Doktori értekezés A magyar májátültetési program eredményeit befolyásoló egyes tényezők, különös tekintettel a hepatitis C vírusra Dr. Nemes Balázs Doktori Iskola vezetője: dr. Tulassay Zsolt egyetemi tanár Programvezetők: dr. Fehér János egyetemi tanár Témavezetők: dr. Schaff Zsuzsa egyetemi tanár dr. Fehér János egyetemi tanár Semmelweis Egyetem Budapest, Doktori Iskola, 2006 1
EUROPEAN LIVER TRANSPLANT REGISTRY (Európai Májátültetési Adatbázis) 23 ország 129 aktív májátültető központ 63.430 májátültetés 56.863 beteg 1968 május 2004 december A hazai májátültetési program helye Európában (forrás: ELTR Database. www.eltr.org.com) 2
Tartalom 1. Rövidítések 5 2. Bevezetés q 7 3. Célkitűzések 9 4. A vizsgált betegek és az alkalmazott módszerek 10 4.1. Adat és anyaggyűjtés. Fogalmak, meghatározások 10 4.1.1. A teljes hazai beteganyag statisztikai elemzése 11 4.1.2. A szepszis szerepe a betegtúlélést befolyásoló tényezők között 11 4.1.3. A májátültetés műtéttechnikai formáinak hatása az eredményességre 12 4.1.4. A hazai májátültetési program eredményeinek nemzetközi összehasonlítása 13 4.2. A hepatitis C kiújulása májátültetés után 13 4.2.1. A szérum HCV RNS tartalmának vizsgálata. Összefüggések a szövettani és klinikai eredményekkel 13 4.2.2. Hepatitis C rekurrencia apoptotikus vonatkozásai 14 4.3. Krónikus rejekció májátültetés után. Az apoptosis vonatkozásában. 16 4.4. Alkalmazott molekulárbiológiai és egyéb diagnosztikai módszerek 16 4.4.1. Általános szövettani vizsgálat 16 4.4.2. A szérum HCV-RNS PCR vizsgálata 17 4.4.3. Chaperon expresszió vizsgálata májátültetett betegek biopsziás anyagain. 17 4.4.4. Apoptózis proteinek vizsgálata máj allograftokban krónikus rejekció esetén 20 4.5. Statisztikai elemzés 21 5. Eredmények 22 5.1. A májátültetés indikációs köre és eredményei Magyarországon 22 5.1.1. A májátültetés demográfiai és túlélési adatai a hazai gyakorlatban 22 5.1.2. Szövődmények és a túlélést befolyásoló tényezők a hazai gyakorlatban 34 5.1.3. A szepszissel összefüggő klinikai tényezők 40 5.1.4. A májátültetés műtéttechnikai formáinak hatása az eredményességre 41 5.2. Eredményeink összehasonlítása a nemzetközi adatokkal 52 5.3. A Hepatitis C rekurrenciával kapcsolatos vizsgálataink 58 5.3.1. Összefüggések a szérum hepatitis C vírus RNS tartalma, a szövettani és klinikai eredmények között 58 5.3.2. Összefüggések a szérum hepatitis C vírus RNS tartalma, és a chaperon expresszió között 61 3
5.4. A krónikus rejekció apoptotikus vonatkozásai 68 6. Megbeszélés 70 6.1. Általános értékelés 70 6.2. Az eredményességet befolyásoló tényezők 74 6.3. Az eredmények összehasonlítása a nemzetközi gyakorlattal 80 6.4. A hepatitis C vírus 83 6.4.1. A vírus genom 83 6.4.2. A vírus RNS által kódolt proteinek 86 6.4.3. Infektológiai megközelítés 89 6.4.4. Epidemiológiai megközelítés 90 6.4.5. A hepatitis C vírus által a májban okozott elváltozások 92 6.4.6. A vírusrekurrencia pathogenezise 94 6.4.7. Apoptosis a hepatitis C vírus vonatkozásában 95 6.5. A Hepatitis C vírus szerepe a magyar májátültetési programban 100 7. Következtetések 109 8. Köszönetnyilvánítás 111 9. Irodalom 112 10. Saját közlemények jegyzéke 125 10.1. Teljes publikációs lista 125 10.2. Az értekezés alapjául szolgáló közlemények jegyzéke 128 10.3. Az értekezés alapjánul szolgáló nem elsőszerzős közlemények jegyzéke 129 11. Magyar és angol nyelvű összefoglaló 131 4
1. Rövidítések AHF akut májelégtelenség (acute hepatic failure) AIH autoimmun hepatitis ALAT alanin-aminotranszferáz ALD alkoholos eredetű májbetegség ( alcoholic liver disease) ALP alkálikus foszfatáz ASAT aszpartát aminotranszferáz ARDS adult respiratory distress syndrome ARE acut rejekciós epizód ATF6 aktivációs faktor 6 (endoplazmatikus, transzkripciós chaperon) ATG anti-thymocyta globulin (polyclonalis antitest) BMI body mass index CIT cold ischaemic time (hideg iszkémiás idő) CMV cytomegalovírus CLR calreticulin (endoplazmatikus chaperon) CNX calnexin (endoplazmatikus chaperon) CR chronic rejection (krónikus rejekció) DNS dezoxiribonukleinsav EDEM endoplazmatikus reticulum-degradation-enhancing α-mannosidase-like protein ELTR European Liver Transplant Registry (Európai Májtranszplantációs Adatbázis) ER endoplazmatikus retikulum FFP friss fagyasztott plazma GGT gamma-glutamil transzferáz GP96/GRP78 glukóz related protein 96/78 (endoplazmatikus chaperonok) HAT artéria hepatika trombózis (hepatic artery thrombosis) HES hydroxyethyl starch (hidroxyethyl keményítő oldat) HBV hepatitis B vírus HCC hepatocelluláris carcinoma HCV hepatitis C vírus HIV humán immundeficiencia vírus HLA humán leukocyta antigén HTK donorszerv perfúziós oldat: histidine-tryptophan-ketoglutarate HRS hepatorenális szindróma 5
HSP27 heat shock protein 27 (hősokk fehérje, endoplazmatikus chaperon) IFN interferon IRES internal ribosomal entry site (a HCV belső riboszómális kötőhelye) IRE1 inozitol-requiring endoribonukleáz 1 ITBL ischaemic type biliary lesion (iszkémiás tipusú epeúti szűkület) LDL low density lipoprotein (alacsony molekulasúlyú lipoprotein) LDLR LDL-receptor MOF multiorgan failure (többszervi elégtelenség) NF-κB nuclear factor-κb OLT orthotopikus májátültetés (orthotopic liver transplantation) PB piggy back PBC primer biliaris cirrhosis PBS foszfát puffer oldat PCR polimeráz láncreakció ( polymerase chain reaction) PNF primary non-function (elsődleges graft működészavar) PSC primer sclerotizáló cholangitis PVT véna portae thrombosis (portal vein thrombosis) RNS ribonukleinsav ROC receiver operating characteristics (statisztika módszer határérték számítására SBC szekunder biliaris cirrhosis SBD szelektív béldekontamináció SBP spontán bakteriális peritonitis TIPS transjugularis porto-systermas shunt TNF tumor necrosis faktor VCI vena cava inferior VLDL very low density lipoprotein (igen alacsony molekulasúlyú lipoprotein) VVB veno-venosus bypass VOTO venous outflow traject occlusion (májvénák kiáramlási zavara) WIT warm ischemic time (meleg iszkémiás idő) UNOS UPR unfolded protein response UW Donorszerv perfúziós oldat: University of Wisconsin XBP x-box protein (endoplazmatikus transzkripciós chaperon) 6
