A DNS-chipek története

Átírás

1 Biochip technika a labordiagnosztikában Citokin mérési módszerek Bekő Gabriella Semmelweis Egyetem, Központi Laboratórium (Pest) 28. szeptember 18. A DNS-chipek története 1995 gén-expressziós profilok meghatározására használt miniatürizált microarray 1997-ben már egy microarray-vel kimutatott komplett eukaryota genomról az élesztőgomba genomról (Saccromyces cerevisiae) számoltak be amerikai szerzők 21 óta már baktériumok, élesztő, szőlőmuslica, fonálféreg és növények mellett az emberi genom, legújabban pedig az egér teljes genomiális géntérképe rendelkezésre áll, a világháló adatbázisaiból lehívható és elemezhető 1

2 A DNS-chip technika A DNS-chipek egy szilárd hordozó lapocskához sakktáblaszerű elrendezésben kötött, nagyszámú, különböző nukleotidszekvenciájú D S próbából állnak. A próbák lehetnek: oligonukleotidok (2-25 nukleotid hosszúságúak) D S-fragmentumok (~5-5 nukleotidból állnak) a próbák általában mrns-ről reverz transzkripció segítségével, in vitro előállított komplementer D S (cd S) láncok A jelenlegi technikai lehetőségek már több tízezer különböző próbát tartalmazó folt vagy pont (spot) kialakítását teszik lehetővé egy chip 1-2 cm 2 -es felületén, így egy egyed teljes genetikai állományát reprezentáló chip készíthető. (Az ember genomja ezer gént tartalmaz.) Összehasonlító génexpressziós kísérletek legkritikusabb lépés a megfelelő szolubilis nukleinsavminták (targetek) előállítása a target nukleinsavat polimeráz láncreakcióval (PCR) kell megsokszorozni target cdns-ek jelölése riporter molekulákkal, amik ma már (vörös és zöld) színű fluoreszcens festékek (Cγ5 és Cγ3) Hibridizáció, mosás a chipeket lézerrel világítják meg és a lapocskák különböző pontjai által kibocsátott fény színét, valamint intenzitását mérik konfokális mikroszkópban vagy leolvasó készülékben (scannerben) a chipen végzett kísérlet eredményeit hierarchikus csoport- (cluster) analízis (általában a CLUSTER és a TREEWIEW számítógépprogramok) segítségével értékelik 2

3 DNA-array Összehasonlító génexpressziós vizsgálat 3

4 Génexpressziós kézjegy Meghatározhatók a mintaként feldolgozott sejtek eredetére, funkciójára, működésére,stb. jellemző génexpressziós kézjegyek. Minden kézjegy olyan gének csoportját (clusterét) jelenti, amelyek hasonló vagy inkább egymáshoz kapcsolódó funkciójú fehérjéket kódolnak. Minden génexpressziós kézjegy tartalmaz néhány nevesített (named) gént, aminek ismerjük a funkcióját és ebből következtethetünk a csoportba tartozó többi még ismeretlen gén funkciójára is. Ha például olyan génexpressziós kézjeggyel találkozunk, amelyben előfordul a Fas (APO-1 vagy CD95) és több kaszpáz enzim génje, biztosak lehetünk abban, hogy a csoportba tartozó többi fokozottan expresszálódó gén is olyan fehérjéket kódol, amelyek szerepet játszanak a Fas (CD95) FasL (CD95L) úton indukált apoptózisban GenBank www3.ncbi.nlm.nih.gov/entrez A DNS-chip technológiának köszönhetően a humán genom projekt keretében ma már korlátlan hozzáférési lehetőség van a gének szekvenciáit és lokalizációját tartalmazó adatbázisokhoz, nagyban segítve ezzel a kromoszóma rendellenességek felderítését, a génexpressziós mintázat szisztematikus meghatározását, mely nemcsak a sejtek normális működésének megértése szempontjából nagyon fontos, hanem hozzájárul olyan új gének azonosításához, melyek adott betegségcsoportra markerként jellemzőek és terápiás szempontból potenciális gyógyszercélpontok lehetnek 4

5 A fehérjechipek története A fehérjechipek a cdns microarray módszer analógiájára jöttek létre. Kezdetben nem chip, hanem ELISA-plate méretűek voltak, amely a technika fejlődésével egyre kisebbé váltak. Míg a cdns-chipeknél a reakciót a Southern- vagy Northern-hibridizáció, addig a fehérjechipek esetében a Western-hibridizáció alapján végezzük, néhány módosítással. A fehérjechipek története Kezdetben ELISA-tálca vályúiba (plate well) rögzítettek megfelelő antitesteket. Az ELISA-plate-et hamarosan PBDF (polybrominated dibenzofurans)-membrán váltotta fel. Ennek meghatározott pontjaira csöppentették és rögzítették az ellenanyagot Egy mintából akár több száz vagy ezer paramétert vizsgálhatunk (ahányféle ellenanyagot rögzítettünk előre a szilárd hordozón) A jelölésben az áttörést a fluoreszcens festékek alkalmazása hozta. A használatos fluoreszcens festékek cianinszármazékok, leggyakoribb a monoreaktív Cy3 és Cy5 fluoreszcens festékek. (A hibridizáció után kapott fluoreszcens jel csak a bekötődött fehérjék mennyiségétől függ ) 5

