Csontbiopsziák szövettani feldolgozása nemzetközi ajánlások alapján 1. rész

Átírás

1 Csontbiopsziák szövettani feldolgozása nemzetközi ajánlások alapján 1. rész DE KK, Pathologia Beke Lívia, Szeőcs Judit A tumorspecifikus diagnosztika irányvonalai című elméleti továbbképzés. Kromat Kft. és a Dako Agilent Pathology Solutions Budapest, 2017.május.26

2 Department of Haematology, St George Hospital, Sydney, NSW, Australia Department of Haematology, Addenbrooke s Hospital, Cambridge, UK Department of Pathology, Radiumhemmet, Karolinska University Hospital, Stockholm, Sweden Department of Hematology, Nagasaki University Hospital, Nagasaki City, Japan Department of Pathology, Feinberg Medical School of Northwestern University, Chicago, IL, USA

3 Mintagyűjtés, és feldolgozás:

4 Nemzetközi ajánlások: Call for a European programme in external quality assurance for bone marrow immunohistochemistry; report of a European Bone Marrow Working Group pilot study Torlakovic EE, Naresh K, Kremer M, van der Walt J, Hyjek E, Porwit JClin Pathol 2009;62: Az Európai Csontvelő Munkacsoport létrehozott egy bizottságot, amelynek feladata, hogy megvizsgálja a EQA program keretén belül a csontbiopsziából készült IHC festések hitelességét Európában. Department of Pathology and Laboratory Medicine, Royal University Hospital, University of Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan, Canada;2 Department of Histopathology, Hammersmith Hospital and Imperial College, London, UK; 3 Institute of Pathology, Technical University of Munich, Munich, Germany; 4 Department of Histopathology, St Thomas Hospital, London, UK; 5 Department of Pathology, The University of Chicago, Chicago, Illinois, USA; 6 Department of Pathology, Karolinska University Hospital, Stockholm, Sweden

5 Web alapú felmérés kérdései: 28 laboratórium vett részt: Milyen fixálószert használnak, mennyi fixálás ideje? Milyen dekalcinálási módszert használnak? Milyen a beágyazás módja? Milyen a metszetek vastagsága? Milyen IHC protokollt alkalmaznak? Mik a leggyakrabban vizsgált markerek, IHC-vizsgálatok indikációi? Rendelkezésre állnak-e áramlási citometria eredmények? Használnak-e pozitív és negatív kontrollokat? Fontosnak tartják-e a leletátfutási időt? Vajon szükség van-e a BMTB IHC-re vonatkozó EQA programra vagy sem? Stb.

6 Fixálás A laborok: 54%-a 10% NBF 18%-a B5 14%-a AZF 14%-a egyéb: Schaffer-, Burckhard fixáló, F G mixture, SUSA Fixálás ideje: 2 és <24 óra között Fixálás állandósága : 17%-a egységesen mindig egyforma 79%-a változó Csont biopszia, HE festés, 5x

7 Dekalcinálás: A Laborok: 57%-a EDTA 14%-a Gooding és Stewarts 29%-a egyéb módszer: RDO (Rapid Decalcifier) SUSA 10% salétromsav Stieve oldat Zenker/jégecet oldat Osteosoft Dekalcinálás ideje: 45 perc- 3 nap között Dekalcinálás állandósága : 54 %-a egységesen mindig egyforma 46%-a változó Appandix, HE festés 1xx

8 Beágyazás, és a többi... Beágyazás: 93%-a paraffinba ágyazott 7% -a műanyag beágyazás Metszet vastagság: 18%-a 4 6 mikron metszet 5%-a több, mint 6 mikron metszet IHC protokoll: 68%-a ugyanazt IHC protokollt használta, mint nem dekalcinált szöveteken. Átfutási idő: átlagosan 4,8 napot (1-10 nap) (IHC is) A TAT idő a laboratóriumok 64% -ának fontos paraméter! 78%-a kevesebb, mint 4 mikron metszet

9 Mintaküldés CD34, CD117, CD20, CD3, Ki-67, megakaryocita marker, (össz. 109 metszet) A metszetek értékelése a QualiCont értékeléshez hasonlóan történt. A résztvevők 93%-a úgy vélte hogy kiváló eredményeket produkált, mégis a résztvevő laboratóriumok közül csak négynek (21%) nem volt egyetlen vizsgált marker esetében sem gyenge eredménye. A legrosszabb eredményt a CD117 és Ki-67 festések során tapasztaltak. A CD34, és CD20 a legkevésbé problémás. A vizsgált 109 metszet 29%-a nem volt értékelhető!

