Ph.D. értekezés A Chlamydia pneumoniae okozta légúti infekció, az allergia és néhány genetikai tényezo szerepe a gyermekkori asthma bronchiale patomechanizmusában Dr Nagy Adrienne Semmelweis Egyetem Doktori Iskola A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai címu 19. sz. program Programvezeto: Dr Falus András Témavezeto: Dr Szalai Csaba Budapest, 2003. 1
TARTALOMJEGYZÉK Rövidítések..3 1. Bevezetés.4 1.1 Problémafelvetés, célkituzés...4 1.2 Betegek, módszerek...5 1.3 Vizsgálatok. 5 1.4 Várható eredmények 6 2. Irodalmi összefoglaló 6 2.1 Asthma bronchiale..6 2.2 Kemokinek az allergia és asthma bronchiale pathomechanizmusában.13 2.3 Chlamydia pneumoniae fertozés 22 2.4 Mannózköto lektin.28 3. Vizsgálatok..34 3.1 CCR5 delta 32 mutáció vizsgálata allergiás és asthmás gyermekekben 34 3.1.1 Bevezetés...34 3.1.2 Betegek és módszerek 34 3.1.3 Eredmények 37 3.1.4 Megbeszélés 40 3.2 MCP-1-2518 A/G polimorfizmus és az asthma bronchiale összefüggése..45 3.2.1 Bevezetés 45 3.2.2 Betegek és módszerek 45 3.2.3 Eredmények 48 3.2.4 Megbeszélés 55 3.3 Szérum MCP-1 vizsgálat.58 3.3.1 Bevezetés 58 3.3.2 Betegek és módszerek 58 3.3.3 Eredmények 59 3.3.4 Megbeszélés 62 3.4 Chlamydia pneumoniae infekció és az allergia kapcsolata asthmás gyermekekben és fiatal felnottekben...64 3.4.1 Bevezetés 64 3.4.2 Betegek és módszerek.65 3.4.3 Eredmények...71 3.4.4 Megbeszélés 75 3.5 A mannózköto lektin mutáció és a Chlamydia pneumoniae fertozés együttes hatása az asthmára..79 3.5.1 Bevezetés 79 3.5.2 Betegek és módszerek 80 3.5.3 Eredmények 83 3.5.4 Megbeszélés 90 4. Konklúzió.94 2
5. Összefoglalás, tézisek.97 6. Köszönetnyilvánítás 98 7. Referenciák.100 7.1 Az értekezésben idézett publikációk.100 7.2 Az értekezéssel összefüggo saját közlemények.106 7.3 Az értekezéssel összefüggo eloadások, poszterek.106 8. Ábrák és táblázatok címei...108 9. Függelék..110 9.1 Hibalehetoségek.110 9.2 Formai megjegyzések....111 10 Summary 112 3
RÖVIDÍTÉSEK AAB: allergiás asthma bronchiale BHR: bronchialis hyperreaktivitás bp: bázispár C. pneumoniae: Chlamydia pneumoniae CI: confidencia intervallum CPI: Chlamydia pneumoniae infekció EB: elemi test FEV1: forced expiratory volume in the first second: forszírozott kilégzési manovernél mért térfogat a kilégzés elso másodpercében (liter) GINA: Global Initiative for Asthma IL : interleukin K: kontroll LTC4: leukotrién C4 mediátor MASP: Mannose-binding lectin-associated factor MBL: Mannose-binding lectin (mannózköto lektin) MCP-1: Monocyte chemotactic protein-1 MIP-1alfa, béta: macrophage inflammatory protein 1 alfa, béta MOMP: major outer membran protein NAAB: nem allergiás asthma bronchiale PCR: Polymerase chain reaction (polimeráz láncreakció) PCR-RFLP: PCR és restrict fragment length polimorfism (magyarul: restrikciós fragmentum hosszúság polimorfizmus) PEF: peak expiratory flow: csúcsáramlás mérés (liter/min) RANTES: regulated on activation normal T cell expressed and secreted RB: retikuláris test Th1: T helper 1 lymphocyta Th2: T helper 2 lymphocyta TNF alfa: tumornecrosis factor alfa VA: Vegyes allergia asthma nélkül 4
1. BEVEZETÉS 1.1 PROBLÉMA FELVETÉS, CÉLKITUZÉS Az allergia és az asthma bronchiale prevalenciájának nagyfokú növekedése ma már hazai népegészségügyi, sot világméretu probléma. A szakambulanciák nagy betegforgalma sokszor az egy-egy betegre jutó ido idot csökkenti, így bizonyos differenciáldiagnosztikai lépések elmaradnak. Ilyen elkülönítendo, az asthmára hasonlító kórképek közé tartozik, a tünetszegénysége miatt sokszor nem, vagy félre diagnosztizált Chlamydia pneumoniae fertozés (CPI) is. A CPI az esetek egy részében bronchiális hyperreaktivitással jár, ebben hasonlít az asthmára. Kezelésük azonban eltéro. Klinikai munkám során feltunoen sok Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae) okozta bronchialis hyperreaktivitással találkoztam az asthmás gyermekek között. A betegek egy része célzott antibiotikus terápiára meggyógyult, másoknál életük elso CPI-ja indította el az asthmájukat. A megfelelo antibiotikus terápia klinikailag és szerológiailag is meggyógyította a fertozést, de a gyermek attól kezdve asthmás lett. A légúti kórokozók asthma exacerbációját kiváltó hatása közismert, azonban az asthma inicializálásában betöltött szerepükrol keveset tudunk. Az asthma bronchiale multifaktoriális kórkép, amelyben genetikai és környezeti tényezok és azok kölcsönhatásai játszanak szerepet. Kutatásom célja az volt, hogy választ találjak az alábbi kérdésekre. 1.1.1 Az immunrendszer egyes tagjainak (kemokin rendszer, komplement rendszer) genetikai polimorfizmusa, mutációja milyen szerepet játszik az asthma bronchiale kialakulásában? 1.1.2 Van-e olyan genetikai eltérés, amely fokozza az asthma kialakulásának esélyét? 1.1.3 Van-e olyan genetikai eltérés, amely fokozza a CPI kialkulásának esélyét? 1.1.4 Gyakoribb-e a CPI az asthmás gyermekek között, mint azoknál, akik nem asthmások? 1.1.5 Fogékonyabbak-e az asthmás gyermekek a CPI-ra, mint egészséges társaik? 1.1.6 A CPI szerepelhet-e trigger faktorként az asthma bronchiale kialakulásában, az arra genetikailag hajlamos gyermekeknél? 1.1.7 Van-e kapcsolat az allergia és a CPI között? 1.1.8 Több rizikótényezo (allergia, genetikai eltérések, CPI) együttes hatása fokozza-e az asthma kialakulásának esélyét? 1.1.9 Milyen patogenetikai kapcsolat van a CPI és az asthma bronchiale között? 5
1.2 BETEGEK ÉS MÓDSZEREK 1.2.1 A betegek és kontrollok nagy része a Budai Gyermekórház gondozottjai, kisebb részük a Heim Pál kórház és néhányan I. Gyermekklinika betegei. 1.2.2 Helyi etikai bizottságok jóváhagyták a vizsgálatokat, amelyek a betegek és szüleik felvilágosítása, önkéntes beleegyezése és aláírása után történtek. A vérvizsgálat nem jelentett külön szúrást a gyerekeknek, azt igyekeztünk egy más miatt esedékes vérvétel kibovítéseként elvégezni. 1.2.3 Módszerek 1.2.3.1 Az allergia és/vagy asthma bronchiale diagnózisát allergológus vagy pulmonológus állította fel Prick borpróba, specifikus IgE meghatározás, légzésfunkciós vizsgálatok segítségével az anamnézis és a klinikum ismeretében differenciáldiagnosztikai lépések után. 1.2.3.2 A Chlamydai pneumoniae fertozöttség kimutatását species specifikus IgA, G, M vizsgálattal, ELISA módszerel végeztük. 1.2.3.3 A genetikai vizsgálatok polimeráz láncreakcóval (PCR) és PCR-restrikciós fragmentum hosszúság polimorfizmus (PCR-RFLP) vizsgálatokkal történtek. 