2. Bevezetés Az első sikeres májátültetést Starzl és munkatársai végezték 1963-ban az Amerikai Egyesült Államokban (174,184,185). Európában először 1968-ban, Angliában, Calne vezetésével történt orthotopikus májtranszplantáció (24) (Orthotopic Liver Transplantation, OLT). Kontinensünkön 2004. decemberéig a májátültetések száma 63.430 volt (2). Magyarországon 1983-ban Szécsény és mtsai végezték az első ilyen beavatkozást a SOTE I. sz. Sebészeti Klinikáján. A későbbi években ezt további 3 sporadikus eset követte. Szervezett keretek között 1995 óta végzünk májátültetést (68, 103, 133, 134, 149, 150). Magyarország Májátültetési aktivitás a kezdetektől napjainkig Európában (forrás: ELTR) A leggyakoribb indikációk egyike a hepatitis C vírus fertőzés talaján kialakult májcirrhosis a nemzetközi (2,15,17,26) és a hazai (133,134,136) gyakorlatban is. Emiatt felmerül a kérdés, hogy a hepatitis C miatt végzett májátültetések aránya befolyásolja-e, és ha igen, akkor mennyiben a májátültetés eredményességét? Az egyéb indikációkkal szemben a virális talajon kialakult májcirrhosis miatt végzett műtét egyik jellegzetessége, hogy az idegen szerv beültetése miatt élethosszig alkalmazott immunszuppresszió az alapbetegség (a hepatitis C vírusfertőzés) kiújulását elősegíti. Így a fenti 7
indikációval végzett műtét egy új potenciális betegség kialakulásának lehetőségét teremti meg: ez a befogadó szervezetben perzisztáló és az immunszuppresszió hatására reaktiválódó endogén hepatitis C fertőzés. A gyakorlati tapasztalat szerint ez a jelenség jelentősen különbözik a de novo hepatitis C fertőzéstől. De novo hepatitis esetén a kontamináció után a betegek 80%-a válik vírushordozóvá klinikai tünetek nélkül, a fertőzések 50%-ában vezet krónikus aktív hepatitishez, és kb. 15 %-ban alakul ki májcirrhosis (43, 63, 64, 65, 94). Az immunszupprimált betegek 100%-a vírushordozó a beültetés pillanatában. Ez a tény egyúttal azt is jelenti, hogy a klasszikus hepatológiai beteghez képest a transzplantált, immunszupprimált betegnél, a fertőzés pillanatától követhetjük a vírus viselkedését. Saját anyagunkban a hepatitis C vírus miatt transzplantált betegeinknél gyakran igen fulmináns, gyors májfunkcióromlással járó, sokszor fatális kimenetelű kórlefolyást észleltünk (136). A szérumban a hepatitis C vírus replikációjára jellemző RNS szint PCR mérés alapján valamennyi esetben szignifikánsan magas volt. Más, hepatitis C vírus miatt transzplantált betegeknél nem tapasztaltuk a fenti jelenséget. Kérdés, hogy a teljes betegtúlélést is befolyásoló tényezőről van e szó?_ Ennek alapján felmerült a kérdés, hogy a fenti jelenséget a hepatitis C vírus korai reaktivácója okozza-e, van-e és ha igen milyen természetű különbség a betegek között. A májátütetés során számos, a hepatitis C vírustól független hatás éri közvetve, vagy közvetlenül a befogadó szervezetet. Ezek részben a donorral kapcsolatosak (nem, életkor, CMV status agyhalál körülményei, donorműtét), részben magával a májátültetéssel (vérátömlesztés mennyisége, CIT, WIT, műtéti technika), részben a recipiens állapotával (életkor,nem, CMV status, HCV replikáció, májdekompenzáció mértéke), és végül a transzplantáció utáni időszakkal (kilökődés, CMV fertőzés, sebészi, infekciós szövődmények). Az epidemiológiai megközelítés mellett a hepatitis C vírus, mint apoptosist indukáló tényező is szerepelhet. Ismert, hogy a HCV core a májsejtbe jutva, az endoplazmatikus retikulumhoz kötve replikálódik. E folyamat során endoplazmatikus stresszt, és oxidatív stresszt is indukál, amely az apoptotikus kaszkádot elősegítő és gátló irányban is befolyásolja. Az eddigi kutatások többnyire in vitro reakciókat vizsgáltak. Amennyiben a májátültetés utáni fulmináns HCV kiújulás és a hepatitis C vírus apoptosist indukáló szerepe között összefüggést lehet kimutatni, felmerül a kérdés, hogy ez az pro 8
apoptotikus hatás miért alakult ki egyes betegeknél, másoknál pedig nem, illetve, hogy ez a betegcsoport befolyásolja-e az eredményességet? A krónikus graftveszteség három legfontosabb oka, az alapbetegség kiújulása, az epeúti szövődmények, és a krónikus rejekció. Jelen tanulmányban az epeúti szövődményekkel részletesebben nem foglalkozunk, az alapbetegség kiújulása a nagyszámú HCV-s beteg miatt elsősorban a víruskiújulást jelenti. A krónikus rejekció jelentősége az évente végzett műtétek számának emelkedésével, a javuló kumulatív betegtúléléssel és az idő múlásával automatikusan növekedni fog. Jelen tanulmányban a magyar anyag korlátozottsága miatt a Hannoveri májtranszplantációs programmal összefogva elemeztünk krónikus rejekció miatt eltávolított májgraftokat, elsősorban az apoptózis szempontjából. 3. Célkitűzések A jelen Doktori értekezés alapjául szolgáló munkák során a következő területeket vizsgáltam 1. A hazai májtranszplantációs program statisztikai jellemzői, fejlődésének iránya. 2. A hepatitis C talaján kialakult májcirrhosis szerepe a hazai májátültetési programban 3. A hepatitis C vírus kiújulási aránya, HCV miatt transzplantált betegek túlélési statisztikája májátültetés után a hazai gyakorlatban, nemzetközi összehasonlítással. 4. A szérum HCV-RNS tartalmának vizsgálata májátültetés után. A HCV kiújulása szövettani vizsgálatok (Knodel skála) alapján. A változás dinamikája. 5. Endoplazmatikus retikulum stressz vizsgálata hepatitis C miatt transzplantált betegek biopsziás anyagán 6. A krónikus graftrejekció apoptotikus vonatkozásai Fentiek vizsgálata során az alábbi kérdésekre kerestem választ: 1. Melyek a hazai májátültetési program eredményességét befolyásoló legfontosabb tényezők? 2. Különbözik-e a HCV, mint indikáció aránya, továbbá a túlélés a hazai és a külföldi májtranszplantációs gyakorlatban? 3. Milyen mértékű, és időben változik-e a hepatitis C kiújulási aránya? 4. Vannak-e, és ha igen melyek azok a perioperativ tényezők, amelyek befolyásolják a hepatitis C kiújulását? 9
