Az információs entrópia felhasználása polipeptidek konformációs sokaságainak és belső dinamikájának jellemzésére

Átírás

1 Az információs entrópia felhasználása polipeptide onformációs soaságaina és belső dinamiájána jellemzésére dotori dolgozat Gyimesi Gergely Témavezető: Dr. Závodszy Péter Dr. Szilágyi András Külső onzulens: Dr. Hegedűs Tamás Pázmány Péter Katolius Egyetem Információs Technológiai Kar Budapest, 0.

2 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szeretném megöszönni mindazon embere támogatását, ai nélül e muna nem jöhetett volna létre. Mindeneelőtt a munámat befogadó intézménye vezetőine, Dr. Závodszy Péterne MTA SzBK Enzimológiai Intézet, Dr. Saradi Balázsna MTA-SE Membránbiológiai Kutatócsoport és Dr. Kellermayer Milósna SE Biofiziai és Sugárbiológiai Intézet, hogy a munámna hátteret biztosította. Köszönettel tartozom a PPKE-ITK részéről Dr. Rosa Tamásna és a PPKE-ITK dotori isola vezetőségéne, hogy lehetővé tetté a dotori isolában való részvételemet. Szeretném megöszönni témavezetőimne, Dr. Szilágyi Andrásna és Dr. Hegedűs Tamásna türelmes és itartó támogatásuat. Végül, de nem utolsósorban öszönettel tartozom ollégáimna, ai inspiráló légört nyújtotta a munához.

3 Tartalomjegyzé. Bevezetés Entrópiaszámolás A statisztius fiziai entrópia Belső és Descartes-féle oordinátarendszere Abszolút onfigurációs entrópiát számoló módszere..... ABC fehérjé ABC exportere felépítése és onformációi ABC exportere műödési mechanizmusa Moleuláris dinamiai számításo ABC fehérjéel Célitűzése Módszere Moleuláris dinamiai szimuláció Monte Carlo mintavételezés A teljes onformációhalmaz generálása és az egzat entrópia számolása Moleuláris soaságo előállítása A mintahalmaz centrálása Egyéb entrópiabecslő módszere implementálása Fehérjemodelle ABC fehérjé moleuláris dinamiai szimulációja A ölcsönös információ A onformációs entrópia becslése Gauss-everé függvénye használatával Eredménye A Gauss-everé módszer Moleuláris tesztrendszere generálása Az egzat onfigurációs entrópia és állapotösszeg iszámítása Monte Carlo mintavételezett soaságo entrópiája Moleuláris dinamiai soaságo entrópiája A Gauss-everé módszer összehasonlítása más módszereel Diszusszió: omplexitás, bővíthetőség, alalmazási lehetősége ABC exportere onformációina dinamiai összehasonlítása Eredménye A szimulációs rendszere felépítése A lipid ettősréteg viseledése ATP/ADP csere hatása a orrelált mozgásora A holo és az apo szerezete özötti onformációs átmenet jellemzése Az alul nyitott szerezet instabilitása Diszusszió Összefoglalás Függelé A Gibbs-eloszlás származtatása A onfigurációs és inetius entrópiajáruléo szétválasztása Publiáció jegyzée Irodalomjegyzé... 88

