Automatával végzett vérképelemzés: új paraméterek használata, szerepe és értéke Dr.Bekő Gabriella Uzsoki Kórház Központi Laboratórium 2013. november 7.
A fehérvérsejtek, vörösvértestek és thrombocyták automatával történő számolása alig több, mint 50 éves múltra tekint vissza A módszer harmonizációja, a mért paraméterek standardizációja, a számolt paraméterek elfogadása az 1990-es évek végén történt A XXI. század modern komputer és network technikái hozzájárultak a mechanikai és algoritmusokon alapuló kontroll rendszerek kifejlesztéséhez A hematológiai automaták napjainkban már képesek részletekbe menő, nagyon pontos eredményközlésre, amelyből sokszor juthatunk korrekt diagnózishoz minimális emberi munkával
Biological Desirable Variation specification Analyte CVw CVg I(%) B(%) TE(% B- Erythrocytes, count 3,2 6,1 1,6 1,7 4,4 B- Erythrocyte distribution wide 3,5 5,7 1,8 1,7 4,6 B- Hematocrit 2,8 6,4 1,4 1,7 4,1 B- Hemoglobin 2,8 6,6 1,4 1,8 4,1 Mean corpuscular B)Erythr- hemoglobin (HCM) 1,6 5,2 0,8 1,4 2,7 Mean corpuscular hemoglobin (B)Erythr concentration - (MCHC) 1,7 2,8 0,9 0,8 2,2 (B)Erythr Mean corpuscular - volume (MCV) 1,3 4,8 0,7 1,2 2,3 B- Platelets, count 9,1 21,9 4,6 5,9 13,4 Platelet distribution - B- wide 2,8 -- 1,4 - -- (B)Plat- Mean platelet volume (MPV) 4,3 8,1 2,2 2,3 5,8 B- Neutrophyles, count 16,1 32,8 8,1 9,1 22,4 B- Lymphocytes, count 10,4 27,8 5,2 7,4 16,0 B- Monocytes, count 17,8 49,8 8,9 13,2 27,9 B- Eosinophils, count 21,0 76,4 10,5 19,8 37,1 S- Basophile, count 28.0 54.8 14.0 15.4 38.5 A hematológiai paraméterek intra-individuális biológiai variabilitása www. Westgard.com
Egy könnyű étkezés hatása a vérsejt paraméterekre Giuseppe Lippi Influence of a light meal on routine haematological tests. Blood Transfus. 2010
A MINTA TÁROLÁSA K 2 -EDTA alvadás gátlót tartalmazó lila dugós csőbe, szakszerűen levett vénás vérminta szükséges A mintát 8 órán belül mérni kell, ha szobahőmérsékleten tároljuk 24 órán belül mérni kell, ha +4C o -on tároljuk Kenet készítés azonban 4-5 órán belül történjen!
A minta tárolása Szobahőmérsékleten való tároláskor 8 óra után bekövetkező változások: - vörösvérsejtek elvesztik bikonkáv alakjukat - MCV, Hct - ozmotikus fragilitás - fehérvérsejt szám - abszolút lymphocyta szám - retyculocyta szám már 6 óra után - magvas vörösvérsejtek 24-36 óra után eltűnnek -MPV, IRF +4C o on a stabilitás 24 óráig megmarad, kivétel a reticulocyta, trombocyta paraméterek és a qualitatív vérkép!