5. Van-e összefüggés a szérum HCV-RNS tartalma és a májbiopsziában észlelt elváltozások között? 6. Van-e összefüggés a szérum HCV-RNS tartalma és a hepatitis C vírus kiújulása között? 7. Van-e összefüggés a szérum pro- és antiapoptotikus aktivitása és a szérumban észlelt HCV- RNS aktivitás, valamint a szövettan és a klinikai kórlefolyás között? 8. Van-e összefüggés a hepatitis C vírussal fertőzött májsejtek endoplazmatikus stressz reakciójának intenzitása és a szérum HCV-RNS tartalma között? 9. Milyen az apoptózis fehérjék megoszlása krónikus rejekciós májgraftok szövettani struktúráján belül? 4. A vizsgált betegek és az alkalmazott módszerek 4.1 Adat és anyaggyűjtés Vizsgálatainkba a Magyarországon 1995-2004 között májtranszplantált betegeket vontuk be. A hazai program fejlődésének vizsgálatát (. fejezet) a teljes (1995-2004) beteganyagon végeztük. A nemzetközi összehasonlítást a 1995-2002 között végzett májátültetések adatai alapján végeztük, mivel 2003-tól a posztoperativ immunszuppresszió jelentős megváltoztatása, a szteroidmentes protokoll bevezetése megnehezítette volna homogén csoportok összehasonlítását. A hepatitis C vírus kiújulásával kapcsolatos molekulárbiológiai és szövettani vizsgálatokat az 1998-2003 között végzett transzplantációk esetén végeztük, részben a fentiek miatt, másrészt azért mivel 1998 után nyílt lehetőség PCR vizsgálatokra Fogalmak, meghatározások. A májátültetés elemzésekor használt fogalmak és meghatározásokat illetően utalunk a hazai szakmai folyóiratokban megjelent cikkeinkre (131,132,133,134, 136,137,149). Összefoglalva: A recipiensek állapot-meghatározásához a Child-Turcotte-Pugh (továbbiakban Child-Pugh vagy C-P) score-t használtuk (29,157), valamint a májcirrhosishoz ismerten társuló szövődmények (encephalopathia, nyelőcső visszérvérzés, hepatorenalis szindróma, véna porta thrombosisa, spontán bakteriális peritonitis) előfordulását. A donoralkalmasság meghatározása nemzetközi kritériumok alapján történt (156). Méretben és AB0 vércsoportban identikus, agyhalott donorok mája került beültetésre. A donormájak kivételét standard technika szerint 10
végeztük (183), histidine-tryptophan-ketoglutarate (HTK) vagy University of Wisconsin (UW) in situ perfúziójával. A betegtúlélés a műtét időpontja és a beteg halála között eltelt idő években. A graft túlélés a beültetett donormáj élettartama: a beültetés és a beteg halála, vagy a végzett ismételt májátültetés (retranszplantáció reolt) között eltelt idő években. Műtéti idő: a műtéti bevágás és a bőrvarrat befejezése között eltelt idő. Cold ischemic time Hideg iszkémiás idő (CIT): A donorműtét során az aorta lefogása (tehát a máj hideg oldattal történő perfúziójának kezdete) és a beültetés során a donormáj szisztémás reperfúziója (tehát a máj keringésének visszaállítása) között eltelt idő percekben. Warm ischemic time Meleg iszkémiás idő (WIT): A beültetésnek, a cirrhotikus máj eltávolítása (recipiens hepatektómia) után következő, rövid de meghatározó - a CIT-en belüli szakasza amely a donormáj hűtőfolyadékból történő kivétele és szisztémás reperfúziója között eltelt idő percekben. A műtéttechnikai részleteket illetően utalunk az 5.1.4. fejezetre. 4.1.1 A teljes hazai beteganyag statisztikai elemzése (ref.133-134) A Magyarországon 1995-2004 között végzett valamennyi májátültetésben részesült beteg adatait elemeztük először demográfiai szempontból (133), majd a teljes beteganyagra vonatkozóan a túlélést befolyásoló tényezőket keresve (134). A programot jellemző tényezőket három csoportra osztottuk. Műtét előtti, műtét körüli (perioperatív) és műtét utáni csoportra. Az elsőbe a recipiens és donor adatok (Táblázat), a másodikba a perioperatív adatok (Táblázat) tartoznak. A harmadik csoport a műtét után 1 éven belül kialakult szövődményeket jelenti. A program fejlődésének megítéléséhez a végzett műtéteket két csoportba osztottuk, az OLT végzésének dátuma szerint: 1995-1998, 1999-2003 és ezeket összehasonlítottuk. A 2004-es év adatait, miután az egy éves megfigyelés a dolgozat megírásakor még nem járt le az összehasonlításba nem vontuk be. Az eredményeket az 5.1 fejezet ismerteti. 4.1.2. A szepszis szerepe a betegtúlélést befolyásoló tényezők között (ref.131) A teljes beteganyag vizsgálata során a perioperatív szepszis, mint vezető halálok igazolódott, különösen a hazai OLT program kezdeti időszakában (131,133,134,135). Ezért a májátültetetés utáni kórlefolyás alapján két csoportot alkottunk és hasonlítottunk össze: az egyik betegcsoportnál kialakult a szepszis és sokszervi elégtelenség, a másiknál nem. Az 11
összehasonlítás során az alábbi jellemzőket vizsgáltuk: recipiens életkor, nem, a májátültetés indikációja, megelőző felhasi műtét, májátültetés előtt észlelt diabetes, kardiopulmonalis társbetegség, SBP, encephalopathia, nyelőcső visszérvérzés, HRS, PVT, C-P score, BMI, májátültetés előtti antibiotikus prophylaxis, intraoperatív vörösvértest, FFP és thrombocyta transzfúzió mennyisége, intraoperatív kolloid és crystalloid infúzió mennyisége, a teljes intraoperatív intravénás folyadékbevitel/testtömeg (ml/kg), a műtét típusa (hagyományos/piggy back), VVB, epeúti drain, artériás konduit használata, CIT, WIT és a teljes műtéti idő, alkalmazott immunszuppresszió. A műtét után észlelt szövődmények közül az artéria hepatika thrombosist (HAT), véna porta thrombosisát (PVT), májvénák kiáramlási zavarát (VOTO), továbbá az epeúti szövődményeket (epecsorgás, necrosis, stenosis, ITBL), és posztoperativ vérzést, PNF-t, anti-rejectiós szteroid bóluskezelést, valamint a CMV infekciót vizsgáltuk a szepszis kialakulásával összefüggésben. 4.1.3. A májátültetés műtéttechnikai formáinak hatása az eredményességre (ref.132) A piggyback típusú májátültetést először Tzakis írta le 1989 ben (200). A recipiens hepatectomia korábban leirt módszere szerint a cirrhotikus májat véna cava inferior (VCI) szegmenttel együtt távolították el (174,184). Tekintettel az emiatt szükséges teljes VCI kirekesztésre az alsó testfélből a vénás vér visszaáramlása jelentősen - csaknem nullára - csökken. Ennek következménye a vese vénás pangása is, amely a cirrhotikus betegek egy részében már eleve érintett veseműködést (hepatorenalis szindróma) tovább ronthatja. Fentiek miatt a VCI szegmenttel történő, un. konvencionális májátültetések során a kezdetek óta un. veno-venosus Y bypasst alkalmaznak (177,184), amely a bal oldali véna saphena és a véna mesenterica superior vérét a bal oldali véna axillarisba vezeti egy biopumpán keresztül. A piggyback technika során a cirrhotikus májat a VCI-ról lepreparáljuk, egyenként felkeresve és elvarrva a kisebb, majd a 3 (esetleg több) nagy véna hepatikát. Ennek során a VCI csak tangenciálisan kerül kirekesztésre, ezért a vénás visszaáramlás ha csökkenve is de érintetlen marad. Az eredeti Tzakis leírásban (200) még használtak VVB-t, Belghiti és mtsai 1992-ben leirt közleményében (12) már nem. A beültetés során az eredeti leírás (200) szerint a recipiens bal és középső véna hepatica közös szájadékára end to end kerül a vénás anasztomózis donor VCI proximális szájadékkal. E tekintetben számos módosítás létezik: Cherqui a közös vénás 12