10 Probléma: A csontvelő biopszia szöveti feldolgozása során számtalan egyedi protokoll alakult ki. Pre-analitikai körülmények alapvetően befolyásolják az IHC eredményeket. Amíg nem tudjuk ezeket a körülményeket egységesíteni a standardizáció is lehetetlen. A rögzítés és a dekalcinálás megválasztása standardizáció alapja. A külső minőség-ellenőrző programok nem tudják figyelembe venni az eltérő, egyedi protokollokat.

11

12 Az ajánlás tartalma: Ajánlások IHC vizsgálati osztályozás Preanalitikai standardok Analitikai standardok Posztanalitikai standardok Minőségbiztosítási szabványok Különleges megfontolások az analitikai fázishoz Az analitikai fázisra vonatkozó különös megfontolások A poszttanalitikai fázisra vonatkozó különös megfontolások A minőségbiztosításra vonatkozó különleges megfontolások Appendix, PAX5, 1x

13 Preanalitikai standard részei: ischaemiás idő alvadék minta-előkészítés fixálás és fixálás idő dekalcináló oldat, dekalcinálás ideje beágyazás festetlen metszet és annak tárolási ideje

14 Preanalitikai standard: Ischemiás időre vonatkozó ajánlások: 1. ajánlás: A használatra kész fixáló folyadékot tartályban a mintavétel helyére kell tenni! A mintát azonnal fixálni kell! Rendkívül fontos, hogy az ischaemiás idő kiszámítható és nagyon rövid legyen!

15 Preanalitikai standard: 2. ajánlás: Javasolt lenyomati kenet készítése. Az előre feliratozott tárgylemezeket a mintavételi helyére kell vinni, hogy a formalinba helyezés előtt, várakozás nélkül elkészüljön a kenet. 3. ajánlás: Ha fixálatlan mintára van szükség, ügyelni kell arra, hogy a laboratóriumban való szállítási idő legrövidebb legyen! 4. ajánlás: A szállítás során meg kell akadályozni a csont biopszia kiszáradását. A mintát zárt tartályban, fiziológiás sóoldatban, PBS-ben, vagy az RPMI oldattal átitatott steril gézlap közé kell helyezni más szállítási közeg nem ajánlott. 5. ajánlás: A lenyomati kenet készítésekor, légkondicionált helységben a mintát óvni kell a kiszáradástól.

16 A mintával csak óvatosan!

17 Alvadék minta gyűjtésre vonatkozó ajánlás: Csontvelői aspirátum, és csonthenger Alvadék mintában a fixáló szer gyorsan penetrál, a beágyazott minta könnyen metszhető.

18 Ajánlás fixálásra, fixálási időre: TAT idő: Fixálószer: Fixálási idő: Dekalcinálás Dekalcinálás i idő: Nagyon rövid Ecetsav cink formalin (AZF) 2 72 óra Shandon TBD-1 TM, Decalcifier perc Közepes Ecetsav cink formalin (AZF) Egy éjszaka Gooding and Stewart s dekalcináló oldat 6 óra Standard: preferált 10% pufferelt formalin = 3.7% formaldehid 8-72 óra 14% EDTA óra Feltételekhez kötött!!!