Vörösvérsejtek Vérvétel után 12 órával készült kenetek esetén: Neutrophil granulocyták Lymphocyták Monocyták
Biological Desirable Variation specification Analyte CVw CVg I(%) B(%) TE(% B- Erythrocytes, count 3,2 6,1 1,6 1,7 4,4 B- Erythrocyte distribution wide 3,5 5,7 1,8 1,7 4,6 B- Hematocrit 2,8 6,4 1,4 1,7 4,1 B- Hemoglobin 2,8 6,6 1,4 1,8 4,1 Mean corpuscular B)Erythr- hemoglobin (HCM) 1,6 5,2 0,8 1,4 2,7 Mean corpuscular hemoglobin (B)Erythr concentration - (MCHC) 1,7 2,8 0,9 0,8 2,2 (B)Erythr Mean corpuscular - volume (MCV) 1,3 4,8 0,7 1,2 2,3 B- Platelets, count 9,1 21,9 4,6 5,9 13,4 Platelet distribution - B- wide 2,8 -- 1,4 - -- Mean platelet volume (MPV) 4,3 8,1 2,2 2,3 5,8 (B)Plat- B- Neutrophyles, count 16,1 32,8 8,1 9,1 22,4 B- Lymphocytes, count 10,4 27,8 5,2 7,4 16,0 B- Monocytes, count 17,8 49,8 8,9 13,2 27,9 B- Eosinophils, count 21,0 76,4 10,5 19,8 37,1 S- Reticulocyte, count 11.0 29.0 5.5 7.8 16.8 Az elvárt analitikai variabilitás www. Westgard.com
Intraassay Beckman-Coulter DxH 800 automatán n=20 átlag szórás VK (%) WBC (G/L) 6,41 0,074 1,2 RBC (T/L) 4,29 0,022 0,5 HGB (g/l) 138 0,667 0,5 HCT (l/l) 0,41 0,003 0,7 MCV (fl) 95,39 0,281 0,3 MCHC (g/l) 337,1 2,424 0,7 RDW (%) 13,2 0,115 0,9 PLT (%) 183,4 3,341 1,8 MPV(fl) 8,86 0,107 1,2 Neutrophil(%) 56,4 1,181 2,1 Lymphocyta (%) 29,4 0,515 1,8 Monocita (%) 8,27 0,400 4,8 Eosinophil (%) 4,43 0,183 4,1 Reticulocita (%) 1,06 0,067 5,2
Interassay Beckman-Coulter DxH 800 automatán n=22 átlag szórás VK (%) WBC (G/L) 3,83 0,057 1,5 RBC (T/L) 1,82 0,018 1,0 HGB (g/l) 49,52 0,593 1,2 HCT (l/l) 0,15 0,003 1,9 MCV (fl) 84,56 1,083 1,3 MCHC (g/l) 321,52 6,781 2,1 RDW (%) 16,17 0,244 1,5 PLT (%) 70,35 1,112 1,6 MPV(fl) 9,66 0,131 1,4 Neutrophil(%) 37,69 1,290 3,4 Limhocyta (%) 51,90 1,276 2,5 Monocita (%) 6,32 0,655 8,8 Eosinophil (%) 3,87 0,384 9,9
Elsődleges referens anyagra visszavezethető kalibrátor
Lehetőségek és korlátok A hematológiai automatákból teljesen megbízható értékeket kapunk: - fehérvérsejtszám, vörösvérsejtszám, hemoglobin koncentráció, MCV, thrombocyta szám (optikai és fluorescens méréssel), qualitatív eloszlás Standardizáció hiánya miatt készülékfüggő: - Reticulocyta szám és származtatott reticulocyta paraméterek - RDW (RBC distribution width) - MPV ( mean platetet volume) - PDW (platelet distribution width)
Lehetőségek és korlátok A készülék által használt festésből adódó különbségek: - peroxidáz festésnél (citokémiai rakció) LUCs (large unstaind cells) - fluorescens festésnél (sejt spec. lízis): IGs( Immature Granulocytes) - HPCs (Hematopoetic progenitor cells) és NRBc (Nucleated RBCs) Új paraméterek klinikai használata: - IRF (immature reticulocyta fraction) - MCV (mean reticulocyta volume) - CHr ( mean reticulocyte hemoglobin content) - FRBC (fragmented RBC) - IPF (immature platelet fraction)
Hematológiai automaták mérési elvei Impedancia (Coulter) elvű mérés ellenállás változás a sejtek vezetőképessége kisebb sejtnagyságtól függő elektromos impulzus Nagy frekvencia elvű mérés - sejtfal vezetőként viselkedik, az áram áthaladva a sejten belső struktúráról is informál ( a sejten belüli granuláris, nukleáris összetételről, vegyi eltérésekről) a nagy frekvenciájú impedancia impulzus speciális szoftverrel (Adaptív Cluster Analysis System) érett és éretlen granulocyták elkülöníthetők
Optikai, fényszórás (vagy szórt lézer) elvű mérés Advia Hidrodinamikailag fókuszált sejtáramlás, megvilágító lézer fény és detektor Kis szög (2-4 o ) alatti fényszórás a sejt mérettel, a nagyobb szög alatti (10-15 o ) fényszórás a sejt tartalommal (pl. hemoglobin koncentráció, vagy sejtmag sûrûség) arányos A kis és a nagy szög alatt szórt fény intenzitásának komplex matematikai összefüggését a Mie teória írja le
Fluoreszcens áramlásos cytometria Sysmex MAPPS (Multi Angle Polarized Scatter Separation) A fényszóródás mérése több szögből Előre szóródás a sejt méretről, az oldal irányú szóródás a sejt belső struktúrájáról informál.