szájadékot a recipiens VCI-on caudál felé hosszabbítva szélesítette az anasztomózist (28), Slooff munkacsoportja a recipiens véna hepatikák teljes lezárása mellett, a recipiens VCI középvonalában ejtett longitudinális metszés után end to side anasztomózist készített (125, 154), míg Belghiti hasonló metszés után azonban a donor VCI szakasz mindkét felének lezárása a donor VCI-on is longitudinális szájadékot képezve side to side anasztomózist végzett (11,12).(5. ábra). kezdetben hagyományos módszert alkalmaztunk bypass-szal, majd a crossclamp és a piggyback szinte egyszerre nyert teret. Mára döntően az utóbbi két módszert alkalmazzuk. A teljes vizsgált beteganyagon összehasonlítottuk a három alapvető technikai variáció, a hagyományos veno-venosus bypass-szal végzett, az u.n. piggy back technika és a hagyományos, de bypass nélkül kivitelezett ú.n. crossclamp technika eredményeit (lsd.5.1.4. fejezet). 4.1.4. A hazai májátültetési program eredményeinek nemzetközi összehasonlítása (ref.135) Transzplantációs és Sebészeti Klinikán 1995 és 2002 között végzett valamennyi, felnőtt betegen végzett primer májátültetés adatait összehasonlítottuk az ugyanezen időszak alatt Európa egyik legrégebbi központjában az UMCG, a Groningeni Egyetemi Kórházban (Akademisch Ziekenhuis Groningen, The Netherlands) végzett hasonló műtétekkel. Az eredményeket az 5.1.5. fejezetben ismertetjük. 4.2. A hepatitis C kiújulása májátültetés után Betegeink között a legnagyobb homogén indikációs csoportot a hepatitis C miatt transzplantáltak alkották. A hepatitis C vírus replikáció vizsgálatának szerepe májátültetés után, a kiújulás diagnosztikájában ellentmondásos (15,16,42,45,59,126,158). 4.2.1. A szérum HCV RNS tartalmának vizsgálata. Összefüggések a szövettani és klinikai eredményekkel (ref.136) Az 1998-2003 között HCV miatt májátültetett betegeinket vizsgáltuk azzal a céllal, hogy kimutatható-e összefüggés a replikációt jellemző HCV-RNS kópiaszáma és a víruskiújulás klinikai és morfológiai jellemzői között. Vizsgálatunk tárgya volt továbbá, hogy a korai és 13
késői kiújulás befolyásolja e a májátültetés eredményességét. Valamennyi, a májátültetést legalább 1 hónappal túlélő hepatitis C-s recipienst bevontuk a vizsgálatba, összesen 38 beteget (136) Tekintettel a gyógyító munka elsődlegességére teljes mértékben nem lehetett homogén betegcsoportokat és kísérleti körülményeket teremteni. Az adatok összegyűjtését a betegek klinikai dokumentációja alapján végeztük. Protokoll szerint a májátültetés után 6 és 12 hónappal végeztünk percutan májbiopsziát, illetve a májfunkció romlása, vagy más klinikai igény esetén, soron kívül. A szövettani diagnosztika a módosított Ischak-Knodell score (87,91) a Banff score (9), továbbá a fibrosis, cirrhosis és a máj histopathologiájának leírt kritériumai szerint történt. A HCV-RNS vizsgálatot a betegek összegyűjtött szérumából, a májátültetés utáni 1,2,3,6,12, és 24, hónapos mintákon végeztük (HCV-RNA PCR RT-PCR Roche version 2.0 kittel, millió copy/ml-ben kifejezett eredménnyel). A kiújulás diagnózisát a szövettani eredmény alapján mondtuk ki. Amennyiben a rekurrenciát a májátültetés után 1 éven belül észleltük korai, ha később, késői kiújulásként rögzítettük. Ahhoz, hogy összehasonlítást végezhessünk a magas és alacsony vírus replikációt mutató betegek között, ki kellett jelölnünk egy határértéket (ú.n. cut off point ). Ennek meghatározása érdekében ú.n. receiver operating characteristics (ROC) analízist (212) végeztünk a korai és késői HCV kiújulást mutató betegek között, a műtét után 6 hónapon belül, a szérumban mért legmagasabb HCV-PCR RNS titer felhasználásával. A határérték így 8.78x10 6 copy/ml-nek bizonyult, amelynek specificitása 77%, szenzitivitása 95% (area: 0.84; p=0.009) volt. Ezek után két csoportra osztottuk a betegeket a májátültetés után 6 hónapon belül mért legmagasabb vírustiter alapján: határérték feletti és alatti csoportra, majd a két csoportot összehasonlítottuk. Az eredményeket az 5.1.6. fejezetben ismertetjük. 4.2.2. Hepatitis C rekurrencia apoptotikus vonatkozásai A hepatitis C vírus replikációja az endoplazmatikus retikulumhoz kötött, ahol a vírus ú.n. endoplazmatikus stresszt idéz elő. Az erre adott válaszreakció az UPR, amelyet ú.n. chaperonok mediálnak. A válaszreakció kihat a májsejt apoptózisára is. A legfontosabb chaperonok expressziójának kimutatására RT-PCR vizsgálatokat végeztünk 36 biopszián, amelyeket hepatitis C cirrhosis miatt májátültetett betegektől vettünk protokoll szerint a 14
májátültetés után 6 és 12 hónappal, illetve vírusrekurrencia gyanúja esetén annak megfelelő időpontban, továbbá, amennyiben antivirális kezelést kezdtünk, az egy éves kezelés után is. A biopsziákat több szempont szerint csoportosítottuk, majd a mért eredményeket, továbbá a klinikai kórlefolyást összehasonlítottuk a csoportok között. Kontrollként tíz egészséges egyén májmintája szolgált, akik balesetben hunytak el. A vizsgálatok technikai módszertanát a 4.4.4. fejezetben ismertetjük. Az eredményeket az egyes endoplazmatikus chaperonok normál májmintához képest mutatott relatív expressziójában adtuk meg Az eredményeket az alábbi csoportok között hasonlítottuk össze: 1. A szérum HCV-PCR határérték (cut off) feletti csoport biopsziás mintáit az interferon kezelés előtt és után 2. A határérték (cut off) alatti csoport biopsziás mintáit IFN előtt és után 3. A két csoport összevont mintáit (IFN előtt) a HCV+ betegeknél biopsziával igazolt akut rejekciós mintákkal Eredményeinket az 5.1.7. fejezetben ismertetjük. 4.3. A krónikus rejekció apoptotikus vonatkozásai A teljes beteganyag vizsgálata során kitűnt, hogy a krónikus rejekció jelenleg nem befolyásolja lényegesen a beteg és grafttúlélést. Azonban a program volumenének dinamikus fejlődése miatt ez várhatóan változni fog. A hepatitis C késői kiújulása és az epeúti szövődmények mellett a krónikus rejekció is az eredményességet befolyásoló egyik tényezővé válhat. Tekintettel arra, hogy a hazai betegek között a krónikus rejekciók száma nem volt nagy számú, a Hannoveri Májtranszplantációs Központtal együttműködve végeztünk apoptosis vizsgálatokat. Ennek során 10 beteget vontunk be, akiknél a beültetett máj allograft krónikus rejekciója miatt retranszplantációra került sor. A retranszplantáció során eltávolított májgraft vizsgálatát végeztük miközben 10, hepatológiai szempontból egészséges agyhalott donor májából vett szövettan szolgált kontrollként. 15