19 Ajánlás fixálásra, fixálási időre: Nagyon rövid TAT idő: Fixálás: Ecetsav cink formalin (AZF) Cink-klorid 12.5 g; cc. formaldehid 150 ml; ecetsav 7.5 ml;dv1000 ml Ideje: 2-72 óra Előnyösebb a hosszabb fixálási idő, a megadott idő tartományon belül. Dekalcinálás: Shandon TBD-1 dekalcináló oldat Ideje: perc Mérlegelni kell a rövidebb protokoll választása során, a savas dekalcinálás mindig agresszív, amely megköveteli, hogy a csontvelő fixálása tökéletes legyen! A minta mérete alapján a fixálási-és dekalcinálási időt validálni kell erre a célra. Rendkívül fontos, hogy minden reagens friss legyen, tehát nem optimális, ha nagyszámú minta esetén az oldat felhígul, mindig olvassuk el az ajánlást! Egyidejű rögzítés és dekalcinálás nem ajánlott. A legtöbb ilyen kombinációkban a sav még a rögzítés előtt roncsolja a szövetet!

20 Ajánlás fixálásra, fixálási időre:: Közepes TAT idő: Hammersmith Protokoll Fixálás: AZF-ben Cink-klorid 12.5 g; cc. formaldehid 150 ml; ecetsav 7.5 ml;dv1000 ml Ideje: éjszaka Dekalcinálás: Gooding and Stewart s dekalcinálóval 10% hangyasav,5% formaldehid keveréke Ideje: 6 óra Optimal processing of bone marrow trephine biopsy: the Hammersmith Protocol. Naresh KN(1), Lampert I, Hasserjian R, Lykidis D, Elderfield K, Horncastle D, Smith N, Murray-Brown W, Stamp GW J Clin Pathol Sep;59(9): Figure 1 (A D) Haematoxylin and eosin (H&E) section of chronic myeloid leukaemia (A)640; (C)6200 with foci of abnormal localisation of immature precursors; (B)6100; (D)6400. (E H) Myeloproliferative disorder with dysplastic features. (E) H&E staining,6200; (F) Geimsa,6200; (G)Perl s,6200; (H) silver/reticulin,6200.

21 Ajánlás fixálásra, fixálási időre: Standard TAT idő/perefrált protokoll! Fixálás: 10% Neutrális pufferelt formalinban Ideje: 8-72 óra Fixálás ideje csökkenthető. Nem ajánlott rövid protokoll. Optimális rögzítést nem lehet elérni, ha a formalin fixálás ideje kevesebb, mint <8 óra, és az elégtelen fixálás utáni dekalcinálás még jobban elősegíti az antigenitás elvesztését! Fém-EDTA kelátkomplex Dekalcinálás: 14% EDTA Ideje: óra Csontbiopszia, NASD 20x

22 Ajánlás fixálásra, fixálási időre: Általános ajánlás fixálásra: 1. ajánlás: Figyelembe kell venni, hogy a melegítés és a keverés javítja a rögzítési időt. 2. ajánlás: Az ajánlott fixálószer dekalcinálás előtt 10%-os pufferelt formalin vagy AZF. 3. ajánlás: A megfelelő fixálószer kiválasztása a TAT időtől függ. És a többi miért nem... Bouin fixáló: alacsony ph, pikrinsav tartalma miatt robbanásveszélyes, továbbá, egy nemrégiben készült tanulmány kimutatta, hogy a Bouin-oldatban fixált minta IHC eredményei eltérnek a formalinban fixált minták IHC eredményeitől. Zenker fixáló: higany-kloridot tartalmaz, ugyan alkalmas IHC vizsgálatra], de a mérgező; veszélyes hulladék kezelése rendkívül költséges. B5 fixáló: jó morfológia és fehérje megőrzöttség jellemzi, gyors dekalcinálóval kombinálva jó eredmény érhető el, de környezetvédelmi szempontok miatt nem ajánlott, valamint nukleinsav vizsgálatára sem ajánlott

23 Ajánlás dekalcinálásra: 1. ajánlás: Figyelembe kell venni, hogy a melegítés és a keverés javítja a dekalcinálási időt C-on 30-40%-al csökkenthető a dekalcinálás ideje!