Optikai, fényszórás (vagy szórt lézer) elvű mérés 7 lézer detektorral Beckman Coulter DXH-800 - Volume (térfogat) - Conductivity (vezetőképesség) - Axial light loss (AL2) - Low angle light scatter (LALS) - Median angle light scatter (MALS) - Lower median angle light scatter (LMALS) - Upper median angle light scatter (UMALS) fényáteresztő képesség (transparency) sejt komplexitás sejt granularitás, sejtmembrán felszíne
Fehérvérsejt diferenciálás festés nélkül
Peroxidáz pozitív sejtek L N N L E M L N N M B N M = Monocyta N = Neutrophil E = Eosinophil L = Lymphocyta B = Basophil Wright festés Peroxidáz festés
Felhődiagram peroxidáz festéssel 1 Zaj 2 Magvas vörösvérsejt 3 Összetapadt thrombocyták 4 Lymfocyták és basophylek 5 Large Unstained Cells (LUC) 6 Monocyták 7 Neutropylek 8 Eosinophylek Morfológiai flag-ek: ATYP (Atípusos lymphocyták) IG (Éretlen granulocyták) MPO (Myeloperoxidase hiány) NRBC (Magvas vörösvérsejtek) PLT-CLM (Összetapadt thrombocyták)
Felhődiagram a bazofil csatornán 1. Zaj 2. Blasztok sejtmagja 3. Monociták és limfociták sejtmagja 4. Bazofil sejtek 5. Bazofil gyanús sejtek 6. Szaturáció 7. Neutrofil és eosinofil sejtmagok Morfológiai flag-ek: BLASTS (Blasztok) LS (Nem szegmentált granulocyták)
LUC (Large Unstained Cells) Nagy nem festődő sejtek: Aktivált lymphocyták Plazmasejtek Hajas sejtek Gyermekkori nagy lymphocyták Myeloperoxidáz negatív blasztok Myeloperoxidáz negatív neutrophil granulocyták LUC Morfológiai flag-ek: ATYP (Atípusos lymphocyták) BLASTS (Blasztok) MPO (Mieloperoxidáz hiány)
20 éves ffi, fül-orr-gége ambulancián; láz, nyelési nehézség
Mindez a Sysmex XT-4000i automatán
Mononucleosis infectiosa
Fluoreszcens festés A sejtek emelkedett nukleinsav (DNS vagy RNS) tartalmával arányos a fluoreszcens jel nagysága
Felhődiagram fluorscens festéssel Sysmex XE-2000 automatán
IG (Immature Granulocytes) Promyelocyta IG Myelocyta Metamyelocyta
IG (Immature Granulocytes) Emelkedhet: Bakteriális infekció Akut gyulladás Tumor (csontvelő metastasis) Szövet nekrózis Akut transzplantátum rejekció Sebészeti, ortopédiai trauma Myeloproliferatív betegség Steroid Terhesség (harmadik trimeszter) Nagyobb jelentőségű az emelkedés (IGs>2%): idősek, újszülöttek, koraszülöttek akut infekció myeloszupresszált betegek akut infekció neutropeniával járó szepsis
Magvas vörösvérsejtek a Sysmex XE-2100 automata NRBC csatornáján
UniCel DxH 800 Coulter NRBC mérés: 1. Vérminta hígítás 2. Nem magvas vvt lizálás 3. Elkülönítve marad: - fehérvérsejt + magvas vvs - thrombocyta - sejttörmelék 4. Minta a flowcell-be kerül 5. Lézer analízis - sejtméret - sejt karakterisztika - sejtmag differenciálás AL2 fénynyalábbal interferencia kiszűrése
Magvas vörösvérsejtek az Advia 2120 automata esetén
Leletkiadás magvas vörösvérsejt esetén
A magvas vörösvérsejtek megjelenése a periférián Újszülött korban: - újszülöttkori hemolitikus betegség - koraszülöttek és újszülöttek hypoxiás károsodása Felnőttkorban: - thalassemia - myeloproliferatív betegség ( myelofibrosis) - szolíd tumor csontvelői metasztázissal - extramedulláris hematopoiesis - hematopoietikus stressz ( szeptikémia, masszív hemorrhagia, súlyos hipoxia)
Ajánlott klinikai alkalmazás - hematológiai betegségek diagnózisa - súlyos kardio-thorakális műtéten átesett, egyéb sebészet intenzív ellátást igénylő nem hematológiai betegségben prognosztikai faktor - csontvelő transzplantáció után ( >0,2x 10 9 /L fölött magas mortalitási ráta) - thalasszémia szindromában transzfúziós terápia hatékonyságának monitorozása