1.2.4 A hibalehetoségeket mérlegeltük. (Függelék 9.1) 1.2.5 A statisztikai elemzésekhez hivatalos számítógépes programokat alkalmaztunk. Mindig 95%-os confidencia intervallummal (CI) számoltunk és p< 0,05 értéket tartottuk szignifikánsnak. 1.3 VIZSGÁLATOK Öt keresztmetszeti vizsgálatot végeztünk. 1.3.1 CCR5? 32 mutáció vizsgálata allergiás és asthmás gyermekekben 1.3.2 MCP-1-2518 A/G polimorfizmus és az asthma bronchiale összefüggése 1.3.3 A szérum MCP-1 szint vizsgálata 1.3.4 A CPI és az allergia kapcsolatának vizsgálata 1.3.5 A mannózköto lektin mutációk és a CPI együttes hatásának vizsgálata. 2000 márciusa és 2003 márciusa között fokazatosan vontuk be a gyermekeket a viszgálatokba. Közben a több száz beteg ellátása zavartalanul folyt. A kontroll csoportból kiszurt CPI-s betegek gondozását is természetesen felvállaltuk. A homozigóta mutáns eseteket különös figyelemmel kísértük. 6
1.4 VÁRHATÓ EREDMÉNYEK Az asthmás és kontroll gyermekek CPI prevalenciájának ismerete fontos epidemiológiai adat és meghatározó lehet a rizikó csoport erre vonatkozó szurovizsgálatának indikációjában. A kiszurt esetek kezelése csökkentheti az álasthmások számát, így a differenciáldiagnosztikai buktatók feltárása egyben segítséget nyújthat a szakorvosi ellátásban is. A kísérletekben vizsgált genetikai markerek ma még nem részei a rutin vizsgálatoknak, de a jövoben jó prediktorai lehetnek az asthmának. A kemokin vizsgálatok eredményeitol új terápiás célpontokat remélhetünk. Végül a multifaktoriális asthma bronchiale patomechanizmusában szerepet játszó környzetei és genetikai tényezok kölcsönhatásának vizsgálatával az asthma patomechanizmusának jobb megértése, ezáltal a betegek terápiás lehetoségeinek bovülése várható. 2. IRODALMI ÖSSZEFOGLALÓ A disszertáció öt különálló kísérletét az alábbi négy témakör kapcsolja össze. Ezért a kísérletek bemutatása elott közösen 4 rövid alfejezetben tárgyalom az alábbi témákat: 2.1. Asthma bronchiale 2.2. Kemokinek az allergia, asthma patomechanizmusában 2.3. Chlamydia pneumoniae fertozés 2.4. Mannózköto lektin 2.1 ASTHMA BRONCHIALE Az asthma bronchiale definíciója a róla alkotott tudásunk bovülése folytán mostanában évtizedenként megújul. A 80-as évek elott rohamokban jelentkezo nehézlégzés volt a definíció, majd az egyre pontosabb élettani ismeretek megszerzése után bronchiális simaizom görcs, nyálkahártya ödéma, megnövekedett mennyiségu és fokozott viszkozitású nyákképzodés következményeiként jellemeztük a kórképet. A 90-es évektol, az asthma gyulladásos betegség jellegének felismerése után a meghatározás eosinophil desquamativ bronchitis. 7
A WHO 2002-es definiciója: Az asthma a légutak krónikus gyulladásos megbetegedése; a folyamat létrehozásában számos sejt és sejtproduktum játszik szerepet. A krónikus gyulladás következménye a megnövekedett légúti érzékenység, amely ismétlodo nehézlégzéses epizódokat, légzési zavart, mellkasi szorító érzést és köhögést okoz különösen éjjel vagy kora reggel. Ezekhez a tünetekhez kapcsolódik a kiterjedt, de mértékében változó légáramlási zavar, pontosabban a légáramlás beszukülése, amely részben spontán, részben kezelés hatására szunik meg. (1, 2) Valószínuleg ez sem az utolsó definíció. 2.1.1 Epidemiológia A gyermekkori asthma gyakorisága a nemzetközi irodalom adatai szerint valószínutlenül szélsoséges; 1,6-36, 8%-ig terjed (kérdoíves felmérés). Magyarországi adatokról, amelyek bár kisebb szórást mutatnak, és nem fedik le az ország minden régióját, elmondható, hogy a gyermekkori asthma prevalenciája 2-5 % (orvosi vizsgálaton alapuló felmérés) (3,4). 2.1.2 Etiológia Az asthma bronchiale multifaktoriális kórkép, amelyben genetikai prediszpozíció és környezeti tényezok kölcsönhatásai manifesztálják a típusos tüneteket. Ma már több, mint 500 genetikai lókuszt hoztak összefüggésbe az asthmával és az allergiával (5,6) (1. táblázat). A környezeti tényezok között gyermekkorban kiemelt szerepe van az indoor és outdoor légúti, valamint a nutritív allergéneknek és a vírusinfekcióknak. A környezetszennyezés, dohányzás, aspirin szerepe a betegség ritkább kiváltó okai között szerepelnek ebben az életkorban. A gyermekkori asthma közel 80%-a allergiás típusú, vagyis az allergia in vivo vagy in vitro kimutatható. Körülbelül 20%-uk u.n. nem-allergiás asthma, amelyben allergia nem igazolható, gyakran fizikai terhelés vagy légúti infekció provokálja a tüneteket (7). 2.1.3 Patomechanizmus Az asthma patomechanizmusa rendkívül összetett, ezért csak vázlatszeruen foglalom össze. 2.1.3.1 hízósejt degranuláció A légúti kötoszövetben, a lamina propriában nagyszámú mastoycta található. 8
A hízósejtben levo preformált mediátorok (pl.hisztamin), proteázok, preformált citokinek, kiszabadulását számos inger idézheti elo. Ilyen az IgE-IgE bridging, amelyet antigén/allergén, autoantitest, is eloidézhet, amely típusos azonnali allergiás reakcióhoz vezet. Degranulációt okoz az antigén IgG-4-hez való kapcsolódása is a hízósejt 1. Táblázat Az allergiás/asthmás megbetegedésekkel kapcsoltságot mutató legfontosabb jelölt gének kromoszómalokalizációja és feltételezett funkciója (a teljesség igénye nélkül) Kromoszóma Jelölt gének Feltételezet funkció Fenotípus régió 2q IL-1 géncsalád Gyulladásos válasz befolyásolása Asthma bronchiale (AB) 5q31-q33 IL-4, IL-13 B sejtek átkapcsolása IgE termelésre Emelkedett IgE, GM -CSF Th2 válasz kiváltása AB IL-5 Eosinophil sejtek felszabadítása a csontvelobol, eotaxin termelés fokozás AB BHR CD14 Bakteriális LPS-köto receptor Emelkedet IgE 6p21.3 HLA -D Antigénbemutatás Specifikus IgE, IgG antitestek TNF alfa Gyulladásos válasz közvetítése AB 11q13 7q31 CFTR Tüdoben transzmembrán kloridioncsatorna Fc-epszilon- RI-béta Nagy affinitású IgE receptor basophil, dendritikus, és hízósejteken Allergiás bronchopulmo - nális aspergillosis és cisztás fibrózis Atópia AB Anyai öröklés CC16 Légúti gyulladás szabályozása AB 12q14.3-q24.31 IFN-gamma IL-4 gátlás AB SCF IL-4 termelés STAT6 Esszenciális citokinregulált transzkripciós faktor Atópia NFY-béta IL-4 és HLA -D gének transzkripcióját növeli össz-ige NNOS NO vasodilatator és légúti gyulladási AB regulátor 14q11.2-q13 T sejt receptor alfa és béta MHC-peptid-komplexekkel lép kölcsönhatásba Specifikus IgE antitestek 16p21 IL-4R IL-4 receptora Atópia, AB 17q11.2 RANTES, MCP-1, eotaxin Kemokin funkció (kemotaxis, aktiváció) AB, AEDS 20p13 ADAM33 Adhézió, jelátvitel, proteolízis AB, remodelling Lábjegyzet: AB: asthma bronchiale, BHR: bronchiális hyperreaktivitás, AEDS: atópiás, ekcéma betegség syndróma, LPS: lipopoliszacharid, RANTES: rergulated on activated normal T cell expressed and secreted, MCP-1: monocyte chemotactic protein-1 9
