Újabb típusú hematológiai automaták által kapott paraméterek értelmezése

Átírás

1 Újabb típusú hematológiai automaták által kapott paraméterek értelmezése Bekő Gabriella Semmelweis Egyetem Laboratóriumi Medicina Intézet Központi Laboratórium (Pest) április 20.

2 A fehérvérsejtek, vörösvértestek és thrombocyták automatával történő számolása alig 50 éves múltra tekint vissza A módszer harmonizációja, a mért paraméterek standardizációja, a számolt paraméterek elfogadása az 1990-es évek végén történt A XXI. század modern komputer és network technikái hozzájárultak a mechanikai és algoritmusokon alapuló kontroll rendszerek kifejlesztéséhez A hematológiai automaták napjainkban már képesek részletekbe menő, nagyon pontos eredményközlésre, amelyből sokszor juthatunk korrekt diagnózishoz minimális emberi munkával

3 Lehetőségek és korlátok A hematológiai automatákból teljesen megbízható értékeket kapunk: - fehérvérsejtszám, vörösvérsejtszám, hemoglobin koncentráció, MCV Nagyobb odafigyelést kíván: - a qualitatív eloszlás, a reticulocyta és a thrombocyta szám (főként alacsony tartományban) Standardizáció hiánya miatt készülékfüggő: - RDW (RBC distribution width) - MPV ( mean platetet volume) - PDW (platelet distribution width)

4 Lehetőségek és korlátok A készülék által használt festésből adódó különbségek: - peroxidáz festésnél LUCs (large unstaind cells) - fluorescens festésnél: IGs( Immature Granulocytes) - HPCs (Hematopoetic progenitor cells) and NRBc (Nucleated RBCs) Új paraméterek klinikai használata: - IRF (immature reticulocyta fraction) - MCVr (mean reticulocyta volume) - CHr ( mean reticulocyte hemoglobin content) - FRBC (fragmented RBC) - IPF (immature platelet fraction)

5 Hematológiai automaták mérési elvei Impedancia elvű mérés ellenállás változás a sejtek vezetőképessége kisebb sejtnagyságtól függő elektromos impulzus Nagy frekvencia elvű mérés - sejtfal vezetőként viselkedik, az áram áthaladva a sejten belső struktúráról is informál ( a sejten belüli granuláris, nukleáris összetételről, vegyi eltérésekről) a nagy frekvenciájú impedancia impulzus speciális szoftverrel (Adaptív Cluster Analysis System) érett és éretlen granulocyták elkülöníthetők

6 Optikai, fényszórás (vagy szórt lézer) elvű mérés Hidrodinamikailag fókuszált sejtáramlás, megvilágító lézer fény és detektor Kis szög (2-4 o ) alatti fényszórás a sejt mérettel, a nagyobb szög alatti (10-15 o ) fényszórás a sejt tartalommal (pl. hemoglobin koncentráció, vagy sejtmag sûrûség) arányos A kis és a nagy szög alatt szórt fény intenzitásának komplex matematikai összefüggését a Mie teória írja le

7 Optikai, fényszórás (vagy szórt lézer) elvű mérés 5 lézer detektorral Beckman Coulter DXH Volume (térfogat) - Conductivity (vezetőképesség) -Axial light loss (AL2) - Low angle light scatter (LALS) - Median angle light scatter (MALS) -Lower median angle light scatter (LMALS) - Upper median angle light scatter (UMALS) fényáteresztő képesség (transparency) sejt komplexitás sejt granularitás, sejtmembrán felszíne

8 Fehérvérsejt diferenciálás festés nélkül

9 Peroxidáz pozitív sejtek L N N L E M L N N M B N M = Monocyta N = Neutrophil E = Eosinophil L = Lymphocyta B = Basophil Wright festés Peroxidáz festés

10 Felhődiagram peroxidáz festéssel 1 Zaj 2 Magvas vörösvv svérsejt 3 Összetapadt thrombocyták 4 Lymfocyták és s basophylek 5 Large Unstained Cells (LUC) 6 Monocyták 7 Neutropylek 8 Eosinophylek Morfológiai flag-ek: ATYP (Atípusos lymphocyták) IG (Éretlen granulocyták) MPO (Myeloperoxidase hiány) NRBC (Magvas vörösvérsejtek) PLT-CLM (Összetapadt thrombocyták)

11 Felhődiagram a bazofil csatornán 1. Zaj 2. Blasztok sejtmagja 3. Monociták és limfociták sejtmagja 4. Bazofil sejtek 5. Bazofil gyanús sejtek 6. Szaturáció 7. Neutrofil és eosinofil sejtmagok Morfológiai flag-ek: BLASTS (Blasztok) LS (Nem szegmentált granulocyták)