4 . Bevezetés Az elméleti fehérjevizsgálati módszere özül ülönösen a orai moleuláris dinamiai szimulációna fontos szerepe volt anna a paradigmaváltásna a megalapozásában, miszerint a fehérjé nem merev szerezetűe, hanem dinamiusan változó rendszere []. Azóta a moleuláris szimulációat széles örben alalmazzá ülönböző biomoleuláris rendszere és folyamato vizsgálatára. A módszer egyi legfőbb előnye, hogy atomi felbontású beteintést ad a rendszere időbeli és dinamiai műödésébe, amine segítségével a modellrendszerrel apcsolatos specifius érdése soszor önnyebben megválaszolhatóa, mint ísérleti módszereel []. Munámban egyrészt biomoleuláris rendszere entrópiájána szimuláció segítségével történő becslésével foglalozom, másrészt a szimulációs módszere egy onrét alalmazását mutatom be az ABC fehérjé alloszterius mechanizmusána vizsgálatára. A nyitott fiziai rendszereben lejátszódó spontán folyamato irányát a szabadenergia vagy szabadentalpia mennyiségéne változása határozza meg. Szintén ez a mennyiség az, amelye a rendszer egyensúlyi tulajdonságaival összefüggésbe hozható. A szabadenergia megváltozása a termodinamia alaptételei szerint egyrészt entalpius, másrészt entropius járuléoból származtatható. Amíg az entalpius tag értelmezhető a rendszer átlagenergiájána megváltozásaént, az entropius járulé az energia ülönböző szabadsági foo özötti eloszlásána megváltozásával apcsolatos, és elméleti úton soal nehezebben megragadható. Számításos szempontból az entalpia megbecslése gyaorlatilag a rendszer átlagenergiájána megfelelő pontosságú özelítésén múli, az entropius tag iszámítása során viszont a nehézség a onfigurációs entrópia, vagyis a rendszer számára rendelezésre álló onformációs állapoto számána megbecslésében rejli. Az entrópiaváltozás által hajtott folyamato esetén ezért nem csa preditív, hanem interpretatív értée is lehet azona a számításos módszerene, amelyeel ülönböző fiziai rendszere entrópiája megbecsülhető. Az egyes állapoto entrópiájána megismerése azért is érdees, mert folyamato esetén az entrópia viseledése gyaran beteintést ad a változás mechanizmusába és a folyamatot moleuláris szinten irányító legfőbb hatásoba. A fehérjé felgombolyodása során például az egyi fő vezérlő erő a hidrofób ölcsönhatás, amelyne alapja a víz entrópiaváltozása []. A onfigurációs entrópia változása a moleulá flexibilitásváltozásán eresztül a fehérje-fehérje ölcsönhatáso mechanizmusána megértését is segíti [3]. Hasonlóan, ismoleulá fehérjéhez ötődéseor ligandum-receptor rendszereben is so 4

5 esetben a ötődés termodinamiáját befolyásoló entrópiaváltozás a onformációs entrópia nagymértéű megváltozásával magyarázható [4, 5]. Az automatizált, számításos módszere egyúttal megteremti a ötődési entrópiaváltozás in silico megbecsléséne lehetőségét farmaológiailag érdees vegyülete esetében [4], amely elősegítheti hatéonyabb gyógyszere célzott tervezését. Egyensúlyi állapoto vizsgálata mellett az entrópia iszámításával aár ötődési reació sebességére is lehet öveteztetni [6]. A onfigurációs entrópia iszámítása elméleti modelle és moleuláris szimuláció segítségével ezért igen fontos, de nagy ihívást jelent. A moleuláris szimuláció fontos jellemzője, hogy a szimulációs rendszere és örülménye teljes mértében az irányításun alatt állna, így tetszőleges modellrendszere létrehozható, azo összehasonlítható. [] Ezzel szemben a vizsgált rendszere a valóságban átmeneti jellegűe, rövid életidejűe lehetne, vagy ísérletileg nehezen hozzáférhető []. Az integráns membránfehérjé ísérleti módszereel történő szerezeti és funcionális vizsgálatát több tényező is hátráltatja. Az egyi a membránfehérjé többségéne az alacsony termelődési szintje, expressziója. Emiatt rendszerint overexpressziós rendszert ell létrehozni, amely azonban a jelenlegi stratégiá esetén so finomhangolást igényel, mert a apott fehérje mennyisége és minősége nehezen megjósolható. Szintén so nehézség adódi a membránfehérjé amfipatius jellegéből, ami miatt ülönösen érzéenye a bioémiai örnyezetüre, és ezelésü, tisztításu rendívüli nehézségeel jár. E problémá miatt a membránfehérjéről viszonylag evés atomi felbontású szerezetet sierült megoldani jelenleg 7788 szerezetből 509 membránfehérje a Protein DataBan és a PDBTM adatbázis alapján [7], ahhoz épest, hogy a szevenált genomoban felfedezett géne majdnem harmada feltehetően transzmembrán fehérjét ódol. A rendelezésre álló, ristályosítással apott szerezete esetén is a fehérjéet membrán nélül, detergenseel stabilizáljá [8], ezért érdéses, hogy az így megoldott szerezet meora jósággal írja le a fehérje in vivo, membránbeli szerezetét. Ezen ísérleti nehézsége miatt előtérbe erülne azo az elméleti módszere, amelyeel egyrészt az egyes membránfehérjé szerezetére, másrészt a meglévő szerezete alapján azo műödésére lehet plauzibilis modelleet felállítani. Az alloszterius jelensége tanulmányozása esetén a moleuláris dinamiai szimuláció ülönösen hasznosna bizonyulta, hiszen a ülönböző, statius szerezete ismeretében rendszerint arra vagyun íváncsia, hogy egy ligandum beötődése hogyan induálja a fehérje átmenetét az egyi állapotból a másiba. Moleuláris szimuláció 5