Coulter DxH 800 automatán nagyon kis számban fordul elő fals negatív vagy fals pozitív magvas vörösvérsejt tartalmú minta A. JEAN, C. BOUTET, B. LENORMAND, et all. The new haematology analyzer DxH 800: an evaluation of the analytical performances and leucocyte flags, comparison with the LH 755 International Journal of Laboratory Hematology Volume 33, Issue 2, pages 138 145, April 2011
Reticulocyta mérés Beckman Coulter UniCel DxH 800 automatán Metilénkék festést használva
Reticulocyta cytogram - reticulocyta érés Advia High Angle (5-15 degrees) Oxazine 750 Absorbance
Reticulocyta cytogram Sysmex XE-2000 automatán Fluoreszcens intenzitás alapján
98 hemodializált beteg reticulocyta számának összehasonlítása
Származtatott reticulocyta paraméterek MRV (vagy MCVr)a reticulocyta populáció átlagos sejtmérete CHr (vagy RetHe)a reticulocyta populációban egy sejt átlagos hemoglobin tartalma CHCMr a reticulocyta populáció átlagos hemoglobin tartalma M-RTC% a közepes abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya %-ban M-RTC# a közepes abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya abszolút értékben H-RTC% a nagy abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya %-ban H-RTC# a nagy abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya abszolút értékben IRF-M+H a közepes és nagy fluoreszcens intenzitású éretlen reticulocyták aránya %-ban
MCVr vagy MRV (Mean reticulocyte volume) használata Vashiányos erythropoesis diagnózisa Táplálkozással kapcsolatos anémiák esetén a terápia korai hatásának monitorozása Csontvelő transzplantáció után az erythropoesis helyreállásának követése Sportolók erythropoetin használatának kimutatása
Jó korreláció ellenére az Advián mért MRV szignifikánsan magasabb, mint a Beckman DxH 800-on mért MCVr érték
IRF(Immature reticulocyte fraction) használata Anémiák differenciálása Táplálkozással kapcsolatos anémiák terápiájának monitorozása Csontvelő regeneráció korai monitorozás (csontvelő transzplantáció vagy kemoterápia után) Aplasztikus anémia verifikálása Csontvelő sejtek gyűjtésének időzítése
CHr (mean reticulocyte hemoglobin content)- Advia Ret-He (reticulocyte hemoglobin equivalent )- Sysmex (RsF (Red blood cell size factor) Beckman-Coulter) Abszolút vagy funkcionális vashiányos eritropoesis diagnózisa (vashiány korai kimutatása gyermekekben CHr cut off 28 pg/ml)) Orális és intravénás vasterápia monitorozása Dialízis alatt az erythropoetin terápia monitorozása
98 hemodializált beteg összehasonlító értékei Advia CHr és DXH800 RSf esetén 7. ábra Vörösvérsejt méretfaktor és a reticulocyta haemoglobin tartalma közötti összefüggés @RSf (fl) 130 120 110 100 90 80 p < 0,001 r 2 = 0,5605 70 20 25 30 35 40 CHr (pg)
RBC fragmentocyták a Sysmex XE 2000 felhődiagramon RBC
Fragmentált vörösvérsejtek Sysmex XE 2000 automatán Klinikai alkalmazás: Microangiopathiák diagnózisa és Monitorozása Thrombotic microangiopathic anemia (TMA) a, thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) b, hemolytic-uremic syndrome (HUS) Csontvelőtranszplantáció utáni monitorozás HELLP syndrome
Vvs fragmentek 1. mérés
Vvs fragmentek 2. mérés (RET csatorna)
Fragmentált vörösvérsejtek (schistocyták) mérésének összehasonlítása Advia 120 automatán és manuális módszerrel Lesesve JF, Salignac S, Alla F, et al. Comparative evaluation of schistocyte counting by an automated methodand by microscopic determination. Am J Clin Pathol.2007;121:739-745.