24 Ajánlás dekalcinálásra: 1958-ban tudták, hogy a minták dekalcinálási idejét csökkenteni lehet: keveréssel, szobahőmérsékleten 30%-al. Verdenius HH, Alma L. A quantitative study of decalcification methods in histology. J Clin Pathol 1958;11:

25 Ajánlás dekalcinálásra: Csontvelőaspirátum Csontvelőcore biopszia Csontvelőaspirátum áramlási citometria v. Csontvelő aspirátum citogenetikai vizsgálatra Csontvelő aspirátum molekuláris vizsgálatra Rövid fixalás rövid dekalcinálással nem ajánlott/nem megfelelő Rövid fixalás rövid dekalcinálással elfogadható lehet 2. ajánlás: Javasolt, hogy a dekalcináló reagens típusának kiválasztása a megengedett TAT-ra vonatkozzon. Rövidebb TAT-választás nem ajánlott, ha nem állnak rendelkezésre további speciális vizsgálati minták!

26 Ajánlás dekalcinálásra: 3. ajánlás: A dekalcinálószert kb. 10 perces, óvatos öblítéssel el kell távolítani. 4. ajánlás: Kombinált dekalcináló fixáló nem ajánlott.

27 Preanalitikai standard: beágyazás csont biopszia beágyazás: 1.paraffinba 2.gyantába Mindkét módszernek vannak előnyei és hátrányai. 1. ajánlás: paraffinba ágyazás ajánlott. A legnagyobb probléma az elégtelen szöveti víztelenítés és derítés paraffinba ágyazás előtt.

28 Műgyanta beágyazás: Előnye: szükségtelenné válik a dekalcinálás Hátrányai: feldolgozáshoz, csak néhány központ rendelkezik megfelelő szaktudással. nem automatizálható drága A) BM gyantablokkja. (B) Metszés rotációs Volfrámkarbid szélű késsel

29 Preanalitikai standard: metszés 1. ajánlás: Vékony, általában 2-3 mikron vastagságú metszet teszi lehetővé a kiváló minőségű morfológiai értékelést. 2. ajánlás: Metszés iránya: derékszögben a hosszú oldalon. 3. ajánlás: A festetlen metszeteket a lehető leghamarabb meg kell festeni. Festetlen metszeteket - 80 C-on egyenként alufóliába csomagolva kell tárolni. Paraffin Section Storage and Immunohistochemistry: Effects of Time, Temperature, Fixation, and Retrieval Protocol with Emphasis on p53 Protein and MIB1 Antigen Wester, Kenneth Ph.D.; Wahlund, Eva B.L.T.; Sundström, Christer M.D., Ph.D.; Ranefall, Petter Ph.D.; Bengtsson, Ewert Ph.D.; Russell, Pamela J. Ph.D.; Ow, Kim T. M. Sc.; Malmström, Per-Uno M.D., Ph.D.; Busch, Christer M.D., Ph.D. AIMM :Volume 8(1), March 2000, pp 61-70

30 II. Analitikai standardok A felmérések azt mutatták, hogy sok pre-analitikai faktor hatással van az epitópforrások megtatására, azonban csontvelő feldolgozás sikere függ a választott immunhisztokémiai protokolltól. A megfelelően választott immunhisztokémiai protokoll kompenzálhatja a szuboptimális pre-analitikai paramétereket: primer antitest-koncentráció, az inkubációs idő, érzékenyebb detektáló rendszer stb., és ennek következtében javulhat immunhisztokémiai festés eredménye. Sajnos, gyakran az igen magas érzékenységű protokoll sem képes teljesen kompenzálni preanalitikai szakasz hibáit.

31 IHC vizsgálati osztályozás I. osztályú immunhisztokémiai vizsgálatok: A patológus az IHC vizsgálat eredményeiét értelmezi, az eredmény a diagnózis felállításához szükséges (pl. cytokeratin a daganat típusának meghatározásához: S-100, vimentin, CD45, CDX2, TTF1, stb. Nem határoz meg önálló determináns kezelést. Minőségi IHC vizsgálatok, amelyeket diagnosztikai célokra használnak; A validálás tervezését az orvos határozza meg. Az immunhisztokémai eredmények leíró jellegűek, és általában "pozitív-nak" vagy "negatív-nak"