4.4.. Alkalmazott molekulárbiológiai és egyéb diagnosztikai módszerek 4.4.1 Általános szövettani vizsgálat A saját gyakorlatunkban a rekurrens hepatitis quantitativ kifejezésére a módosított Ischak- Knodell score-t, míg az akut rejekció leírására a Banff-scoret használtuk (1. és 2. Táblázat). 1. Táblázat Módosított Hepatitis Aktivitási Index (Knodell- Ischak score) Kategória Fokozat Score Periportalis vagy periseptalis, Enyhe: focalis, néhány portális teret érint 1 interface hepatitis Enyhe/közepes:focalis, számos portális teret érint 2 (piecemeal necrosis) Közepes:összefüggő, a septumok/portális terek < 50 %-a 3 Közepes:összefüggő, a septumok/portális terek >50 %-a 4 Összefüggő necrosis Focalis necrosis 1 3 zóna necrosis néhány területen 2 3 zóna necrosis a legtöbb területen 3 3 zóna necrosis + alkalmanként porto-centralis bridging 4 Focalis/ lyticus necrosis, apoptosis (kivéve gyulladásos sejtek infiltrációja a sinusoidokban) Portalis gyulladás jelei 3 zóna necrosis + többszörös porto-centralis bridging 5 Panacinaris vagy multiacinaris necrosis 3 egy focus (10x objektiv) 1 látótérben 1 2 focus 1 látótérben 2 5-10 focus 1 látótérben 3 >10 focus 1 látótérben 4 enyhe, néhány, vagy valamennyi portális teret érinti 1 közepes, néhány, vagy valamennyi portális teret érinti 2 közepes, jelzett valamennyi portális teret érinti 3 erőteljes, valamennyi portális teret érinti 4 16
2. Táblázat RAI index ( Rejection Activity Index), Banff score. Az akut rejekciós aktvitás Kategória Portalis gyulladás Epeúti gyulladás/ károsodás Venula endothelitis Lymphocyta infiltráció, a portalis triasok egy részében 1 Lymphocyta (blast, neutrophil, eosinophil) infiltráció, a legtöbb, portalis triasban 2 Kifejezett portalis expanzió, kevertsejtes infiltráció a periportalis tér felé terjedőben 3 Sejtes infitráció (epeutak egy része), reaktiv elváltozások (epithelialis sejtek mag/plasma arány megnövekedése) 1 Sejtes infiltráció (epeutak többsége), degenerativ jelek (magpolymorphismus, polaritásváltoztatás, cytoplasma vacuolasito az epithelialis sejtekb.en) 2 A degeneratios jeleket valamennyi epeút mutatja,+ focalis lumenbe törő disruptio 3 Subendothelialis lymphocyta infiltráció, portalis/ hepaticus venulák egy részében 1 Lsd előbb + legtöbb portalis és hepaticus venula érintett 2 Lsd előbb + perivenularis parenchyma érintett, +perivenularis hepatocyta necrosis 3 A késői histopathologiai elváltozások között a hepatitis C által okozott progresszív elváltozásoktól elkülönítendő a krónikus rejekció, és ennek egy különleges formája az un. vanishing bile duct syndroma, továbbá az egyéb rekurráló betegségek, mint pl. a primer biliaris cirrhosis, továbbá a gyógyszermellékhatás okozta elváltozások. 4.4.2. A szérum HCV-RNS PCR vizsgálata HCV-RNS-t polymerase chain reaction (PCR) módszerrel mértük (RT-PCR Roche version 2.0) a megjelölt irodalomban részletezettek szerint: (40,210). Az eredményeket kópiaszám/ml-ben fejeztük ki. Az assay a Thermus thermofilusból izolált bifunkcionális termostabil DNS polymerase függő. Ez az enzim mind RNS, mind DNS dependens DNS polymerase aktivitással rendelkezik, ezért használatával elkerülhető, hogy a DNS komplementer RNS (mint target) előállításához és az amplifikáció folyamatához külön reakciókra és enzimekre legyen szükség. A használt PCR assay érzékenysége 50 IU/ml. Ennek megfelelően a megfelelő primerek és probe-ok kiválasztásával a módszer egyúttal valamennyi HCV genotípus meghatározására is alkalmas (27). 4.4.3. Chaperon expresszió vizsgálata májátültetett betegek biopsziás anyagain Májtranszplantált betegekből származó, 56 db paraffinba ágyazott májbiopsziás mintán (28 minta alacsony, 12 minta magas HCV titerű betegből, 16 minta akut rejekció esetén) végeztük el a génexpressziós vizsgálatokat. Normál kontrolként balesetben elhunyt, fiatal, egészséges 17
emberekből nyert májminta (10 db) szolgált, a halál időpontja és a szöveti fixálás között 6-12 óra telt el. XBP1, ATF6, HSP27, GP96, GRP78, CNX, CLR és GAPDH mrns expresszió vizsgálata real-time-pcr módszerrel RNS izoláció A formalin-fixált, paraffinba ágyazott biopsziás mintákból az össz RNS kivonása High Pure RNA Paraffin Kit-tel (Roche, Indianapolis, Indiana, USA) történt, blokkonként 8 db 5 µm vastagságú metszetből. A Proteináz K emésztés minden minta esetében 16 óra volt, a teljes folyamat a gyártó útmutatásai szerint történt. Az izolálás után az RNS mintákat -80 C-on tároltuk felhasználásig. Az össz RNS integritását egy korában leírt módszerrel ellenőriztük (paska). Reverz transzkripció Az össz RNS (500 ng) átírása MulV reverz transzkriptázzal (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) történt (50 perc 42 C-on) RNáz inhibitor (Applied Biosystems) jelenlétében, Random Hexamer (Applied Biosystems) felhasználásával. Real-time kvantitatív RT-PCR A real-time PCR reakciókhoz 2 µl cdns-oldatot használtunk, a méréseket ABI Prism 7000 készüléken (Applied Biosystems) végeztük. Minden egyes PCR reakciót 25 µl reakcióelegyben, SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA, 1708851) felhasználásával végeztünk. A primer szekvenciák az alábbiak voltak: 18
Chaperon Primer Termékhossz (bázispár) XBP1total F 5 CATGGCCTTGTAGTTGAGAACCA-3 (378-400) 95 XBP1total R 5 ACTTCATTCCCCTTGGCTTCC-3 (452-472) GI: 18148379 XBP1spliced F 5 TGAGTCCGCAGCAGGTGC-3 (494-511) 81 XBP1spliced R 5 TCTGAAGAGTCAATACCGCCAGA -3 (552-574) GI: 18148381 ATF6 F 5 TGCTTCACCCAGAAGTTATCAAGAC -3 (1705-1729) 92 ATF6 R 5 GCAGGTGATCCCTTCGAAATG -3 (1796-1776) GI: 56786156 HSP27 F 5 CGTGTCCCTGGATGTCAACC -3 (395-414) 87 HSP27 R 5 TCGTGCTTGCCGGTGATC -3 (464-481) GI: 4996892 GRP78 F 5 ACCATCCCGTGGCATAAACC -3 (1353-1372) 108 GRP78 R 5 ACATCAAGCAGTACCAGGTCACCT -3 (1437-1460) GI: 18044380 GP96 F 5 TAAGCTCTATGTGCGCCGTGT -3 (1332-1352) 122 GP96 R 5 TCTCGCGGGAAACATTCAAG -31 (1434-1453) GI: 4507676 Calnexin F 5 CTCCCAAGGTTACTTACAAAGCTCC-3 (275-299) 89 Calnexin R 5 AATCCACCCTGACAGAGTTCCTC-3 (341-363) GI: 31542290 Calreticulin F 5 TGTTTGGTCCCGACATCTGTG-3 (460-480) 102 Calreticulin R 5 CCTTGCAACGGATGTCCTTG-3 (542-561) GI: 5921996 GAPDH F 5'CATTGACCTCAACTACATGG-3' (186-205) 121 GAPDH R 5'GAAGATGGTGATGGGATTTC-3' (287-306) GI: 7669491 F: forward, R: reverse A mérések 96-os plate-eken, duplikátumokban történtek: 2 percig 95 C-on, majd 40 cikluson keresztül 95 C-on 20 másodperc, 60 C-on 30 másodperc és 72 C-on 1 perc. Az adatok elemzéséhez és a statisztikai analízishez REST-programot (relative expression software tool, www.wzw.tum.de/gene-quantification) használtunk, a génexpressziót minden gén esetében GAPDH háztartásgénhez, mint referenciagénhez viszonyítottuk. A relatív expressziót az alábbi képlet alapján számítottuk ki: 19