6 Fehérjechip technika Ez a rendszer a cdns-microarray-k analógiájaként működik, és kompatibilis is az ehhez szükséges eszközökkel (jelölés, hibridizáció, azonosítás). Leggyakrabban szilárd hordozóként üveglemezt használnak, a másik megoldást speciális membrán tárgylemezre rögzítése. A chipek felszínére rögzített fehérjéknek is két fajtája ismert: 1.Olyan fehérjék rögzítése, amelyekkel testfolyadékellenanyagok mutathatók ki. Ez az úgynevezett reverz fázisú protein chip (RPA) rendszer 2.Olyan ellenanyagok rögzítése, amelyekkel szöveti lizátum, sejtkultúra-lizátum, testfolyadékok bizonyos fehérjéi reagálnak, és így jelenlétükre és mennyiségükre következtethetünk Fehérjechipek alkalmazása Fehérjechipek típusai: 1. Üveg tárgylemez-alapú nyomtatott (egyszerű alkalmazhatóság, kisebb költség) 2. SELDI MS-alapú (kis anyagmennyiségből profilkülönbség, de drága) 3. Elektroforézis-alapú (még nem kiforrott) 4. Szöveti mikroblokk módszer (egyes antitestek szöveti és betegség specificitásának meghatározását teszik lehetővé) 6

7 éhány fontosabb kutatási terület Szérum tumormarker-vizsgálatok Szérumfehérje-profilok vizsgálata távoli daganatok kimutatására (érdekes és reális lehetőség) Colorectalis daganatos betegek szérumának fehérjespektrumát lehet vizsgálni Ováriumdaganatok szűrésére alkalmas markereket találtak A SELDI-alapú fehérjechipek sikeresen alkalmazhatók azzal a céllal, hogy olyan fehérjéket azonosítsanak, amelyek összefüggésben állnak a HER-2/neu-pozitív, agresszív fenotípusú mellrákkal. Három potenciális biomarkert sikerült meghatározni gégerákban. Ezek a fehérjék (calgranulin-a, calgranulin-b és calgizzarin) az S1-as fehérjecsalád tagjai. Húgyhólyag laphámsejtes carcinomájának fehérjemarkereit is vizsgálják chiptechnikával éhány fontosabb kutatási terület Autoimmun betegségekben autoantigén vizsgálatok végezhetők A fehérjearray-ket különböző sejtélettani vizsgálatokra is alkalmazzák. Az antitestek stresszválasz, sejtciklus, apoptosis fehérjék kimutatására alkalmasak. Gyulladásos folyamatokban citokinek, kemokinek, növekedési faktorok és NF κb aktivációját figyelik. 7

8 Miért fontos a citokinek mérése? A citokinek nélkülözhetetlen mediátorai az immunválasznak és a gyulladást kiváltó reakcióknak A növekedési faktorok pedig elsősorban sejtosztódást indukáló biológiailag aktív anyagok Klinikai jelentőségük a fertőzések, az autoimmun betegségek, az immundeficienciák és daganatos betegségek terén kiemelkedő Citokin mérési módszerek Intracelluláris citokinek és kemokinek kimutatása A T-limphociták aktivációját követően a citokinek/kemokinek a citoplazmában feldúsulnak, és csak ezután választódnak ki. Az intracelluláris citokinek a citoplazmában fluoreszcens festékekkel jelzett specifikus ellenanyagokkal, áramlási citofluorimetriával, immunhisztokémiai módszerekkel vagy immunfluoreszcens mikroszkópos technikákkal vizsgálhatók. A sejtfelszíni markerek egyidejű kimutatásával az adott citokintermelő sejt típusa is azonosítható, és a citokint termelő sejtek aránya is megadható. A mikroszkópos elemzés a sejten belüli lokalizáció meghatározására alkalmas. 8

9 Extracelluláris oldott citokinek kimutatása biológiai aktivitásuk alapján - csak a biológiailag aktív citokinek mutathatók ki - nem elég specifikus érzékeny ELISA módszerekkel - kettős szendvics módszer - nagy fajlagosság - az eredmény nem mindig jelzi a tényleges biológiai aktivitást -citokinek oldott formájú receptorokhoz vagy inhibitorokhoz kötött formában is előfordulhatnak Extracelluláris citokinek meghatározása biochip és bioplex módszerekkel A citokin funkciók komplexek, így egy citokin profil nagyon értékes információt jelenthet egy adott immunválaszban, különösen, ha az időbeni dinamikus változásokat is figyeljük. 9

10 A citokcinek az immunválasz minden fázisában hatnak: Dr. Berki Tímea Extracelluláris citokinek meghatározása biochip és bioplex módszerekkel Nagy előrelépés: citokin biochip panelek Egyszerre 12 citokin növekedési faktor 1ul minta mikrogyöngyökhöz kötött citokin antitestek, a Bio-Plex panelek egyszerre 27 citokin, növekedési faktor 5ul minta 1