felszínén, valamint az anafilatoxinok (C3a, C5a), béta-adrenerg receptor hiány, vagy gátlás is. A kiszabaduló mediátorok hatására a tüdoben simaizom görcs, nyálkahártya ödéma jelentkezik, fokozott mennyiségu és tapadós váladék képzodik. A sejtmembránban újonnan szintetizálódó foszfolipid- arachidonsav kaszkád végtermékei - a prosztaglandinok és leukotriének - szintén ez elozo élettani folyamathoz vezetnek. 2.1.3.2 adrenerg út A béta 2 receptor ingerlése a camp fokozott termelodése révén a Ca pumpát aktiválja, ennek következtében az intracelluláris (IC) Ca ++ csökken és bronchodilatatio jön létre. Ezért a béta 2 receptor blokkolása, hiánya bronchoconstrictiót vált ki. 2.1.3.3 cholinerg út A cholinerg/muscarin receptor ingerlése a cgmp aktivációja révén a Ca ++ pumpafunkciót csökkenti következményes IC Ca ++ felszaporodással, amely bronchoconstrictiót okoz. Az adrenerg és cholinerg rendszer egyensúlyi zavara is részt vesz az asthma kialakulásában. 2.1.3.4 non-adrenerg, non-cholinerg (NANC) út A NANC rendszer serkento és gátló hatásával fontos eleme a betegségnek. A serkento hatás az u.n. axon reflexnek tulajdonítható. Az axon reflex egy különleges idegroston valósul meg, amely egyszerre érzo afferens és efferens funkciójú. A myelin hüvely nélküli idegszál varicositásaiból kiszabaduló neuropeptidek lokális gyulladást okoznak. A desquamált bronchialis epithél esetén a szabaddá váló idegvégzodések könnyen ingerelhetoek, amelynek következménye a bronchus simaizom kontrakció, az ér permeabilitás fokozódás miatti helyi ödéma és a fokozott nyákszekréció. A NANC út gátló része a konstitutív nitrogén oxidáz által termelodo nitrogén monoxid (NO) révén vezet bronchodilatátióhoz. Ha a NO-t az indukálható nitrogén oxidáz révén szintetizálja a makrofág vagy az epithél sejt, akkor bronchoconstrictió jön létre. Ezért a NO patogenetikai hatása kétarcú. 2.1.3.5 T helper 1/T helper 2 ( Th1/Th2) egyensúly zavar A gyermekkori asthma nagy részében Th2 dominancia figyelheto meg. A Th2 típusú citokinek közül az interleukin-4 (IL-4) szerepe kiemelt a B sejtek IgE termelésre kifejtett hatása miatt. Az IL-5 az eosinophil sejtek csontvelobol való kiáramlásában és aktiválásában fontos tényezo. Granulumaikból kiszabaduló fehérjék toxikusak a környezo epithelsejtekre, azokat desquamálják. A szintén Th2 típusú IL-13-nak a nyákszekréció fokozásában van szerepe. 10
2.1.3.6 Az effektor immunsejtek toborzásában és aktiválásában számos u.n. kemokin molekula és receptoraik vesznek részt. Az allergiás mechanizmusban például az eotaxin, a regulated on activation normal T cell expressed and secreted (RANTES) és a monocyte-chemotactic protein-1 (MCP-1) molekuláknak van kiemelt szerepe. Ezeknek a kemokineknek vagy receptorainak mutációi, polimorfizmusai hatással lehetnek az asthma fenotípusára. 2.1.3.7 A krónikus légúti gyulladás irreverzibilis strukturális és funkcionális károsodáshoz - airways remodelling -hez vezethet már gyermekkorban is. 2.1.3.8 Itt nem részletezett sokasága a citokineknek és növekedési faktoroknak modulálják az asthmában szereplo sejtes és humorális immunfolyamatokat. 2.1.4 Stádiumok A klinikai tünetek gyakorisága és a légzésfunkció értékek beszukülése valamint a reggeli, esti csúcsáramlás variabilitásának mértéke alapján 4 stádiumra, lépcsore osztjuk az asthmás betegeket, amely beosztás egyben a terápiás sémákat is meghatározza (1,2) (1.a ábra). 2.1.5 Differenciáldiagnosztika Az asthmához hasonló tüneteket több más kórkép is okozhat. Az idegentest, fejlodési rendellenességek, térszukíto folyamatok, infekciók, gastrooesophagealis reflux, ciliáris diszfunkció, cisztás fibrózis, immunhiány, alfa-1 antitripszin hiány, pszichés betegségek, stb. kizárása szakorvosi feladat. 2.1.6 Terápia A terápia elvei; a tartós tünetmentesség és az életminoség javításának elérése lehetoség szerint lokálisan alkalmazható készítményekkel, a stádiumnak megfelelo terápia alkalmazása. A rohamokat inhalatív rövid hatású béta 2 mimetikumokkal vagy anticholinerg szerekkel oldjuk. A gyulladást inhalatív corticosteroiddal kezeljük, amelyhez stádiumtól függoen adjuváns szereket is adhatunk (hosszú hatású béta 2 mimetikum, leukotrién antagonista, hosszú hatású theophyllin származékok). A 4. lépcsobe ritkán kerülo gyermekeknek per os steroidra is szükségük lehet (1.b ábra ). 11
1. A ábra Intermittáló < 1-2 tünet/hét < 2 éj.tü /hó Rövid exacerbációk FEV1, PEF > 80% Variabilitás < 20% Enyhe perzisztáló > 2 tünet/hét > 2 éj.tü /hó Exacerbációk zavarják az aktivitást és az álmot FEV1, PEF: 80% Variabilitás: 20-30% Mérsékelt perzisztáló Napi tünetek 1-2 éj.tü / hét Napi rövid hatású béta 2 mimetikum igény FEV1, PEF: 60-80% Variabilitás> 30% Súlyos perzisztáló Napi tünetek Gyakori éjszakai tünetek Gyakori exacerbációk Testi aktivitás beszukült FEV1, PEF < 60% Variabilitás > 30% Az asthma bronchiale súlyossági lépcsoi Lábjegyzet: éj. tü.: éjszakai tünetek FEV1: Forszírozott kilégzési volumen a kilégzés elso másodpercében (liter) PEF: Csúcsáramlás (liter/perc) Variabilitás: reggeli és esti FEV1 vagy PEF értékek ingadozása a reggeli értékek rovására (%) Forrás: (1) Global Strategy for Asthma Management and Prevention, NHLB/WHO. Workshop report: Global Initiative for Asthma. National Institute of Health, National Heart, Lung and Blood Institute, Pub. No:95-3659, Bethesda, MD. 1995. (2) Global Strategy for Asthma Management and Prevention, updated April, 2002. Scientific information and recommendation for asthma program. NIH Publication No. 02-3659 12