R= E (vizsgált gén) E (referenciagén) CP (kontroll középérték minta középérték) CP (kontroll középérték minta középérték) R= a relatív expresszió E =a PCR reakció hatékonysága (azaz ciklusonként észlelt PCR növekedés szorzója, ideális esetben ciklusonként duplikálódás, azaz 2) CP= azaz crossing point, az a ciklusszám, ahol az RNS mennyisége meghaladja a detektálhatóság küszöb (treshold) értékét 4.4.4. Apoptózis proteinek vizsgálata máj allograftokban krónikus rejekció esetén Az immunhisztokémiai vizsgálatokat a korábban leírtak szerint végeztük. (38,39). A fagyasztott májszövet mintákból 5-µm-vastag metszeteket készítettünk kriosztáttal, majd közvetlenül a felhasználás előtt 10 percig acetonban fixáltuk. Az immunjelölésekhez először a nem specifikus kötődések megakadályozására a metszeteket hőkezelt (hőinaktivált) humán AB vércsoportú szérumban preinkubáltuk (1:10 hígítva PBS-ben 20 percig), majd a megfelelő hígítású primer antitesttel inkubáltuk 60 percig 37 C-on. Háromszori PBS mosás után a másodlagos antitest (5% peroxidázzal konjugált kecske anti-egér immunglobulin (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd. Soham, Cambridgeshire, UK) és 5%-os hő-inaktivált humán szérumot alkalmaztunk PBSben 60 percig. Ezt további kimosás követte PBS ben. A másodlagos antitest kötődését hidrogén peroxidot tartalmazó acetát pufferben (ph=5.2) oldott aminoethyl carbazol (DAKO, Carpinteria, CA, USA) vagy hidrogén peroxid tartalmú imidazol HCl pufferben oldott diaminobenzidin (DAKO, Carpinteria, CA, USA) segítségével végeztük. Csapvizes mosás után hematoxilines háttérfestést alkalmaztunk és glicerines fedőanyag segítségével fedtük a metszeteket. A negatív kontrollként szolgáló metszeteken a primer antitestet PBS-el illetve a humán mintákhoz specifikusan nem kötődő antitesttel helyettesítettük. A paraffinba ágyazott minták esetében a standard fixálást, beágyazást és metszetkészítést és deparaffinálást követően a kellő antigénfeltárás érdekében a metszeteket Antigen Unmasking Solution-ba (Vector Laboratories, Inc.; Burlingame, CA USA) helyezve 10 percig mikrohullámmal kezeltük. A fagyasztott metszetek esetében is alkalmazott primer 20
antitesteket használva, ezeket 4 C-on egy éjszakán át inkubáltuk a metszettel. A további eljárások megegyeztek a fagyasztott metszetek esetében leírtakkal. Az apoptosist TUNEL módszerrel mutattuk ki, ApopTag in situ apoptosis detection kit (Oncor, Gaithersburg, MD, USA) segitségével. A paraffinba ágyazott 4 m vastag szekciókat deparaffináltuk, majd) 20 g ml -1 proteinase K (DAKO, Carpinteria, CA, USA) segitségével emésztettük. Az endogen peroxidáz activitást 2% hydrogénperoxid tartalmú PBS-sel gátoltuk. A metszeteket ezek után 37 C-on, nedves kamrában inkubáltuk 1 órán át az előírt hígítású TDT enzimmel, átmostuk stop/wash puffer-rel, majd 30 percig anti-digoxigenin peroxidázzal inkubáltuk. Diaminobenzidin-t (DAKO, Carpinteria, CA, USA) alkalmaztunk a reakció láthatóvá tételéhez. Az eredményeket két független pathologus értékelte fénymikroszkópos vizsgálattal. Az általánosan használt szemikvantitativ elemzésnek megfelelően (38,39) az immunreakciót a negatívtól (-) az erősen pozitívig (+++) jelöltük a festődés intenzitásától, illetve a festődött sejtek számától függően. 4.5. Statisztikai elemzés Az adatokat SPSS 12.0 computerprogrammal dolgoztuk fel. A betegtúlélési görbéket Kaplan-Meier szerint, a dinamikusan változó értékeket 2 mintás student t-próbával, míg a nonparametrikus értékeket, Fisher illetve khi-négyzet próbával vizsgáltuk. A multivariancia számítást (amennyiben a kategorikus értéke bekövetkezéséhez időfaktor nem volt rendelhető) bináris regressziós analízissel végeztük, Hosmer-Lemeshow test alapján, a túléléseket befolyásoló multivariancia számításokat Cox-regressziós analízissel. Szignifikánsnak a p <0.05 értéket tekintettem. Az ER stressz, a relatív chaperon expresszió során alkalmazott statisztikai vizsgálatot az előzőekben leírtuk. 21
5. Eredmények 5.1 A májátültetés indikációs köre és eredményei Magyarországon 5.1.1. A májátültetés demográfiai és túlélési adatai a hazai gyakorlatban Az 1995 és 2004 között végzett májátültetések évenkénti számát az 1.ábra ismerteti 30 25 Máj Máj+vese 20 Count 15 10 5 0 2004* 2003 2002 2001 2000 1999 1998 1997 1996 1995 1.ábra. Májtranszplantációk számának alakulása évenként. 1995-ben 10, 2004-ben december 22-ig 43 májátültetést végeztünk. Az 1, 3 és 5 éves graft túlélés 1995-1997 között 52%, 42% és 36%, 1998-2000 között 67%, 61% és 58%, a 2002-2004 között 78%, 74% és 74 % volt. Ugyanezen időszakok alatt az 1, 3, és 5 éves betegtúlélés 55%, 45% és 39% (1995-97), 72%, 64% és 61% (1998-2000), illetve 78%, 77% és 77% voltak. (2. ábra) 22
Betegtúlélés (Kaplan-Meier) Cum Survival 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 1/2 p=0.03 Vizsgált időszak 1.1995-97 2.1998-2000 3.2001-2004 2/3 p=0.2 1/3 p=0.003 0.4 0 2 4 6 8 10 Évek 2/a ábra. Kumulatív betegtúlélés májátültetés után. A vizsgált időszakok páronkénti összehasonlításával Graft túlélés (Kaplan-Meier) Cum Survival 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 Vizsgált időszak 1.1995-97 2.1998-2000 3.2001-2004 2/3 p=0.21 1/3 p=0.004 1/2 p=0.04 0.4 0 2 4 6 8 10 Évek 2/b. ábra. Kumulatív graft túlélés májátültetés után. A vizsgált időszakok páronkénti összehasonlításával. 23
