentrációja

18 Sejtaggregáció serkentése mesterséges módszerekkel Polimerből álló híd képzése a sejtek között. Típusok: Természetes adhéziós molekula ECM-eredetű molekula része Polimer mátrix

19 Mesterséges sejt-aggregáció Bifunkcionális polimer Sejtek Aggregálódott sejtek

20 Sejtek keresztkötése biotinnal Biotin hidrazid Avidin Perjodát-funkcionalizált sejtek Sejtaggregátum

21 Felszínek kémiai módosítása Chitosan, természetes, biodegradábilis polimer (molekulatömeg: 810 kda) Kémiailag módosított PEG (polietilén glikol) Laktonnal módosított eudragit PLGA nanogyöngyök Lektinek és származékaik

22 Chitosan TÁMOP /1/A

23 Kémiailag módosított PEG MA(PEG) n Methyl-PEG n -Amine Methyl-(#ethyleneglycol) amine H 2 N O O O O CH 3 MA(PEG) 8 M.W Spacer arm 29.7 Å MA(PEG) 12 M.W Spacer arm 43.9 Å MA(PEG) 24 M.W Spacer arm 86.1 Å H 2 N [ O CH ] 3 8 H 2 N [ O CH ] 3 12 H 2 N [ O CH ] 3 24

24 Lakton-módosított eudragit Ellenionok COO Ko-ionok HOOC COOH COOH ph > OOC - COO HOOC COOH - + COO OOC COOH COO - + -

25 PLGA nanogyöngyök Oldott polimer (PLGA) Diszperziós fázis Pumpa Magasnyomású víz kifolyás Pumpa Előkeverés Mágneses keverő Magasnyomású víz befolyás

26 A sejtfelszíni molekulák szénhidrátcsoportjait képesek megkötni a lektinek A lektinek, vagy fitohemagglutininek (PHA), olyan fehérjék, melyeknek nincsen sem enzimatikus sem immunológiai aktivitásuk, és reverzibilisen képesek szénhidrátokhoz kötődni azok megváltoztatása nélkül Mivel a lektinek specifikus, reverzibilis sejt-sejt adhéziós reakcióban vesznek részt, jól alkalmazhatóak sejtfelszíni molekulák keresztkötésén keresztül a sejtadhézió serkentésére Lektinek és származékaik I.

27 Lektinek és származékaik II. Hat lektin család ismeretes: Legume lektinek (a pillangósvirágúak családjában) Gabona-eredetű lektinek, P-, C-, és S-típusú lektinek (állati fehérjék) A pentraxinok (állati fehérjék) A lektinek sokfajta sejttípushoz kötődnek, amelyek különböző sejtfelszíni glikoproteinek vagy glikolipidek alkotórészei. A sejtek lehetnek vörösvértestek, leukémiás blasztok, élesztőgombák vagy baktériumok. A lektinek szénhidrátspecificitása is különböző lehet, mannóz, galaktóz, N-acetil-glükózamin, N-acetil-galaktózamin, L-fruktóz, és N-acetilneraminsav. Mivel egy lektinmolekulán több szénhidrát-kötőhely található, képes agglutinálni a sejteket. A lektinek kötődése az egyes szénhidrátokra specifikus.

28 A lektinek által felismert N-glikánok típusai Type Bisected di-, tridiantennary complex-type N-glycan Tri- and tetraantennary complex-type N-glycan Tri- and tetraantennary complex-type N-glycan PHA Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin (E-PHA) Inhibitor: GalNAc Phaseolus vulgaris Leukoagglutinin (L-PHA) Inhibitor: GalNAc Datura stramonium Agglutinin (DSA) Inhibitor: Chitotriose (GlcNAc 3 )

29 Sejt-aggregáció scaffoldokon Homogén és heterogén sejtpopulációk aggregációja Sejtfelszíni fehérjék biotinálása és avidin alkalmazása keresztkötő ágensként

30 Nanoszerkezetű scaffold-ok Spontán összeszerelődő scaffold-ok Nanokompozit anyagok Nanoszálak

31 Nanoszerkezetű anyagok felhasználása Anyag Jellemzők Felhasználás Fullerének Fluoreszcens Quantum dot -ok Liposzómák Dedrimerek Arany nanorészecskék Szuper-paramágneses vas-oxid Szénatomok hexagonális és pentagonális térszerkezetbe rendeződve Félvezetőkből készült nanokristályok Foszfolipid membránnal burkolt vezikulák Polimer szerkezetek Kolloid arany Vas-oxid Gyógyszerek enkapszulációja, képalkotó vizsgálatok Bioszenzorok, képalkotás Gyógyszerek leadása, génterápiás alkalmazás Gyógyszerek leadása, génterápiás alkalmazás Bioszenzorok, sejtszintű képalkotás MRI kontrasztanyag

32 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és tissue engineering 16. Előadás SZÖVETEK NYOMTATÁSA

33 A szövetnyomtatás alapjai Scaffoldmentes konstrukció Tisztított sejtek aggregált halmazait alkalmazzák A sejthalmazokból áll a biotinta A 3D szövetkonstrukciók felépítése a sejthalmazok spontán fúziós képességén alapul

34 Sejthalmazok fúziója 3D szövetkonstrukciókká I.

35 Sejthalmazok fúziója 3D szövetkonstrukciókká II. Közel helyezett sejtaggregátumok és embrionális szív mezenchima fragmentek gyűrű vagy csőszerű struktúrákká egyesülnek

36 Szervek nyomtatása 3D nyomtatás: a sejthalmazokat gyors, automatizált módszerrel rétegenként, biokompatibilis anyaggal körülvéve helyezzük egymásra, így alakul ki a 3D szerkezet. Szövetnyomtatás típusok: Lézernyomtatás (osteoszarkóma, embrionális carcinoma) Tintasugaras nyomtatás (hippocampális és kortikális neuronok)

37 Az első szövetnyomtató TÁMOP /1/A

38 Érett, szervspecifikus primer sejtek I. Sejtkultúra Biopszia Tisztítás TE-ben használható sejtek

39 Érett, szervspecifikus primer sejtek II. Tisztítás Biopszia Szövetspecifikus rezidens őssejtek Sejtkultúrák TE-ben használható sejtek Differenciálódott szöveti sejtek

40 Érett, differenciálódott sejtek alkalmazása TE céljára TÁMOP /1/A Forrás: biopszia vagy reszekció Tisztítás Expanzió in vitro tenyésztés során Újradifferenciáltatás

41 Vérerek képzése szöveti nyomtatással TÁMOP /1/A Fontos a megfelelő nyomóerő alkalmazása

42 TE-vel előállított erek potenciális alkalmazása Koszorúér betegség, bypass készítése Trombózis kezelése Baleseti érsérülés Komplex szöveti szerkezetek kialakítása TE-vel