1. B ábra Az asthma bronchiale lépcsozetes terápiája Intermittáló Enyhe perzisztáló Mérsékelt perzisztáló Súlyos perzisztáló TP: > 800 µg ICS TP: 400-800 µg ICS + szükség szerint LABA/LTRA/ LATH TP: 100-400 µg ICS + szükség szerint: LTRA/LATH esetleg: cromon + szükség szerint LABA/LTRA/ LATH RO: SABA RO: SABA RO: SABA RO: SABA Lábjegyzet: RO: rohamoldó, TP: tartós prevenció, ICS: inhalatív corticosteroid, SABA: rövid hatású béta 2 agonista, LABA: hosszú hatású béta 2 agonista, LTRA: leukotrién receptor antagonista, LATH: hosszú hatású theophyllin, PCS: per os corticosteroid Forrás: (1) Global Strategy for Asthma Management and Prevention, NHLB/WHO. Workshop report: Global Initiative for Asthma. National Institute of Health, National Heart, Lung and Blood Institute, Pub. No:95-3659, Bethesda, MD. 1995. (2) Global Strategy for Asthma Management and Prevention, updated April, 2002. Scientific information and recommendation for asthma program. NIH Publication No. 02-3659 13
2.2 KEMOKINEK AZ ALLERGIA ÉS ASTHMA PATOMECHANIZMUSÁBAN A szervezetünket különbözo gyulladást provokáló triggerek érik (infekció, trauma, tumor, allergén, autoantigén, stb). A károsodás leküzdésére hivatott effektor immunsejtek helyszínre áramlását adhéziós molekulák, kemotaktikus anyagok segítik. Kemotaktikus hatásúak az IL-8, PAF (vérlemezke aktiváló faktor), neutrofil granulocytákból származó bizonyos peptidek, bakteriális termékek (formil-methioninleucin-fenilalanin), bizonyos enzimek (makrofág proteáz), és a különleges tulajdonságokkal is bíró kemokin család is. A kemokinek 8-10 kd súlyú, kb. 70-80 aminósavból álló heparinköto polipeptidek. A citokinekhez hasonlóan kis koncentrációban is nagy hatás elérésére képesek autokrin, parakrin módon. Rövid életidejuek, redundánsok és pleiotrópok. Nem csak kemotaxist indukálnak, hanem a fehérvérsejtek egy-egy alcsoportját specifikusan aktiválni is képesek. Szerkezetükre jellemzo, hogy a visszakunkorodó polipeptidláncon egymással szembe kerülo cisztein molekulák között diszulfidhidak stabilizálják a molekulát. Általában 2-2 cisztein között kialakult diszulfid híd jellemzi a kemokineket. Ezen érintett ciszteinek egymáshoz való távolsága alapján osztályozzák oket. A C-kemokin csak egy cisztein párt tartalmaz, a CC-kemokinekben egymás mellett vannak a hídképzo ciszteinek, a CXCkemokineknél egy, CX3C-nél 3 beékelodo aminósav választja el a közeli ciszteinhidakat. A humán kemokin csoportok között 20-50%-os homológia fedezheto fel. A csoportazonos kemokinek génjei egy kromoszómán fordulnak elo. Az allergiás folyamatokban elsosorban a 17-es kromoszómáról eredo CC-kemokinek vesznek részt. Monocyták, fibroblasztok, epithél sejtek, simaizomsejtek, endothél sejtek, glióma és melanóma sejtek termelik oket. Az eddig ismert kb. 40 kemokin közül legalább10 CC-kemokin, de a sor egyre bovül. 1. Monocyta chemotactic protein-1 (MCP-1) 2. MCP-2 3. MCP-3 4. MCP-4 5. Macrophag inflammatory protein -1 alfa (MIP-1alfa) 6. MIP-1béta 7. Regulated on activation normal T cell expressed and secreted (RANTES) 8. Eotaxin-1 9. Eotaxin-2 10. I-309 14
A CC-kemokinek olyan sejtekre hatnak, amelyek CCR receptorral rendelkeznek és az allergiás mechanizmusban fontos szerepet töltenek be (2., 3 táblázat). Az endothél sejtek felszínén egyes glükóz-aminoglikánok (GAG), például az ágas-bogas szerkezetu hepránszulfát-proteoglikán expresszálódik, amelyek a heparin köto domménnel rendelkezo kemokineket megkötik és az állandó véráramlás ellenére egy koncentráció grádienst képesek eloidézni. A heparánszulfát-bozótokban felgyülemlett kemokinek a megfelelo kemokinreceptorral rendelkezo fehérvérsejt alcsoportokat magukhoz, illetve az endothélhez kötik, így az effektor immunsejtek transendotheliális migrációjának megindításában fontos szerepet töltenek be. A kemokinreceptorok 7 transzmemrán doménbol álló, úgynevezett szerpentinreceptor családba tartoznak. A receptor extracelluláris aminoterminális szakasza köti a kemokineket, míg azok másik karboxiterminális részén levo heparinköto domének tapadnak a GAG-hoz. A kemokinreceptorok jelátvitele jellemzoen G-proteinhez-kapcsolt folyamat. A jelátviteli mechanizmusban itt nem részletezet enzimatikus kaszkád végeredményeként a cytoskeleton átrendezodik, aktinja polimerizálódik és a kemotaxishoz szükséges elmozdulás létrejöhet (8). Egy kemokin receptoron többféle kemokin kötodhet és egy kemokin többfajta receptorhoz is mutat affinitást. (2-5 ábrák). Egyes vírusok, intracelluláris kórokozók a gazdasejtet teljesen új receptorok expressziójára késztetik, amelyek ismert kemokineket is képesek kötni. (Például a Cytomegalovírus egy US28 nevu receptort expresszáltat a gazdasejttel, amely RANTES-t, MCP-1-t, MIP-1alfát jóval nagyobb affinitással köt, mint a nem fertozött sejten megjeleno klasszikus CCreceptor). A mikroorganizmusok ilyen rafinált módon is bekapcsolódnak az immunfolyamatokba. A kemokinek fo funkciója az effektor sejtek transendotheliális migrációjának elokészítése és végrehajtása részben az adhéziós molekulák kapcsolódásának elosegítése, részben a kemotaxisra bírt molekulák aktiválása révén. Így részt vesznek a pathogének elleni küzdelemben, a leukocyták aktiválásában, immunsejtek érésében, Th1/Th2 egyensúly alakításában, a gyulladásos folyamatokban, sot az angiogenezisben, sebgyógyulásban, a haemopoezisben, a metasztázis képzésben is. A krónikus allergiás gyulladásban, az allergiás asthmában a peribronchiálisan felszaporodó eosinophil sejtekért is az eosinophilekre kemoattraktáns RANTES, eotaxin, MCP-3, stb. 15
2. táblázat A CC-kemokinek és célsejtjeik CC-kemokin Célsejt MCP-1 Mo, T, Ma, Ba, O MCP-2 Mo, T, Ma, Eo MCP-3 Mo, T, Ma, Eo, D MCP-4 Mo, T, Eo MIP-1 alfa Mo, T, B, NK, Ma, Ba, D, O MIP -1 béta Mo, T, O RANTES Mo, T, NK, Eo, Ba, D Eotaxin-1 Eo, Ba, Ma, Th2 Eotaxin-2 Eo I-309 Mo Mo: monocyta, Eo: eosinophil, Ba: basophil, T: T-sejt, Th2: T helper 2, B: B-sejt, D: dendritikus sejt, Ma: mastocyta (hízósejt), NK: NK-sejt, O: ossejt Forrás: (8) Kohidai László, Dérfalvi Beáta. Egy újonnan felfedezett molekulacsalád. A kemokinek. Lege Artis Medicinae 2000; 10 (9): 666-678 16
3. Táblázat A CC-kemokin receptorok (CCR) és ligandjaik és a receptort expreszáló sejtek CCR Ligand Sejt CCR1 MIP-1alfa, MIP-1beta, RANTES, MCP-1, -2, -3 Monocyta (Mo), eosinophil (Eo) CCR2 MCP-1, -2, -3, -4, -5 mo CCR3 Eotaxin-1, -2, RANTES, MIP-1alfa,- béta Eo, Mo Basophil (Ba) CCR4 MCP-1, MIP -1alfa, RANTES Mo CCR5 MIP-1 alfa, -béta, RANTES Mo, T-sejt (T) CCR6 MIP-3 béta Dendritikus sejt (D) CCR7 MIP -3béta Aktivált T CCR8 I-309 Mo Forrás: (8) Kohidai László, Dérfalvi Beáta. Egy újonnan felfedezett molekulacsalád. A kemokinek. Lege Artis Medicinae 2000; 10 (9): 666-678 17