12 LUC (Large Unstained Cells) Nagy nem festődő sejtek: Aktivált lymphocyták Plazmasejtek Hajas sejtek Gyermekkori nagy lymphocyták Myeloperoxidáz negatív blasztok Myeloperoxidáz negatív neutrophil granulocyták Morfológiai flag-ek: ATYP (Atípusos lymphocyták) BLASTS (Blasztok) MPO (Mieloperoxidáz hiány) LUC

13 20 éves ffi, fül-orr-gége ambulancián; láz, nyelési nehézség

14 Fluoreszcens festés A sejtek emelkedett nukleinsav (DNS vagy RNS) tartalmával arányos a fluoreszcens jel nagysága

15 Felhődiagram fluorscens festéssel Sysmex XE-2000 automatán

16 IG (Immature Granulocytes) Promyelocyta IG Myelocyta Metamyelocyta

17 IG (Immature Granulocytes) Emelkedhet: Bakteriális infekció Akut gyulladás Tumor (csontvelő metastasis) Szövet nekrózis Akut transzplantátum rejekció Sebészeti, ortopédiai trauma Myeloproliferatív betegség Steroid Terhesség (harmadik trimeszter) Nagyobb jelentőségű az emelkedés (IGs>2%): idősek, újszülöttek, koraszülöttek akut infekció myeloszupresszált betegek akut infekció neutropeniával járó szepsis

18 IG (Immature Granulocytes) In this comparison of the IG count on the XE-2100 to the manual count, the correlation coefficient was The XE-2100 IG results showed significant correlation with the results from the manual immature granulocyte count. We concluded that the XE-2100 IG demonstrated comparable performance to the manual IG count. Diane Field, Elizabeth Taube, Sherry Heumann Performance Evaluation of the Immature Granulocyte Parameter on the Sysmex XE-2100 Automated Hematology Analyzer St. Anthony's Medical Center, St. Louis, Missouri, USA Laboratory Hematology 2006

19

20 növekvő sejt átlagtérfogat és SD éretlen neutrophil granulocytákra utal NORMAL CASE CASE WITH MODERATE LEFT SHIFT

21 Éretlen granulocyták növekvő számban In these four cases cases, we can see a normal (left) and progresively to the right cases with an increase in number of Imm NE. As we can see the SD Vol NE is also progresively higher.

22 Magvas vörösvérsejtek a perifériás vérben

23 Magvas vörösvérsejtek a Sysmex XE-2100 automata NRBC csatornáján

24 UniCel DxH 800 Coulter NRBC mérés: 1.Vérminta hígítás 2.Nem magvas vvt lizálás 3.Elkülönítve marad: - fehérvérsejt - thrombocyta - sejttörmelék 4.Minta a flowcell-be kerül 5.Lézer analízis - sejtméret - sejt karakterisztika - sejtmag differenciálás AL2 fénynyalábbal interferencia kiszűrése

25 Magvas vörösvérsejtek az Advia 2120 automata esetén

26 Leletkiadás magvas vörösvérsejt esetén

27 A magvas vörösvérsejtek megjelenése a periférián Újszülött korban: - újszülöttkori hemolitikus betegség - koraszülöttek és újszülöttek hypoxiás károsodása Felnőttkorban: - thalassemia - myeloproliferatív betegség ( myelofibrosis) - szolíd tumor csontvelői metasztázissal - extramedulláris hematopoiesis - hematopoietikus stressz ( szeptikémia, masszív hemorrhagia, súlyos hipoxia)

28 Ajánlott klinikai alkalmazás - hematológiai betegségek diagnózisa - súlyos kardio-thorakális műtéten átesett, egyéb sebészet intenzív ellátást igénylő nem hematológiai betegségben prognosztikai faktor - csontvelő transzplantáció után ( >0,2x 10 9 /L fölött magas mortalitási ráta) - thalasszémia szindromában transzfúziós terápia hatékonyságának monitorozása

29 Evaluation of a New Real-Time Flow-Cytometry Based NRBC Enumeration Method for the Routine Hematology Laboratory Alexander Kratz, M.D., Ph.D., M.P.H., 1 Gail Kling, MT(ASCP), 2 William Canfield, M.A., 2 Karim Maloum, M.D., Ph.D., 3 Conor O Malley, FIBMS, 4 Gina Zini, M.D., 5 Vincenzo Rocco, M.D., 6 David Zelmanovic, Ph.D., 2 and Jolanta Kunicka, Ph.D. 2 1) Department of Pathology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, Boston, Massachusetts; 2) Bayer HealthCare LLC, Diagnostics Division, Tarrytown, New York; 3) G.H. Pitié-Salpétrière, Paris, France; 4) St. James University Hospital, Leeds, United Kingdom; 5) Policlinico Universitario Gemelli, Rome, Italy; 6) Azienda Ospedaliera "G. Rummo", Benevento, Italy 2007