6 segítségével bizonyos eseteben maga az átmenet is diret módon nyomonövethető, de a ligandum beötődése által oozott dinamiai hatáso, például a orrelált mozgásoban beövetező változáso is megfigyelhető [9]. Eze a jelensége ísérleti módszereel nehezen, vagy csa orlátozottan vizsgálható. Rendszerint a ísérlete nem adna atomi felbontású épet ezeről a dinamiai változásoról. Munám első részében egy új elméleti módszert íro le, amely Gauss-everé függvénye használatával épes moleulá onformációs entrópiáját megbecsülni. módszert összehasonlítom más, az irodalomban leírt és gyaran alalmazott módszereel. A másodi részben ABC transzporter fehérjé dinamiai leírásával foglalozom. Az ABC transzportere mind integráns membránfehérjé, mind allosztériusan műödő rendszere, hiszen az ATP ötődése és hidrolízise, és az anna hatására beövetező szubsztráttranszport egymástól fiziailag távoli helyeen megy végbe. Munám egyrészt beteintést ad az ATP hidrolízise során a orrelált mozgást végző aminosava mintázatában beövetező változásoba, másrészt felhívja a figyelmet a ísérletileg meghatározott szerezete értelmezése során felmerülő néhány veszélyre... Entrópiaszámolás... A statisztius fiziai entrópia A statisztius fiziában az entrópia mennyiségét a rendszer által az adott egyensúlyi maroszopius állapotban bejárt miroállapoto számából származtatjá. Ha a rendszer által egy adott állapotban elérhető miroállapoto száma Γ, aor a maroállapot entrópiája [0] S = B ln Γ ahol B a Boltzmann-állandó. Legegyszerűbb esetben, ha a rendszer izolált és energiája állandó, az entrópia iszámítható az adott energiájú állapotot megvalósító miroállapoto számával, S E = B ln Γ E ahol ΓE az E energiájú állapoto száma. Az ilyen rendszereet nevezzü miroanonius rendszerene. A statisztius fiziában valószínűségi változóént fogható fel az, hogy a rendszer éppen melyi miroállapotban tartózodi. Az imént tárgyalt izolált rendszere esetén, amior az energia állandó, nincs oun semmilyen a priori feltételezésre arról, hogy a rendszer melyi miroállapota valósul meg. Ezért mindegyi, az E energiát megvalósító A 6