Indikációk megoszlása 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 1995-1998 1999-2003 PAR CHOL AHF TUM A májátültetés indikációs körét a 3. Táblázat és a 3. ábra tartalmazza. A hazai programban, a májátültetés indikációját döntő mértékben parenchymás májbetegségek alkották (63%), és ezen belül meghatározó volt a hepatitis C vírus (HCV) fertőzés talaján kialakult májcirrhosis aránya (37%). 3. ábra Indikációk változása a vizsgált periódusban AHF akut májelégtelenség, PAR parenchymás májbetegségek CHOL cholestatikus májbetegségek, TUM tumor (primer indikáció) A HCV aránya az indikációk között növekedett (4.ábra). Gyakoriságban ezután következtek a cholestatikus májbetegségek (19%), ezen belül a PBC és PSC csaknem egyenlő arányban (8% vs. 9%). A metabolikus májbetegségek és Budd-Chiari szindróma miatt végzett OLT aránya 2% ill. 4% volt. A fenti arányok megoszlása az évek során jelentősen nem változott. A tumorok, mint elsődleges indikáció miatt végzett OLT aránya összességében 4% volt, azonban ez 7%-ról 3%-ra csökkent 9 év alatt és 2004-ben egy májátültetést végeztünk ilyen indikációval. Az első 4 évben ez 16% a második időszakban csupán 4% volt az AHF miatt végzett OLT aránya, míg 2004-ben 13%. 24
3. táblázat. A májátültetés indikációi a hazai májtranszplantációs programban 1995-2003 (164) 1995-1998 (59) 1999-2003 (105) P 2004 (30) Parenchymás májbetegségek 104 (63) 34 (59) 70 (67) Ns 18 (60) Hepatitis C cirrhosis 61 (37) 18 (30) 43 (41) 0.1ns 9 (30) Hepatitis B cirrhosis - - - 1 (3) Alkoholos cirrhosis 26 (16) 9 (15) 17 (16) Ns 5 (17) Autoimmun cirrhosis 10 (6) 4 (7) 6 (6) Ns 1 (3) Cryptogén cirrhosis 7 (4) 3 (5) 4 (4) Ns 1 (3) Cholestaticus májbetegségek 32 (19) 9 (15) 23 (22) Ns 6 (20) Primer biliaris cirrhosis 13 (8) 4 (7) 9 (9) Ns 3 (10) Primer sclerotizáló cholangitis 14 (9) 4 (7) 10 (10) Ns 3 (10) Secundaer biliaris cirrhosis 3 (2) 1 (2) 2 (2) Ns - Kongenitális májfibrózis 2 (1) 0 2 (2) Ns 2 (7) Metabolikus májbetegségek 3 (2) 1 (2) 2 (2) Ns - Wilson-kór 4 (2) 1 (2) 3 (3) Ns 1 (3) Tumor, mint primer indikáció 7 (4) 4 (7) 3 (3) Ns - Malignus (kivéve HCC) 5 4 (7) 1 (1) Ns - Cholangiocarcinoma 1 1 (2) - Ns - Mal.hemangioendothelioma 1-1 (1) Ns - Stroma tumor májmet. 1 1 (2) - Ns - Leiomyosarcoma májmet. 1 1 (2) - Ns - Carcinoid májmetasztázisa 1 1 (2) - Ns - Benignus (hemangioma) 1-1 (1) Ns - Egyéb 4 (4) 1 (2) 3 (3) Ns 2 (7) Budd-Chiari szindróma 3 (2) 1 (2) 2(2) Ns 1 (3) Acut májelégtelenség 13 (8) 9 (16) 4 (4) 0.008 4 (13) Gombamérgezés 3 (2) 3 (6) 0 0.03 1 (3) Gyógyszermérgezés 3 (2) 2 (3) 1 (1) Ns - Akut M.Wilson 2 (1) 2 (3) 0 Ns 2 (7) Ismeretlen eredetű 5 (3) 2 (3) 3 (3) Ns 1 (3) Megjegyzés:A folytonos (számokkal kifejezhető) adatokat, mint medián (minimum-maximum), a kategorikus (igen/nem) adatokat mint abszolút érték (százalék) tüntettük fel. 25
Megoszlás 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1995-1998 1999-2003 non-hcv HCV 4. ábra. Hepatitis C miatt transzplantált betegek százalékos arányának változása a vizsgált két időszakban Az indikációk (UNOS beosztás) alapján összehasonlított betegtúlélést az 5. ábra mutatja. Szignifikáns különbség csak a cholestatikus csoport (PSC, PBS, SBC) és az akut májelégtelenség (p:0.05), valamint tumor miatt végzett OLT-k (0.03) között volt kimutatható. 5.ábra. Betegtúlélés indikációk szerint (UNOS csoportok) PAR CHOL AHF PAR X X X CHOL 0.16 X X AHF 0.28 0.05 X Cum Túlélés 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 TUM 0.18 0.03 0.83 0.00 0 1 2 3 4 5 Betegtúlélés (évek) AHF CHOL PAR TUM A hepatitis C miatt transzplantált betegek 1, 3, és 5 éves kumulatív túlélése a teljes 10 éves vizsgált időszakra nézve 64%, 55% és 51%, minden más indikáció esetén ez 73%, 66% és 63% volt. A különbség (meglepően) nem szignifikáns (p:0.19). Időszakokra bontva már észlelhető a csökkenő - különbség (6. a-c- ábrák). 26
1995-1996 1998-1999 1.0 0.8 HCV non-hcv 1.0 HCV non-hcv 0.8 0.6 p: 0.009 0.6 p:0.08 0.4 0.4 0.2 0.2 0.0 0.0 0 1 2 3 4 5 Betegtúlélés (évek) 6/a.ábra. Betegtúlélés HCV és egyéb indikációk esetén 0 1 2 3 4 5 Betegtúlélés (évek) 6/b.ábra. (1998-1999) (1995-1996) 2001-2004 1.0 HCV non-hcv 0.8 0.6 p:0.30 0.4 0.2 0.0 0 1 2 3 4 5 Betegtúlélés (évek) 6/c.ábra. Betegtúlélés hepatitis C és egyéb indikációk esetén (2001-2004) A recipiensek és donorok demográfiai adatait a 4-5. Táblázat tartalmazza. A recipiensek átlagéletkora 38 (4-53) évről 44 (13-62) évre növekedett (p=0.0009) 2003-ig, majd 47 (11-63) 2004-ben. Gyermekeken összességében 5%-ban végeztünk májátültetést 2003-ig csökkenő (10% vs 2%. p=0.02) tendenciával. Ez a trend 2004-ben megfordult 27
(10% gyermek). A nemek aránya kiegyenlített volt és maradt. A recipienseknél 24%-ban észleltünk szív-érrendszeri társbetegséget illetve diabetes mellitust. Ez az arány az évek multával növekedett (16% vs. 29%. P=0.07). A recipiensek body mass indexe 1995-1998 között 23 (18-28), míg 1999-2003 között 25 (19-32) volt, ami statisztikai növekedés. 4. táblázat. A recipiensek demográfiai és klinikai adatai 1995-2003 (164) 1995-1998 (59) 1999-2003 (105) p 2004 (30) Életkor 40 (4-62) 38 (4-53) 44 (13-62) 0.0009 43 (11-63) Felnőtt 156 (95) 53 (90) 103 (98) 27 (90) Gyermek 8 (5) 6 (10) 2 (2) 0.018 3 (10) Nem (férfi/nő) 84/80 (51/49) 29/30 (49/51) 55/50 (52/48) Ns 14/16 (47/53) Társbetegségek 39 (24) 9 (16) 30 (29) 0.06 7 (23) Sziv-érrendszeri 26 (16) 5 (9) 21 (20) 0.06 7 (23) Diabetes mellitus 9 (7) 3 (6) 13 (12) Ns 4 (13) Társbetegség száma/ beteg 1 (0-2) 1 (0-1) 2 (0-2) 0.01 1 (0-2) Body mass index 24 (14-37) 23 (14-32) 25 (18-37) 0.0009 25 (16-39) Child Pugh score 9 (5-14) 9 (5-14) 9 (5-13) Ns 9 (6-13) C-P grade A 15 (9) 5 (9) 10 (9) Ns 3 (7) C-P grade B 83 (51) 26 (45) 57 (54) Ns 17 (60) C-P grade C 65 (40) 27 (47) 38 (36) Ns 10 (33) Cirrhosis szövődménnyel 105 (65) 36 (64) 69 (66) Ns 16 (54) PreOLT encephalopathia 67 (41) 24 (41) 43 (41) ns 7 (23) PreOLT varixvérzés 48 (29) 12 (21) 36 (32) 0.07 8 (26) PreOLT HRS 25 (16) 6 (10) 20 (19) ns 11 (37) PreOLT felhasi műtét 34 (22) 12 (21) 22 (22) ns 2 (7) PreOLT splenectomia 2 (2) 0 2(2) Ns 1 (3) PreOLT SBP 17 (11) 5 (9) 13 (12) Ns 3 (10) PreOLT PVT 15 (!0) 7 (13) 8 (8) Ns - PreOLT TIPS 9 (6) 0 9 (9) 0.01 5 (17) Szövődmény /beteg 1 (0-4) 1 (0-2) 1.5 (0-4) 0.08Ns 2 (0-3) HCC cirrhotikus májban 18 (11) 10 (17) 8 (8) 0.06ns 1 (3) 28