11 Biochip tecnika citokinek, kemokinek és növekedési faktorok kimutatására Háromféle immunoassay-t alkalmaz egyszerre: 1. kompetitiv immunoassay (enzimmel jelölt analit) 2. sandwich immunoassay (enzimmel jelölt antitest) 3. antibody capture immunoassay Randox Evidence Investigatort használva a chemiluminescens jeleket egyszerre méri egy készülék egy hűtött CCD (charge couple device) kamerával és standard kalibrációs görbékhez hasonlítva kiértékeli egy speciális programmal a teljes array-n A chip-en található analitok egyedi, mennyiségi meghatározása A képkészítés folyamata A biochip mérés folyamata az evidence investigator TM -ral Mérésre kész biochip carrier A biochip carrier behelyezése a készülékbe Assay reagensek és beteg minta hozzáadása a biochip-hez A jelzı reagens hozzáadása Thermoshakerben való inkubálás Biochip mosása (manuálisan) 11

12 Biochip technika 3-4 óra alatt 42 beteg 12 pro- és antiinflammatórikus citokinjét és növekedési faktorát (háromszintű kontrolálást használva) tudjuk lemérni (1 ul minta/ beteg)). A Randox teljes automata (EVIDENCE) rendszerben egy chip felületére maximum 23 analit (antitest) köthető. A citokinek mellett számos panelt fejlesztettek. Így kardiális, pajzsmirigy, női hormonok, drog kimutató, antimikrobiális,szintetikus szteroid, többféle tumor monitorozó, a colorectalis tumorok szűrésére pedig DNA array(ranplexcrc) Nyugat-Európában, Amerikában klinikai rutin laboratóriumokban is használják Bio-Plex technika citokinek, kemokinek és növekedési faktorok kimutatására Chiptechnika (sandvich és kompetitiv immunoassay) és flowcytometria Mikrogyöngyöket ( 5um, polisztirén) vörös és infravörös festékkel színezik. (Festék arány: 1 féle gyöngytípus - elméletileg 1 féle vizsgálat) A gyöngyökhöz különböző monoklonáris antitesteket kötnek, melyek összekeverhetők és a microplate lyukaiból a chiphez hasonlóan egyszerre mérhetők A szendvics ELISA utolsó lépése fluorescens jelölés A készülék kapillárisán áthaladó valamennyi gyöngyöt 2 színű lézer világítja meg. ( Piros fény a gyöngy típus - zöld fény a fluoreszcens jel intenzitás) Speciális software - standard görbékhez hasonlítás 12

13 Bio-Plex technika Bio-Plex technika A minta a szérumon, plazmán és szöveti felülúszón kívül, bármely testnedv vagy szöveti homogenizátum lehet. A szükséges mintamennyiség 5ul. A vizsgálatok költsége harmada az ELISA-val mért tesztekének. De minél több tesztet mérünk egy plexben, a fajlagos költség annál kisebb. A flexibilis multiplexek nemcsak a citokinek mérésénél nyújtanak segítséget, hanem más fehérje és génexpressziós profilok, autoimmun betegségek, genetikai betegségek és HLA vizsgálatok terén is gyors, pontos, átfogó eredményekhez juthatunk. 13

14 Minták és vizsgált paraméterek 16 koraszülött és újszülött - 54 minta Biochip Közös Bio-Plex IL-1α IL-1β IL-2 IL-2 IL-2 IL-4 IL-4 IL-4 IL-6 IL-6 IL-6 IL-8 IL-8 IL-8 IL-1 IL-1 IL-1 TNF-α TNF-α TNF-α IFN-γ IFN-γ IFN-γ EGF GM-CSF VEGF MCP-1 F.B. koraszülött- sepsis TNF-alfa Biochip IL-6 Biochip TNF-alfa Bio-Plex IL-6 Bio-Plex

15 F.B. koraszülött- sepsis IL-8 Biochip Procalcitonin ng/ml IL-8 Bio-Plex K.Zs. újszülött, bakteriális majd vírusinfekció TNF-alfa Biochip IL-6 Biochip TNF-alfa Bio-Plex IL-6 Bio-Plex

16 K.Zs. újszülött, bakteriális majd vírusinfekció IL-8 Biochip IL-2 Biochip IL-8 Bio-Plex IL-2 Bio-Plex K.Zs. újszülött, bakteriális majd vírusinfekció Interferon-gamma Biochip Procalcitonin 25, 25 2, 2 15, 1, ng/ml , 5, Interferon-gamma Bio-Plex CRP 2, 5 15, 4 1, 5, mg/l 3 2 1, 16

17 Összefoglalás, konklúzió A két módszerrel hasonló eredményekhez jutottunk: n=54 IL-2 IL-4 IL-6 IL-8 IL-1 IF -γ T F-α r,82,84,92,88,83,83,9 Bio-Plex technikával a szélesebb dinamikus range miatt a változások súlyos infekcióban könnyebben követhetők A proinflamatorikus citokinek vizsgálata hamarabb jelzi az infekciót, mint a prokalcitonin és/vagy CRP Citokin panelek mérésével az infekció okára is következtethetünk Kevés minta szükséges, -7 C-on tároljuk 17