30 Korreláció az XE és a flow cytometer NRBC eredményei között Sysmex Journal Internal 2005

31 NRBC counts for all samples collected (n= 201) on the DxH 800 vs. flow cytometry (FCM). R 2 Value for DxH 800 vs. FCM was R= 0.95 B D HEDLEY, M KEENEY, I CHIN-YEE, and W BROWN Initial performance evaluation of the UniCel DxH 800 Coulter cellular analysis system Int J Lab Hematol February; 33(1):

32 Coulter DxH 800 automatán nagyon kis számban fordul elő fals negatív vagy fals pozitív magvas vörösvérsejt tartalmú minta A. JEAN, C. BOUTET, B. LENORMAND, et all. The new haematology analyzer DxH 800: an evaluation of the analytical performances and leucocyte flags, comparison with the LH 755 International Journal of Laboratory Hematology Volume 33, Issue 2, pages , April 2011

33 Hematopoietic Progrenitor Cells az XE-2100 Sysmex automatán az IMI (Immature Myeloid Information) csatornán

34 HPC CD34+ (Hematopoietic Progrenitor Cells) Sysmex XE 2100 automatán Padmanabhan A, Reich-Slotky R, Jhang JS, Dael S, Crowder T, Colovai AI, Schwartz J. Use of the haematopoietic progenitor cell parameter in optimizing timing of peripheral blood stem cell harvest. Department of Pathology, College of Physicians and Surgeons of Columbia University, Columbia University Medical Center, 180 Fort Washington Avenue, New York, NY 10032, USA. Vox Sang. 2009

35 Alacsonyabb sejtszámnál gyengébb összefüggés The area under the curve for HPCs was significantly smaller than the preharvest CD34+ cell count on the ROC curve for predicting adequate harvest yield (> CD34+ cells/l) of processed blood volume, vs , p = 0.001). Yang SH, Wang TF, Tsai HH, Lin TY, Wen SH, Chen SH. Preharvest hematopoietic progenitor cell counts predict CD34+ cell yields in granulocyt colony stimulating factor-mobilized peripheral blood stem cell harvest in healthy donors Department of Pediatrics, Hualien Buddhist Tzu-Chi General Hospital, Hualien, Taiwan. Transfusion. 2010

36 Vörösvérsejtekről kapott információk 1. Vvs átlagos hemoglobintartalma (mean corpuscular hemoglobin) *MCH = Hb / vvs szám x10 *sejtenkénti átlagos Hb mennyisége 2. Vvs átlagos térfogata (mean corpuscular volume) *MCV = Ht / (vvs szám x 1000) *MCV = közvetlenül a RBC volume histogramból 3. Vvs átlagos hemoglobinkoncentrációja (mean corpuscular hem. conc.) *MCHC = Hb/(vvs szám x MCV) x 1000 *CHCM = közvetlenül a Hgb concentracion histogramból 4. Vvs populáció szélessége (red diagram distribution width) *RDW 5. Microcyta %, Macrocyta %, Hypochrom %, Hyperchrom % 6. MAF (Microcitic Anemia Factor), %LHD (Low Hemoglobin Density %)

37 MCV és RDW használata MCV RDW Vashiány Pozitív prediktív érték = 97.8% Legjobb teszt a CHr (reticulocyta hemoglobin koncentráció) MCV RDW Thalassemia trait MCV RDW - Akut anémia/krónikus intercurrens betegség Transiens erythrocytopenia (TEC) MCV RDW Vérvesztés Hemolitikus anémia

38 MCV és RDW használata MCV RDW Újszülöttek Reticulocytosis B12/fólsav hiány Hypothyreosis Májbetegség MCV RDW Preleukemia Leukemia Aplasztikus anémia Diamond-Blackfan szindróma Down szindróma Dohányzás

39 RDW (RBC Distribution Width) standardizáció hiánya van den Bossche J, Devreese K, Malfait R, et al. Reference intervals for a complete blood count determined on different automated haematology analysers: ABX Pentra 120 retic, Coulter Gen-S, Sysmex SE 9500, Abbott Cell Dyn 4000 and Bayer ADVIA 120. Clin Chem Lab Med. 2002;40:69-73.