7 miroállapot egyformán valószínű, és az információn hiánya a rendszer állapotáról maximális. Egy E energiájú állapot megvalósulásána valószínűsége ezért w E = Γ E 3 A biológiai rendszere általában nem izolálta, hanem egy nálu lényegesen nagyobb rendszerrel, az ún. termosztáttal termius ölcsönhatásba léphetne. Eor a részrendszer energiája változhat, és nem tudju a és 3 összefüggéseet alalmazni. Az viszont eor is feltételezhető, hogy a biológiai részrendszer és örnyezete, a termosztát, együttesen egy izolált rendszert alotna. A részrendszer által bejárt állapoto száma és az egyes állapoto előfordulási valószínűsége így megbecsülhető. Ha a teljes rendszer energiája E = E + E, ahol E az általun vizsgált részrendszer, E pedig a termosztát energiája, aor a részrendszer entrópiája S = B ln Γ = B ln w E 4 ahol we egy E energiájú állapot előfordulásána valószínűsége a részrendszerben. Ez utóbbiról megmutatható, hogy E T E E Z e = Z e w B β = 5 ahol bevezettü a β = / B T jelölést a levezetése a 7.. fejezetben található. Ez az ún. Gibbs-eloszlás, amelyne normálási fatora az állapotösszeg, vagy más néven partíciós függvény Z: Z = e E T Eze alapján a vizsgált részrendszer entrópiája a övetező alaba írható: B = e βe B B E S = ln w E = ln Z + β 7 Általános esetben is megmutatható, hogy az entrópia additivitása miatt az ln we csa az energiána lineáris függvénye lehet [0]. Ebben az esetben a 7 összefüggés átírható S = ln w E = ln w 8 B B E alaba, vagyis a részrendszer entrópiája iszámítható az eloszlásfüggvény logaritmusána negatív átlagaént. Az izolált rendszer esetén apott we eloszlást miroanonius eloszlásna, az állapoto olyan halmazát pedig, amelyben az egyes állapoto we gyaorisággal fordulna elő, miroanonius soaságna nevezzü [0]. Termosztált rendszer esetén a we Gibbs-eloszlást anonius eloszlásna, az ilyen gyaorisággal előforduló állapoto halmazát anonius soaságna nevezi [0]. 6 7

8 A statisztius fiziai entrópia és 8 formája so hasonlóságot mutat az információelméletben használt Shannon-entrópiával, ami egy adott p diszrét eloszlásra a övetező alaban definiálható: H p ln p 9 = A Shannon-entrópia értelmezhető úgy, mint egy adott valószínűségi változó véletlenszerűségét mérő mennyiség, vagy az átlagosan hiányzó információ mértée, ami ahhoz lenne szüséges, hogy megjósolju a valószínűségi változó értéét. Az entrópia ifejezésében szereplő I = ln p ez alapján a. állapot által hordozott információ mennyisége, avagy a meglepődésün mértée, amior megtudju, hogy a rendszer a. állapotban van []. Miroanonius rendszerere az információs entrópia a 9 és 3 ifejezése segítségével iszámítható: H = w E ln w E = ln = ln Γ E = S E / Γ E Γ E E = E E = E B 0 E = E mivel = Γ E éppen az E energiájú állapoto száma. Izolált rendszer esetén tehát a rendszer statisztius fiziai és információs entrópiája onstans szorzó erejéig megegyezi. A statisztius fiziai entrópia általános esetben is özvetlenül megfeleltethető az információs entrópiával, hiszen S = B ln w E = B E = E w E ln w E = H Klasszius rendszere esetén az állapottér folytonos, és a rendszer egy miroállapotána az egymással anoniusan onjugált oordinátá és impulzuso egy p, q értée felel meg. A diszrét állapotora bevezetett entrópia fogalma itt özvetlenül nem értelmezhető. Egy adott maroállapotot megvalósító miroállapoto Γ számána lasszius rendszerben egy p q fázistérfogat feleltethető meg, amely azonban nem tiszta szám, hanem 3N oordináta esetén a h Planc-állandó 3N-edi hatványával megegyező dimenziójú mennyiség. Eze alapján a tisztán lasszius formalizmus szerint definiált entrópia csa a mértéegysége választásától függő additív állandó erejéig meghatározott. Bizonyos egyszerű rendszerere az ún. vázilasszius és a vantummechaniai leírás összehasonlításával megmutatható, hogy a rendszer mozgása során bezárt fázistérfogat csa h egységeben növeedhet [0]. Enne az összefüggésne az általánosításával lasszius esetben a p q fázistérfogatban található állapoto számát a p q Γ = 3N h B 8