Thrombocyták Flow-cytometriás analízise High angle detector (5 o - 15 o ) 670nm Laser Diode Low angle detector (2 o -3 o ) Előny: specificitás és szenzitivitás
Thrombocyta cytogram (Advia 120) Térfogat 5 2 1 Thrombocyták 2 Nagy thrombocyák 3 Vörösvérsejtek 4 Vvs fragmentumok 5 Üres vvs-ek 3 1 4 Refraktív index (Thr törésmutató)
Optikai thrombocyta mérés reticulocyta csatornán (Sysmex XE-2100)
Thrombocytopenia 1. mérés (impedancia elven)
Thrombocytopenia 2. mérés (optikai elven)
Óriás thrombocyták csak optikai elven mérhetők
Thrombocyta mérés Fluorocell fluoreszcens festéssel Sysmex XN2000 automatával r=0.988 r=0.956 M. Schoorl Haematology & Immunology 2012 Reproducibility At a level of 20x109/LPLTs, reproducibility for PLT-I, PLT-O and PLT-F on the XN2000 demonstrated coefficients of variation of 9.3%, 8.5% and 3.0% respectively.
Thrombocytákról kapott információk PLT Thrombocyta szám (PLT Count x RBC Cal Factor x PLT Cal Factor) MPV Átlagos thrombocyta térfogat PDW Thrombocyta eloszlási görbe szélesség Large LPLT nagy thrombocyta térfogat (nagyobb mint 20 fl) IPF% (Immature platelet Fraction) reticulált thrombocyták
MPV (átlagos thrombocyta térfogat) signifikánsan nagyobb akut koronária betegségben MPV M A: Acute coronary events C: Controls J Clin Pathol. 2009
IPF% (Immature Platelet Fraction) retikulált thrombocyták normál IPF
Retikulált thrombocyta (IPF) Fiatal, mrns tartalmú thrombocyta Élettartama: 1 nap Referencia tartomány: 1.1-6.1% Érett thrombocytánál nagyobb Denzitása is nagyobb, mint az érettebb alakoké Emelkedett vagy normál IPF: ITP (immun thrombocytopénia) Alacsony IPF: Csontvelő elégtelenség J.Lab.Med. 2008
IPF értékek különböző klinikai állapotokban: 1. Kemoterápia utáni thrombopoesis megítélése IPF% korábban emelkedik, mint a thrombocyta szám 2. Thrombocyta transzfúzió után: IPF% 24 órán keresztül csökken ok: hígulás, TPO gátlás 3. Sepsisben az IPF% emelkedett thrombocyta szám emelkedés nélkül ok: IL-6: TPO-szerű aktivitás perifériás thrombocyta destrukció 4. Súlyos thrombocytopénia esetén a thrombocytaszám emelkedés 24-48 óra múlva várható emelkedett IPF% esetén
Köszönöm a megtisztelő figyelmet! Köszönöm a figyelmet!