40 Interferenciát okozó tényezők Hb Hct RBC MCV MCH MCHC Cold agglutinins Leukocytosis Hyperglycemia Hypernatremia Triglyceridemia

41 Reticulocyta mérés Beckman Coulter UniCel DxH 800 automatán Metilénkék festést használva

42 Reticulocyta cytogram - reticulocyta érés High Angle (5-15 degrees) Oxazine 750 Absorbance

43 Reticulocyta cytogram Sysmex XE-2000 automatán

44 Származtatott reticulocyta paraméterek MCVr a reticulocyta populáció átlagos sejtmérete CHr a reticulocyta populációban egy sejt átlagos hemoglobin tartalma RetHe reticulocyte hemoglobin equivalent Rsf Red blood cell size factor CHCMr a reticulocyta populáció átlagos hemoglobin tartalma M-RTC% a közepes abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya %-ban M-RTC# a közepes abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya abszolút értékben H-RTC% a nagy abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya %-ban H-RTC# a nagy abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya abszolút értékben IRF-M+H a közepes és nagy abszorbanciájú éretlen reticulocyták aránya %-ban, IRF éretlen retuculocyta frakció

45 IRF(Immature reticulocyte fraction) használata Anémiák differenciálása Táplálkozással kapcsolatos anémiák terápiájának monitorozása Csontvelő regeneráció korai monitorozás (csontvelő transzplantáció vagy kemoterápia után) Aplasztikus anémia verifikálása Csontvelő sejtek gyűjtésének időzítése

46 CHr (mean reticulocyte hemoglobin content)- Advia Ret-He (reticulocyte hemoglobin equivalent )- Sysmex Rsf (Red blood cell size factor Coulter használata Abszolút vagy funkcionális vashiányos eritropoesis diagnózisa (vashiány korai kimutatása gyermekekben) Orális és intravénás vasterápia monitorozása Dialízis alatt az erythropoetin terápia monitorozása

47 Sysmex XE 5000 és LH 750 automaták RetHe és RSf paramétereinek összevetése elégtelen erithropoesis esetén Red blood cell size factor (RSf) is a new parameter provided by Beckman Coulter, which joins together the volume of the erythrocytes and the volume of reticulocytes. Good correlation between RSf and Ret He was observed, r = International Journal of Laboratory Hematology 2010

48 MCVr (Mean reticulocyte volume) használata Vashiányos erythropoesis diagnózisa Táplálkozással kapcsolatos anémiák esetén a terápia korai hatásának monitorozása Csontvelő transzplantáció után az erythropoesis helyreállásának követése Sportolók erythropoetin használatának kimutatása

49 RBC fragmentocyták a Sysmex XE 2000 felhődiagramon

50 Fragmentált vörösvérsejtek Sysmex XE 2000 automatán Klinikai alkalmazás: Microangiopathiák diagnózisa és monitorozása

51 Fragmentált vörösvérsejtek (schistocyták) mérésének összehasonlítása Advia 120 automatán és manuális módszerrel Lesesve JF, Salignac S, Alla F, et al. Comparative evaluation of schistocyte counting by an automated methodand by microscopic determination. Am J Clin Pathol.2004;121:

52 Thrombocyták Flow-cytometriás analízise High angle detector (5 o - 15 o ) 670nm Laser Diode Low angle detector (2 o -3 o ) Előny: specificitás és szenzitivitás

53 Thrombocyta cytogram (Advia 120) Térfogat Thrombocyták 2 Nagy thrombocyák 3 Vörösvérsejtek 4 Vvs fragmentumok 5 Üres vvs-ek Refraktív index (Thr törésmutató)

54 Thrombocyta mérés reticulocyta csatornán (Sysmex XE-2100)

55 IPF% (Immature Platelet Fraction) retikulált thrombocyták IPF

56 Thrombocytákról kapott információk PLT Thrombocyta szám (PLT Count x RBC Cal Factor x PLT Cal Factor) MPV Átlagos thrombocyta térfogat PDW Thrombocyta eloszlási görbe szélesség Large LPLT nagy thrombocyta térfogat (nagyobb mint 20 fl) IPF% (Immature platelet Fraction) reticulált thrombocyták

57 IPF% (Immature Platelet Fraction) retikulált thrombocyták használata Thrombocytopenia differenciál diagnosisa Kemoterápia és csontvelő átültetés után a thombocyta rendszer helyreállásának jelzője Thrombocytózisban a thrombózis rizikó-indexe Profilaktikus thrombocyta transzfúzió szükségének megítélése Trombocyta turnover becslése

58 Köszönöm a megtisztelő figyelmet!