32 IHC vizsgálati osztályozás

33 IHC vizsgálati osztályozás II. osztályú immunhisztokémai vizsgálatok: Az IHC teszt eredményeit (hemato) patológusok értelmezik; Ezek az immunhisztokémiai vizsglatok prognosztikai vagy prediktív faktorokat határoznak meg. Az eredményt onkológusok vagy más nem patológus orvosok felhasználják a beteg terápiás kezeléséhez vagy más jelentős klinikai döntéshozatalhoz. Követni kell az ajánlott nemzetközi irányelveket. A mellrák diagnosztikus markerek esetében ezek az iránymutatások rendelkezésre állnak, de hiányzik az egyéb markerek esetében, mint például csontvelő immunhisztokémia.

34 II. Analitikai standardok 1. ajánlás: Az immunhisztokémiai protokollokat validálni kell!

35 II. Analitikai standardok 2. ajánlás: A protokoll jellemzőinek ellenőrzése megfelelően kalibrált kontroll használatával ajánlott. CD 30 festés

36 II. Analitikai standardok 3. ajánlás: Minden IHC vizsgálathoz külön standard protokollt kell készíteni, mivel minden IHC vizsgálat egy másik teszt. Ennek az információnak rendelkezésre kell állnia az összes laboratóriumi személyzet számára (vagy akkreditációs eljárás során) Separate standard operating procedures (SOPs): Primer antitest: típusa: monoklonális v poliklonális, klón, lot szám, source/gyártó, koncentrált, vagy hígított, és a hígítás (ha koncentrált) Inkubáció ideje, és hőmérséklete Antigén feltárás módja: típusa, ph, koncentrációja, (enzimes feltárás esetén), hőmérséklet, idő, gyártó Detektáló rendszer: típusa, neve, inkubálás hőmérséklete, ideje, gyártója Amplifikálás típusa: hőmérséklete, ideje, gyártója Kromogén: típusa, ideje Jelerősítés: típusa, ideje Automatizált festés: automata neve, gyártója

37 II. Analitikai standardok A protokollokat rendszeresen frissíteni kell. A SOP aktualizálására szükség van változás esetén, vagy ha új protokoll kerül bevezetésre. Továbbá, időszakos felülvizsgálat is ajánlott. 4. ajánlás: Ajánlott, hogy SOP az összes olyan információt tartalmazza, amit a BM IHC eredmények közlése során közzé tesznek Módszerek részben.

38 Posztanalitikai standardok: A külső és a belső minőség ellenőrzés jelzi, hogy az IHC vizsgálat megfelelően kalibrált. A csontvelő minták eredményének értelmezése szoros együttműködést igényel az orvos és a laboratóriumi asszisztens között. A (hemato) patológusnak ismernie kell a bonyolult csontvelő szövet feldolgozási protokollt és ismernie kell azok lehetséges hatásait az IHC eredményre. A hematopatológus képes felismerni az álnegatív vagy álpozitív festést.

39 Posztanalitikai standardok: 1. ajánlás: Minden eredményt hozzáférhetővé kell tenni (hemato) patológus számára: citológiai kenetek, molekuláris- és citogenetikai vizsgálatok. 2. ajánlás: Az eredmények értelmezése előtt a minta megfelelőségét figyelembe kell venni. A mintavétel fontosságát, körülményeit nem lehet eléggé hangsúlyozni! 3. ajánlás: Bár egy hatékony IHC technika, és segíthet felismerni a kóros sejtek akkor is, ha kis számban vannak jelen, vagy morfológiailag nem nyilvánvaló/egyértemű. A standardizáció és a kiváló BM IHC nem helyettesítheti a nem megfelelő mintavételi körülményeket. 4. ajánlás: Ajánlatos, az értékelést a külső kontroll (ok) vizsgálatával kezdeni, amellyel megállapítjuk, hogy a megfelelő antitestet alkalmaztunk, és a reakció helyesen kalibrált. 5. ajánlás: A beteg mintájának értékelése egy belső pozitív kontroll értékelésével kezdődőik, ha jelen van a mintában. Nem specifikus festődést is meg kell figyelni, ha mintában jelen van.

40

41 Köszönöm a figyelmet!