2. Ábra A kemokinek több kemokin receptorra kapcsolódnak és egy kemokin receptor több kemokin megkötésére is képes MIP 5 MIP 1? HCC 2 MIP 1? MIP 1? MCP 2 MCP 1 CCR 5 CCR 1 CCR 2 EOTAXIN RANTES CCR 3 MCP 3 CCR 10 MCP 4 Eo, Ba, Th 2, Mast Lábjegyzet: MIP: macrophag inflammatory protein RANTES: regulated on activated normal T cell expressed and secreted MCP: monocyte chemotactic protein CCR: CC-kemokin köto receptor 18
3. Ábra Az eosinophil sejten megjeleno kemokin receptorok és ligadjaik RANTES MCP 3 MCP 4 EOTAXIN CCR 3 IP - 10 MIG CXCR3 Eo CCR 2 MCP 1, 2, 3, 4 CCR 4 CCR 1 RANTES MIP 1? MDC MIP 5 HCC 2 MCP 2, 3 Lábjegyzet: MIP: macrophag inflammatory protein RANTES: regulated on activated normal T cell expressed and secreted MCP: monocyte chemotactic protein CCR: CC-kemokin köto receptor MDC: Alveoláris makrofág eredetu kemokin 19
4. Ábra A CCR3 receptort expresszáló sejt típusától függ az eotaxin hatása EOTAXIN CCR 3 Eo kemotaxis toxikus fehérjék degranulációja respiratory burst beindítása EOTAXIN CCR 3 Ba kemotaxis histamin release LT képzés EOTAXIN CCR 3 Mast hízósejt érés kemotaxis histamin degranuláció EOTAXIN CCR 3 Th 2 migráció Th 2 típusú citokin termelés Lábjegyzet: Mast: hízósejt Eo: eosinophil sejt Ba: basophil sejt Th2: T helper 2 lymphocyta 20
5. Ábra Az eotaxin és MDC direkt és indirekt hatása az eosinophil sejtre EOTAXIN CCR 3 CCR 3 Eo CCR4 Th 2 CCR 4 MDC IL 5 Lábjegyzet: CCR3 és CCR4 receptort hordoz az eosinophil (eo) és a T helper 2 (Th2) sejt is. Az eotaxin és a makrofág eredetu kemokin (MDC) direkt aktiválja az eosinophil sejtet, míg ugyanezek a kemokinek a Th2 sejt aktivációja során keletkezo IL-5 citokin hatás miatt indirekt módon aktíválják az eosinophil sejtet 21
tehetoek felelossé. Allergén provokáció után allergiás rhinitisben és atópiás dermatitisben emelkedik az epitheliumban az eotaxin és MCP koncentráció (9). Szinte mindegyik szervrendszerünket érinto krónikus vagy autoimmun gyulladásos folyamatában részt vesznek kemokinek. A jövoben a kemokin-kemokinreceptor célpontú terápiára nagy várakozással tekintünk. Részletesebben az MCP-1 és az allergia, asthma kapcsolatát elemzem, tekintettel arra, hogy ennek a kemokinnek a polimorfizmusát és szérumszintjét vizsgáltam. Az MCP-1-et olyan sejtek termelik és MCP-1 receptort (CCR2)-t olyan sejtek expresszálnak, amelyek fontos résztvevoi az allergiás gyulladásnak. MCP-1-et szintetizál például a monocyta, eosinophil sejt, hízósejt, légúti simaizomsejt. CCR2 receptorral rendelkezik és így MCP-1 kötésre alkalmas az eosinophil sejt, légúti simaizomsejt, monocyta, T lymphocyta. Az MCP-1 asthmával való összefüggését több tanulmány is alátámasztotta. Hízósejt aktíváló és leukotrién C4 (LTC4) szintézist serkento hatása révén direkt bronchiális hyperreaktivitást (BHR) okoz. Svábbogárral érzékenyített egérben az MCP-1 bronchialis hyperreaktivitást okoz (10). Az MCP-1 neutralizációja viszont a T lymphocyták és eosinophil sejtek tüdobe való infiltrációját és a BHR-t csökkenti (11). Az asthmások bronchiális epithel sejtjeinek több, mint 50%-a MCP-1 et expresszál, szemben az egészségesek bronchalis epitheljeiben levo alig 8%-kal (12). Az MCP-1 nem csupán az asthma pathogenezisében fontos sejtek toborzásában és akiválásában vesz részt, hanem a Th0 sejtek érését, az allergiás gyulladásban kulcsfontosságú Th2 irányba billenti (13). Th2 sejtek által secretált IL-4 a B sejtek IgE expresszióját növeli, az IL-5 pedig az eosinophilek csontvelobol való fokozott kilépését, érését segíti (14,15,16). A MCP-1 asthmában való kiemelt szerepe miatt az MCP-1-2518A/G polimorfizmus és az asthma bronchiale összefüggése és a Szérum MCP-1 vizsgálat címu fejezetekben részletesen foglalkozom a témával. 22
2.3 CHLAMYDIA PNEUMONIAE FERTOZÉS A Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae) Gram negatív, obligát, intracelluláris patogén. Elemi test (EB) és retikuláris test (RB) formában él különleges életciklussal. Úgynevezett energia parazita. Négy fo sejtfelszíni fehérjéjébol kettot használ a megtámadott sejten való megtapadáshoz. Az extracelluláris túléléshez adaptálódott EB-k endocitózis útján jutnak sejtbe, ahol anyagcsere-folyamatokra és szaporodásra képes RB-ké válnak. A gazdasejt energiarendszerét használva, osztódásal szaporodnak, kitöltik a teljes citoplazmát, elpusztítva vele a sejtet. Ez a fejlodési ciklus 48-72 órát vesz igénybe. Kiszabadulva az elhalt sejtbol ismét EB-k formájában fertozik a szomszédos sejteket, vagy felszívódva a keringésbe jutnak és távoli helyeken fertoznek. 6. ábra 1985-ben fedezte fel Grayston és C. TWAR-nak nevezte el a két elso izolátum TW183 és AR29 törzsek betujelzéseinek összevonásával. Csak néhány évvel késobb derült ki, hogy Chlamydiáról van szó (17). Jelenleg 4 Chlamydia speciest ismerünk. A C. pneumoniae-t, mely elsosorban humán légúti kórképeket okoz (otitis, pharyngitis, bronchitis, pneumonia, asthma bronchiale?), valamint összefügghet az arteriosclerosissal, carditissel, hasmenéssel, hepatitissel, Guillen-Barré syndroma encephalitissel, sarcoidosissal. A C. trachomatist, amelyrol a trachomát, újszülöttek zárványtestes conjunctivitisét, újszülöttkori pneumoniát, genitalis infekciókat, kismedencei gyulladást, habituális abortuszt, noi, férfi sterilitást, reaktív arthritist okozó hatást írtak le. A C. psittaci állatról emberre terjedo, széklettel aerogén úton fertozo, többnyire foglalkozási, légúti betegséget okozó kórokozó. Bizonyos carditisek, nephritisek, thyreoiditis, erythema, tinnitus, sarcoidosis, anaemia, DIC, faciális paresis, meningitis, encephalitis, diarrhoea etiológiájaként is szerepelt már (18). A negyedik, a C. pecorum állatok között fertoz. A C. pneumoniae csak emberrol emberre, aerogén úton terjed. Az inkubációs ideje 7-23 nap. Két-három évente, kb. fél évig tartó kisebb járványok fordulnak elo elsosorban a közösségbe járó gyermekeknél, azok közül is inkább az általános iskolás korosztálynál. Csak minden 9-10. C. pneumoniae infekció (CPI)-ból lesz C. pneumonia okozta pneumonia. Az összes pneumoniák között 5-10%-ot foglalnak el a C. pneumonia okozta pneumoniák. A CPI prevalenciája a magyar gyermekpopulációban magas (19). 2.3.1 A C. pneumoniae fertozés klinikuma A betegség spektruma a tünetmentestol az életet veszélyeztetoig terjedhet, de a tünetmentes, vagy enyhe tüneteket okozó, többnyire fel nem ismert forma a leggyakoribb. 23