A Child-Pugh score változatlan volt, átlagosan 9 (C-P: B). Ezen belül azonban a Child B betegek aránya nőtt (45% vs 54%), míg a Child C betegeké csökkent (47% vs 36%). Az általunk transzplantált májbetegeknél 65%-nál jelentkeztek a cirrhosis szövődményei az OLT előtt, és ez az arány az idő múlásával nem változott. Vezető szövődmény volt az encephalopathia (41%), nyelőcsővisszérvérzés (29%) és ezt követte a hepatorenalis szindróma (16%). Spontán bakteriális peritonitist a várakozó recipiensek 11%-nál észleltek, a véna porta trombózisát 10 %-ban. Ezek az arányok statisztikai értelemben nem változtak, azonban a varixvérzés, SBP és HRS tekintetében növekedést a portalis trombózis esetében csökkenést észleltünk. (4.Táblázat) Növekedést észleltünk viszont az egy recipiensre jutó szövődmények számában: ez átlagosan betegenként 1 volt 1995-1998 között, míg 1,5 a 1999-2003 között (p=0.08). és 2 2004-ben. A recipiensek 11%-ában észleltünk hepatocelluláris carcinomát. Ennek aránya csökkent (17% vs. 8%. P=0.06). 5. táblázat. A donorok demográfiai és klinikai adatai 1995-2003 1995-1998 1999-2003 p 2004(30) (164) (59) (105) Életkor 35 (11-63) 31 (12-63) 39 (11-56) 0.05 40 (11-63) ITO-n töltött idő (nap) 1 (0-8) 1 (0-8) 1 (0-8) Ns 1 (0-7) Body mass index 23 (17-28) 23 (18-28) 23 (17-27) Ns 23 (16-29) Kapott-e transzfúziót 35 16 (30) 19(25) Ns 7 (23) Transzfúzió (E) 1 (0-17) 1 (0-9) 1 (0-17) Ns 1 (0-6) Keringéstámogatás 108 44 (80) 64 (77) Ns 21 (70) Dopamin (γ/kg/min) 4 (0-20) 4 (0-12) 4 (0-20) Ns 4 (0-16) Donor perfúzió UW 90(55) 13 (22) 77 (73) 0.009 32 (100) Donor perfúzió HTK 73 (48) 45 (78) 28 (27) - A donorok átlagéletkora 36 év volt, 1999-ig 31, 1999-2003 között 39 év, amely statisztikai növekedést jelent (p=0.006). A donorok átlagosan 1 napot töltöttek a donorkórházak intenzív osztályain, 30%-uk kapott vérátömlesztést (átlagosan 1 egység vvt masszát), 80 %-ban keringéstámogatást (átlagosan 4 γ/kg/min Dopamint). Ezek az adatok nem változtak az idővel. A donorműtétek során 55%-ban UW oldatot és 45%-ban HTK-t 29
használtunk, 1995-1998 között a HTK (78%), míg 1999-2003 között az UW (73%) volt a jellemzően használt prezervációs oldat. 2004-ben 99 %-ban UW-t használtunk. Az antibiotikus profilaxist és a műtéti adatokat a 6-7. Táblázat ismerteti. 6. táblázat. Antibiotikum profilaxis és műtéttechnikai adatok 1995-2003 1995-1998 1999-2003 p 2004 (164) (59) (105) (30) Antibiotikus profilaxis Ceftriaxon+Oxacyllin 26 (14) 26 (41) 0 (-) 0.0009 - Meropenem 87 (55) 33 (59) 55 (52) Ns - Amoxycillin+Ciprofloxacin 27 (17) 0 (-) 27 (26) 0.0009 29 (97) Tazobactam 21 (13) 0 (-) 21 (20) 0.01 - SBD 14 (9) 14 (24) 0(-) 0.0009 0(-) Teicoplanin 2 (1) 0 (-) 2 (2) Ns 1 (3) Műtét technikai adatok Full sized/szegment 161/3 (98/2) 56/3 (95/5) 105/0 (100/-) 0.02 2 (7) Hagyományos 104 (65) 49 (84) 60 (57) 0.0009 9 (30) Piggy back 57 (35) 7 (12) 45 (43) 21 (70) VVB használata 48 (30) 35 (60) 13 (11) 0.0009 3 (10) Crossclamp VCI 57 (36) 15 (26) 46 (44) 0.02 6 (20) Reperfúzió: ante/retrograd 147/16 (90/10) 59/- (100/-) 89/16 (85/15) 0.002 4/26 (13/87) Műtét ideje (perc) 445 (245-1105) 460 (313-875) 428 (245-1105) Ns 450 (285-690) CIT (perc) 507 (299-1097) 488 (299-765) 532 (365-1097) 0.045 472 (305-717) WIT (perc) 55 (30-107) 55 (30-98) 55 (38-107) Ns 55 (37-83) Epeúti drain 37 (23) 35 (59) 2 (2) 0.0009-30
A betegek 98 %-nál full size (teljes máj) átültetését végeztük. 1999-ig 3%-ban történt u.n.redukált, azaz részleges (májlebeny, májszegment) átültetés, valamennyi esetben 2-3 szegmentum, gyerekeknél. 1999-2003 között egyáltalán nem végeztünk ilyen műtétet. 2004-től ismét növekvő számban és felnőtteknél is, ezúttal split technikával, ami azt jelenti, hogy az anatómiailag szétválasztott 2-3 illetve 4-8 szegmentum által alkotott két májrészlet -elvileg - külön-külön is beültethető (7. ábra). Hagyományos OLT történt a betegek 65%- ánál, piggy back 35%-nál. A hagyományos műtétek száma csökkent (84% vs 57%), a piggy back aránya nőtt (12% vs 43%). 2004 ben a műtétek 60%-a piggy back technika szerint történt (8.ábra). 1.0 1.0 0.8 0.8 Megoszlás 0.6 0.4 Megoszlás 0.6 0.4 0.2 0.0 1995-2002 2003-2004 Teljes máj Split technika (S4-8) Redukció 0.2 0.0 1996 1995 piggyback 2002 2001 2000 1999 1998 1997 2004 2003 hagyományos 7.ábra. Beültetett máj típusa. Redukció: 2-3 szegmentum leválasztása a maradék (4-8) májszegmentumok meg nem őrzése mellett. 8.ábra. Műtéttechnikai típusok megoszlása évenként. Hagyományos technika (veno-venosus bypass-szal, vagy anélkül ún.crossclamp technikával), illetve piggyback Split technika: 4-8 szegmentumok és 2-3 szegmentumok anatómiai szétválasztása, mindkét májrészlet beültethetőségének megőrzésével. 31
A hagyományos műtéten belül alkalmazott veno-venosus bypass használata átlagosan 30% volt. A bypass nélkül, teljes véna cava kirekesztés (ú.n. crossclamp) mellett végzett műtétek aránya 36%, amely 26%-ról 44%-ra emelkedett. A máj beültetése során a véna cava anasztomózis és a véna porta anasztomózis elkészülte után a reperfúzió két irányból lehetséges: a porta (anterográd) vagy a cava (retrográd) felől. 2003-ig kizárólag anterográd reperfúziót alkalmaztunk, innentől csaknem mindig retrográd reperfúziót. Epeúti draint 1997-ig alkalmaztunk rendszeresen, 1999-ig alkalomszerűen a továbbiakban soha. Nem változott a műtét átlagos ideje (440 perc) és a WIT (55 perc), csökkent viszont a CIT (532 vs 488 perc). Ez utóbbi 2004-ben tovább csökkent 472 percre. A beültetett májaknál összesen 87 esetben vettünk ú.n. reperfúzió utáni null biopsziát. A szövettani elemzés során 53%-ban valamilyen mértékű zsíros elfajulás volt jelen, azaz csak 47%-ban észleltünk eltérés nélküli donormájat. Az eltérés nélküli donormájak aránya az évek multával javult 43%-ról 49 %-ra. Jellemző változás volt a műtét alatt alkalmazott vér és vérpótszerek mennyiségében és összetételében. Ennek részleteit a 7. Táblázat tartalmazza. 7. táblázat. Perioperatív folyadékterápia 1995-2003 1995-1998 1999-2003 p 2004 (164) (59) (105) (30) Vértranszfúzió(E) 11 (2-50) 13 (4-50) 10 (2-30) 0.003 5 (0-19) FFP (1000ml) 3.1 (0-12) 2.8 (4-10) 3.6 (0-12) 0.005 3.2 (0-10.6) THR (ml) 200 (0-800) 200 (0-800) 200 (0-800) ns 400 (0-600) Kryoprecipitatum (E) 6 (0-116) 14 (0-116) 1 (0-54) 0.001 - Cell Saver használata 82 (52) 15 (26) 70 (67) 0.0009 28 (93) CellSaver (ml) 410 (0-7600) 0 (0-7600) 680 (0-4320) Ns 822 (0-4000) I.v. folyadék (ml/ttkg) 169 (44-541) 173 (66-541) 166 (44-390) Ns 82 (40-200) Kolloid (Elohest) adása 124 54 (96) 70 (70) 0.0009 0 Kolloid (ml) 1400 (0-6500) 1500 (0-4500) 1300 (0-6500) Ns 150 (0-1000) Krisztalloid (ml) 1600 (0-8300) 2000 (0-8300) 1500 (0-3500) 0.001 300 (0-1500) Hematokrit (1.nap).31 (13-46).32 (20-46).31 (13-43) Ns 0.27 (22-31) 32