6. ábra A Chlamydiák különleges életciklusa EB: elemi testek RB: retikuláris testek (Forrás: www. chlamydiae.com) 24
A fertozés tünetei lehetnek: köhögés, hoemelkedés, fáradékonyság, fejfájás, fénykerülés, izom-és izületi fájdalom, nehézlégzés, sípolás, megnyúlt kilégzés. Köpet, pleurális fájdalom nem jellemzo. Sajnos nincsen olyan tünetcsoport, amely a C. pneumoniae-ra patognomikus lenne. Leginkább a jó állapotú, hosszabb ideje légúti tüneteket mutató gyermekeknél kell gondolni rá. Különbözo etiológiájú, akut légúti betegségekben a kezdeti tünetektol az orvosi vizsgálatig eltelt ido a C. pneumoniae fertozés esetén a leghosszabb (20). A klinikai diagnózis felállítását nehezíti a szegényes tüdo hallgatózási lelet is. Amennyiben bronchiális hyperreaktivitással társul, a megnyúlt kilégzés, csökkent PEF és FEV1 értékek mérése - az asthma bronchiale-ra való hasonlósága - megtévesztheti az orvost. A tünetek néhány héttol több hónapig is tarthatnak. Csak átmeneti védettség alakul ki a betegség kiállása után, így több reinfekció is elofordulhat egy egyén élete során. A lakosság átfertozodése tehát életkorral no. Szerencsére spontán gyógyulásra hajlamos, azonban a perzisztáló infekció évekig is elhúzódhat (21). 2.3.2 A C. pneumoniae fertozés laboratóriumi diagnosztikája: 2.3.2.1 A kórokozó direkt kimutatása immunfluoreszcens (IF) mikroszkóppal, sejtkultúrán való tenyésztéssel és/vagy DNS-ének kimutatása polimeráz láncreakcióval (PCR) nem rutin eljárások és a légutakban ahol tünetmentesen is elofordulhat a kórokozó - önmagukban nem diagnosztikusak. 2.3.2.2 Szerológiai vizsgálatok A species specifikus (spec.) immunfluoreszcencia (IF), ELISA és a genus specifikus komplementkötési reakció a legismertebbek. Az akut infekció kritériuma Grayson szerint: IF esetén: a spec. IgM> 1:16, spec. IgG (savópár) 4x-es titeremelkedés vagy spec. IgG >1:512 Régi infekció: spec. IgG > 1:256 ELISA-nál: Az egyes tesztek határérték kontrolljai (cut-off) szabják meg, hogy milyen értéktol tekintik pozitívnak az adott ellenanyag szintjét. Általános szabály: magas spec. IgM: friss infekcióra, tartósan pozitív spec. IgA: perzisztáló fertozésre, magas spec. IgG, negatív spec. IgM és spec. IgA mellett: régi, lezajlott fertozésre utal. Reinfectió esetén a spec. IgM megjelenése már nem jellemzo. 25
A szerológiai vizsgálatok (legelterjedtebb az ELISA) jelentik a fo diagnosztikus támpontot a gyakorlat számára. Lehetoség szerint savópárt vizsgáljunk. A konkrét ellenanyagszintek finom összehasonlítása helyett a változások dinamikáját figyeljük! Tudnunk kell azonban, hogy az ellenanyagok szintjének csökkenése lassan, hónapokig, akár évekig (IgG) is eltarthat. A korrekt diagnózis természetesen csak a klinikummal együtt állítható fel. 2.3.3 C. pneumoniae fertozés radiológiai diagnosztikája Jellegzetes radiológai eltérés nincsen. Általában finom foltos, intersticiális beszurodés, peribronchiális rajzolatfokozódás látható. Az eltérés gyakran enyhe és centrális elhelyezkedésu, ami a hallgatózási lelet szegényességét magyarázza. 2.3.4 C. pneumoniae fertozés terápiája, gondozása Gyermekkorban makrolid antibiotikummal kezeljük. Amennyiben az infekció bronchiális hyperreaktivitással jár, vagy a betegnek asthmája is van és theophyllin készítményre is szorul, akkor olyan, a citokróm P450 enzim rendszerre nem ható, makrolid antibiotikumot válasszunk, amelyik nem emeli a szérum theophyllinszintet. Az atípusos pneumonián átesett betegeket ill. a perzisztáló fertozésben szenvedoket hosszan kell gondozni. Különös figyelmet érdemelnek a bronchialis hyperreaktivitás tünetét mutató betegek, mert náluk az asthma kialakulása rizikótényezo lehet. Rendszeres légzésfunkciós vizsgálat, szükség esetén, átmenetileg tartós prevenciós asthma kezelés (inhalatív corticosteroid) is indokolt lehet, amelyet gyermekpulmonológusok, allergológusok hivatottak beállítani. A háziorvos felelossége, hogy ezek a betegek szakorvosi gondozás alá kerüljenek. Az asthmásokal foglalkozó szakorvosok figyelmét pedig a klinkailag és légzésfunkciós vizsgálattal igazolt bronchialis hyperreaktivitás esetén - az atípusos kórokozókra való szurés jelentoségére kell felhívni, lehetoleg még az asthma diagnózisának kimondása elott. A pozitív esetek gondozására akár egy-két évig is szükség lehet (22). 2.3.5 C. pneumoniae biológiája A kórokozó (EB) cseppfertozéssel jut a légutakba, ahol az alveoláris makrofágokba, dendritikus sejtekbe és epithél sejtekbe különbözo sejtfelszíni molekulák segítségével (hepránszulfát, mannóz receptor, CD14, vagy Fc mediált úton) endocitózissal jut be (7. ábra). A gazdasejt jelátviteli faktorait és bizonyos citokin expresszióját oly módon befolyásolja, hogy ezáltal a gazdasejt MHC-I és MHC-II expressziója csökken, gyengül a 26
7. ábra A Chlamydia pneumoniae elemi testek bejutási módjai a sejtbe Heparánszulfát Fc-mediált Mannóz receptor LPS receptor (CD14) Gazdasejt (Forrás: D. Rockey 2002. Antalya, X. Nemzetközi Chlamydia Kongresszusi eloadás) 27
kórokozó (ily módon is történo) antigénprezentációja a gazdasejt felszínén. Így megszökve az eroteljes immunválasz elol, sokáig perzisztálhat rejtekhelyén, a sejtben (23,24,25). Kísérletekben bizonyították, hogy a C. pneumoniae-val fertozött humán köldökzsinór véna endothél sejtekben (HUVEC) olyan kemotaktikus anyagok: Interleukin-8 és monocyta chemotactic protein-1, (IL-8, MCP-1) expressziója fokozódik, amelyek a neutrofil és monocyta sejtek transendotheliális migrációjában, helyi gyulladás kialakításában töltenek be fontos szerepet. Mindez nem volt igaz a Chlamydia trachomatis esetében (26,27). A fokozottan expresszált MCP-1 pont azokon a CCR2+ sejteken fejti ki hatását (kemotaxis és aktiválás), amely sejtek kulcsfontosságúak (monocyta, eosinophil, T sejtek, légúti simaizomsejt) az asthma patogenezisében. Sousa ki is mutatta, hogy az asthmás betegek bronchialis epithél sejtjeinek 50%-a MCP-1-et expresszál az egészségesek bronchialis epithél sejtjeinek 8%-os MCP-1 expressziójával szemben (12). A logikusan felmerülo hipotézis, miszerint a Chlamydia pneumoniae fertozés az MCP-1 expresszió fokozásán keresztül asthmát okoz, még bizonyítást igényel. A kardiovaszkuláris tudományos kísérletek sok elgondolkodtató eredményt hoztak az asthmával foglalkozók számára is. Például a HUVEC C. pneumoniae fertozése egy olyan solubilis faktor expresszióját is fokozza, amely a közeli simaizomsejtek számát és méretét növeli (28). Ugyanez a fertozés adheziós molekulák expresszióját is növeli HUVEC-en. A vascularis sejt adhéziós molekula (VCAM-1), intracelluláris adhéziós molekula (ICAM-1), E selectin, és endothel-leukocyta adhéziós molekula (ELAM-1) expressziója no (29). Mindkét munkacsoport az eredményeit az atherosclerosis patogenezisére vonatkoztatta. Azonban feltételezhetjük, hogy ilyen, vagy nagyon hasonló folyamatok játszódhatnak le az asthma során is. Ugyanezeket a vizsgálatokat bronchialis epithel sejteken is érdemes lenne reprodukálni. További asszociációra késztet az a megfigyelés, hogy a humán atherómában kimutatott 60 kilodalton súlyú, Chlamydia eredetu hosokkfehérje (chsp 60) a proinflammatórikus tumor necrosis factor-alfa (TNF-alfa) termelést fokozza (30). Ugyanez a TNF-alfa a hörgokben bronchialis hyperreaktivitást okoz (31). Ezek az irodalmi adatok is megerosítettek abban, hogy a C. pneumoniae és az asthma kapcsolatát vizsgáljam. 28
2.4 MANNÓZKÖTO LEKTIN (MBL) A kórokozó szervezetbe jutásakor a természetes, nem fajlagos immunválasz azonnal muködésbe lép. A mikroorganizmusok felszínén levo jellegzetes többnyire szénhidrátokból vagy lipidekbol álló - molekulamintázatot, az u.n. Pathogen Associated Molecular Pattern (PAMP) t a természetes immunrendszer bizonyos sejtfelszíni receptorai az u.n. Pathogen Recognition Receptors (PRR) valamint szolubilis mintázat azonosító fehérjék; Pathogen Recognition Molekules (PRM) ismerik fel. Az elsosorban makrofágokon, dendritikus sejteken megjeleno PRR: a mannóz receptor, scavenger receptor, lipopoliszacharid (LPS) receptor (CD14) és a komplement rendszer néhány receptora; CR1, CR2, CR3. A solubilis PRM k közé tartozik a C-reaktív protein (CRP), az MBL, a lipopoliszacharidköto fehérje (LBP) és az amiloid protein (32). Az MBL is egy mannóz felismero solubilis fehérje, amely a kollektinek csoportjába tartozik a lung surfactant protein A, D (L-SP-A, L-SP-D)-vel és a konglutininnal együtt. Közös jellemzojük, hogy kollagén és lektin részeket tartalmaznak. Lektin részükkel mikroorganizmusok felszínén levo szénhidrátokhoz, kollagén részükkel a C1q-hoz való szerkezeti hasonlóságuk alapján - a C1qR-hoz tudnak kötodni. A C1q-nak nincs szénhidrátköto domenje. Az MBL a májban termelodo, szérum akut fázis fehérje. A természetes immunvédekezés szolubilis eleme. Dimer, trimer, tetramer, pentamer és hexamer szerkezetben fordul elo. A szénhidrátköto domenjeivel a mikroorganizmusok mannózban gazdag felszínéhez kötodik, így opszonizálja azokat, elosegítve, hogy a fagocitózis áldozataivá váljanak. A kollagén részével a C1qR-hoz kötodik és ezen az u.n. lektin úton keresztül aktiválja a komplement rendszert, amely végül a membran attack complex (MAC) kialakulásának eloidézésével a kórokozó líziséhez vezet. Az MBL az MBL-associated protease (MASP)-1 és MASP-2 révén a C2-t és C4-et is tudja aktiválni. A MASP-1 képes direkt hasítani a C3-t és ezáltal indukálni a MAC kialakulását (33) (8. ábra). A PRR-PAMP receptor ligand kapcsolat olyan citokinek termelodését válthatja ki (IL-1, IL-6, tumor necrosis alfa (TNF-alfa)), amelyek az akut fázis fehérjék szintézisét indukálják, köztük a CRP és MBL képzést. Az MBL és ligandjának kapcsolódását sziálsav jelenléte gátolja, amelyet bizonyos kórokozók pl. Neisseria meningitidis termelni képesek (33) (9. ábra). 29
8. ábra Az MBL komplement aktivációja Lábjegyzet: A: Az MBL-MASP-2 komplex mikróba felszíni megtapadása a MASP-2 konformáció változását idézi elo, amely képessé teszi a C4 hasítására B:C4b kötodése C: C2 aktivációja során képzodött C2b kapcsolódik a C4b-hez, amely maga C3 konvertáz D: C3b opzonizáló Az ábra átvett illusztráció: (33) Jack DL, Klein NJ, Turner MW. Mannose-binding lectin: targeting the microbal world for complement attack and opsonophagocytosis. Immunological Reviews 2001; 108: 86-99 30
9. ábra Az MBL kötodését a sziálsav jelenléte befolyásolja Lábjegyzet: Az ábra átvett illusztráció (33) Jack DL, Klein NJ, Turner MW. Mannose-binding lectin: targeting the microbal world for complement attack and opsonophagocytosis. Immunological Reviews 2001; 108: 86-99 31
Az infekciók leküzdéséhez megfelelo koncentrációjú szérum MBL szintre van szükség, amelyért genetikai szinten elsosorban az MBL génnek az intakt 1. exonja és intakt promoter régiója felelos (34) (10. ábra). A 10. kromoszóma hosszú karján (10q 21-24) található MBL gén ( mbl2) 1. exonjában eloforduló, eddig ismert 3 féle pontmutáció; az 52-es kodonban (CGT - TGT csere miatt: arginin cystein csere), az 54-es kodonban (GGC - GAC csere miatt: glicin asparaginsav csere), vagy az 57-es kodonban (GGA - GAA csere miatt: glicin és glutaminsav csere) bármelyike MBL deficienciához vezet (35,36,37,38). (A mutáció kimutatása részletesen A mannózköto lektin polimorfizmus és a Chlamydia pneumoniae együttes hatása az asthmára fejezetben: 3.5.2.2 alatt található.) A mutáció következtében 5-10x kisebb koncentrációban termelodik az MBL (39). Az mbl2 gén promóter régiójában, a -221-es pozicióban eloforduló polimorfizmusnak is szignifikáns hatása van az MBL expresszióra. Míg a normál X genotípus kello mennyiségu MBL expresszióhoz vezet, addig az Y genotípus downregulál, szignifikánsan kevesebb mennyiségu MBL expressziót eredményez. Ugyanezen gén promóter régiójának -550-es poziciójában H/L variációk is magas vagy alacsony szintu MBL expresszióhoz vezetnek. A kompaund heterozigóták további variációit és lehetoségét adják az alacsony, közepes, vagy magas koncentrációjú MBL megjelenésének (40). Ugyanezen a kromoszómán az mbl1 pszeudogén (41). A csökkent MBL szintet számtalan betegséggel hozták már összefüggésbe. Az MBL deficiencia foleg fiatal gyermekkorban növeli az infekciók elofordulását (42). Az MBL deficienciát okozó mutáció szignifikánsan összefügg a cystás fibrózisban szenvedo betegek csökkent tüdofunkciójával és krónikus Pseudomonas aeruginosa fertozésükkel (39). Bizonyos autoimmun betegségek súlyossága és azok infekciókkal való szövodése is összefüggést mutat az MBL csökkent szintjével (43,44). A homoszexuálisok között az MBL gén mutációt homozigóta formában hordozóknak szignifikánsan nagyobb esélyük van a HIV fertozésre. Ez a genotípus szignifikánsan összefügg a rövidebb túlélési idovel is (45). A gyermekkori acut lymphoblastos leukémia is gyakoribb a csökkent MBL szinttel élo kisgyermekek között. Ezt a fiatal gyermekkor azon vulnerábilis idoszakában figyelték meg, amikor a specifikus immunvédelem még nem teljesen érett (46). 32
10. ábra Az MBL gén exonjai az MBL különbözo alegységeinek szintéziséért felelosek Lábjegyzet: CRD: szénhidrát felismero domen MBL: mannózköto lektin MASP: MBL-associated serine protease: manózköto lektinhez kapcsolódó szerin proteáz Az ábra átvett illusztáció (34) Turner MW. Mannose-binding lectin: the pluripotent molecule of the innate immune system. Imm Today 1996; 17: 532-540 33
Érdekes, hogy még a koronária betegség kialakulásában és progressziójában is szerepe van az MBL mutációnak. A C. pneumoniae felszínén a major outer membrane protein (MOMP) részeként mannóz molekulák találhatók, amelyek az MBL ligandjai. A C. pneumoniae azokban a felnott betegekben növeli a koronária betegség kialakulásának esélyét, illetve ront annak prognózisán, akik csökkent MBL szintet okozó MBL mutációt hordoznak (47). Az MBL a természetes immunvédekezés szolubilis eleme, amely nem egyedüli, de fontos része a kórokozók elleni védekezésnek. Genetikai tényezokön alapuló alacsony szintje a C. pneumoniae fertozés krónikussá válásának és következményes betegségek kialakulásának rizikó tényezoje. Az errol szóló fejezetben (3.5) az MBL-nek a gyermekkori asthma bronchiale kialakulásában játszott kofaktor szerepét vizsgálom. 34
3. VIZSGÁLATOK 3.1 CCR5?32 MUTÁCIÓ VIZSGÁLATA ALLERGIÁS ÉS ASTHMÁS GYERMEKEKBEN 3.1.1 Bevezetés, célkituzés CCR5 kemokin receptor génjének 32 bázispárral rövidíto deléciós mutációja CCR5?32 - a CCR5 receptor elégtelen muködését, sot annak hiányát is okozhatja. Ez a receptor koreceptora a HIV-1 (human immundeficiencia vírus 1)-nek. E mutáció okozta receptor funkciókiesés összefügg a HIV elleni részleges védettséggel (48). A CCR5 a RANTES kemokinnak is egyik fontos receptora. A RANTES pedig az allergia és asthma patomechanizmusában, az effektor immunsejtek toborzásában játszik szerepet. Logikus feltételezés volt, hogy a RANTES receptorának elégtelensége esetleg véd az asthma kialakulásától. Két egymással teljesen ellentmondó közlemény jelent meg a Lancetben e mutáció és az asthma elleni védettség kapcsolatáról 1999-ben és 2000-ben. Hall és munkatársai a CCR5? 32 mutációt szignifikánsan ritkábban tudták kimutatni skót gyermek asthmásokban, mint kontrollokban, tehát véleményük szerint ez az allélvariáció véd az asthmától (49). Ezzel szemben Mitchell és munkatársai nem találtak szignifikáns összefüggést ezen mutáció és az asthma, atópia között dél-angliai, és kelet-ausztrál populációt vizsgálva (50). Kísérletünk célja az volt, hogy magyar gyermekeknél és a fentieknél nagyobb esetszámmal vizsgáljuk a CCR5?32 mutáció esetleges összefüggését az asthma bronchiale fenotípusával. 3.1.2 Betegek és módszerek 3.1.2.1 Beteganyag A vizsgálatba 566 magyar gyermek került, 118 asthmás (3-18év, átlag: 10,1 év (SD 3,5) ), 145 nem-asthmás, de allergiás (1-18 év, átlag: 5,4 év (SD 3,8)), és 303 illesztett korú allergia és atópia mentes kontroll. Az asthmás gyermekek a Budai Gyermekkórház és Rendelointézet Allergológiai szakrendelésének gondozottjai. Diagnózisukat allergológus állította fel az alábbi 35
kritériumok szerint: 1) kezelésre szoruló, visszatéro nehézlégzés, exspiratórikus nehezítettséggel, 2) kislégúti obstructio kimutatása légzésfunkciós vizsgálattal, 3) kislégúti obstructio reverzibilitása bronchodilatatio hatására a FEV1> 15 %, és a PEF> 15%-os javulásával. Az asthma stádiumait a Global Initiative for asthma (GINA) eloírásai szerint határoztuk meg (1,2). Gondozottjaink között azonban nagy számban voltak szezonális asthma bronchiale-ben szenvedok, emiatt az elso és második lépcso közé egy másfeledik lépcsot is iktattunk, hiszen ezek a betegek az év egyik felében az elso, másik felében a második lépcsobe tartoztak. (4. Táblázat). A nem-asthmás, de allergiás gyermekek a Heim Pál Gyermekkórház Allergológiai szakrendelésének szénanáthás, táplálék allergiás, urticariás, AEDS-s (atópia, ekcéma dermatitis syndrómás) gondozottjai. Diagnózisukat allergológus szakorvos állította fel az alábbi kritériumok szerint: 1) allergia klinikai tünetei, 2) atópia jelenléte (magas IgE és/vagy pozitív borpróba). A kontroll gyermekeket a Heim Pál Gyermekkórházban megforduló gyermekekbol random választottuk, akiknek 1) nem volt sem aktuálisan, sem az anamnézisükben allergiás tünetük, 2) össz IgE szintjük, az életkori átlagot figyelembe véve, normál tartományban volt. 3.1.2.2 Laboratóriumi vizsgálatok A fehérvérsejt szám és eosinophil sejtszám meghatározás a Coulter MAXM Analizátorral történt. Az IgE vizsgálatok Pharmacia CAP System-mel és a Budai Gyermekkórházban ELISA Syrings Diagnostic kittel, az össz IgE EIAgen Total IgE BIOCHEM IMUNOSYSTEMS kittel történtek. A Prick borpróbákat Soluprick teszttel végeztük. Pozitívnak a 3mm, vagy annál nagyobb urtica-göbcsét minosítettük, amelynek hasonlónak, vagy nagyobbnak kellett lennie, mint a pozitív kontrollnak, reakciómentes negatív kontroll mellett. 3.1.2.3 Genotipizálás A CCR5? 32 mutációját PCR-rel határoztuk meg. A fehérvérsejtekbol történt teljes DNS izoláláshoz Miller módszerét használtuk (51). A CCR5 PCR-hez használt primer pár: F: 5 CTT CAT TAC ACC TGC AGC TCT CA- 3 ; R: 5 CAC AGC CCT GTG CCT CTT CTT CTC 3, amelyek a 32 bp deléció két oldalán helyezkedtek el. A vérminták nagy részét Guthrie- féle szuropapírra szárított vérbol nyertük, amelybol 36
4. Táblázat Asthmás betegek súlyossági lépcsok szerint Asthma súlyossági lépcsok Enyhe intermittáló Szezonális enyhe perzisztáló Enyhe perzisztáló Mérsékelt perzisztáló Súlyos perzisztáló Esetszám n: 118 (100%) 24 (20,3) 16 (13,6) 55 (46,6) 23 (19,5) Tünetek Éjszakai tünetek FEV1 és PEF a kívánt érték %-ában, és a reggeli esti variabilitás % <1-2/hét <1-2/hó >80% variabilitás< 20% # # # 1-2/hét, de <1/nap 1-2/hó 60-80% variabilitás: 20-30% >1-2/hét 1-2/hó 60-80% variabilitás> 30% 0 folyamatos gyakori <60% variabilitás> 30% Lábjegyzet: # : szezon alatt enyhe perzisztáló, szezonon kívül enyhe intermittáló FEV1: forszírozott kilégzési térfogat a kilégzés elso másodpercében (liter) PEF: Eroltetett kilégzésnél mért csúcsáramlás (liter/perc) 37