9 formában definiálhatju [0]. A diszrét eloszláso analógiájára bevezethető a ρp, q fázissűrűség, amely a rendszer egy adott p, q állapot örüli tartózodásána valószínűségsűrűségét jelöli. Klasszius esetben így a 8 összefüggés analógiájára egy részrendszer entrópiája megadható az 3N 3N S = ln h ρ = ρ ln h ρ dp dq 3 B B formában [0]. Termosztált rendszere esetén az előzőel teljesen analóg módon származtathatju a részrendszert leíró fázistérbeli Gibbs-eloszlást, amely ρ p, q Ebben már a lasszius állapotintegrál βe q Z = e p, dp dq βe p, q = ρ E = Z e 4 szerepel. A termosztált részrendszer entrópiája eze alapján a övetező formába írható: S = B 5 βe, 3, 3 Z e p q N βe p q N ln h Z e dp dq = B ln h Z + β E 6 A Shannon-féle információs entrópia szintén iterjeszthető folytonos eloszlásora az ún. differenciális entrópia fogalmával, amelyet a H diff = f x ln f x dx 7 ifejezés definiál egy folytonos fx valószínűségsűrűség-függvényre. Látható, hogy ez nem feleltethető meg özvetlenül a 3-ben apott lasszius entrópia ifejezésével, mert elhanyagolja a sűrűségfüggvény mértéegység-függését. A lasszius statisztius fiziai entrópia tehát a fázistérbeli eloszlás információs entrópiájától egy additív onstanssal ülönbözi, ami viszont függ a rendszer dimenziójától 3N. A differenciális információs entrópia mási fontos tulajdonsága, hogy a fiziai entrópiával szemben negatív értéet is felvehet. Egyre esenyedő eloszlás esetén a differenciális entrópia a mínusz végtelen felé divergál. Ez a matematiai divergencia a statisztius fiziai entrópia lasszius definíciója esetén is előfordulhat. Fiziai rendszere esetén ez a divergencia azzal magyarázható, hogy mérhetetlenül több információt ad a rendszer fázistérbeli p, q oordinátáina egzat ismerete, mint az, ha csa egy véges p q fázistérbeli térfogatban ismerjü biztosan az előfordulását. A lasszius entrópia efféle nem-fiziai viseledése arra hívja fel a figyelmet, hogy ebben a tartományban a lasszius fiziai állapoto definíciója nem illeszedi jól a maroszopiusan tapasztalt fiziai entrópia fogalmához. Az entrópia negatív értée statisztius fiziai értelemben azt jelentené, hogy a rendszer számára egynél evesebb állapot érhető el a fázistérben, vagyis az általa bejárt p q fázistérfogat isebb, mint h. Eor azonban a vázilasszius özelítés, amely alapján a összefüggést származtattu, már 9

10 nem érvényes. Szintén a lasszius ép ezen határait mutatja, hogy a Heisenberg-féle p q h határozatlansági összefüggés szerint a rendszer lasszius állapotána egzat megismerése a h méretű fáziscellán belül már nem lehetséges.... Belső és Descartes-féle oordinátarendszere Az atomi rendszere leírására a legáltalánosabban használt oordinátá az atomi háromdimenziós Descartes-oordinátá és az atomi impulzusvetoro halmaza. Ebben a oordinátarendszerben a megfelelő tér- és impulzusoordinátá anoniusan onjugálta, és a rendszer mozgási energiája egyszerű formát ölt. Moleuláris rendszere esetén a onformációs entrópia iszámítására azonban gyaran célszerűbb az ún. BAT bond-angletorsion oordinátarendszert használni, amely az atomo relatív pozícióját a ötéshossza, ötésszöge és a torziós szöge segítségével írja le. Enne a oordinátaválasztásna az előnye, hogy benne a rendszer potenciálisenergia-függvénye gyaran egyszerű alaot vesz fel, és az egyes szabadsági foona megfelelő energia- és entrópiajáruléo önnyen szétválaszthatóa. A 3N általános oordináta özül biztosan lesz 6, amely a rendszer teljes transzlációjával és rotációjával apcsolat szabadsági foona felel meg. Általánosságban a maradé 3N 6 oordinátát nevezhetjü belső oordinátána, mert értéü már csa az atomo egymáshoz viszonyított pozíciójától függ. A továbbiaban azonban a moleuláris onformáció leírására használt ötéshosszaat, ötésszögeet és torziós szögeet a BAT oordinátáat teintem belső oordinátána. A ötéshossza és a ötésszöge gyaran igen szű tartományban ingadozna, ami miatt az ebből adódó magas frevenciájú vibráció özel harmoniusna teinthető. Az ilyen oordinátáat emény szabadsági foona nevezzü. A emény szabadsági foo vibrációi legtöbbször abba a frevenciatartományba esne, ahol már szüséges a vantummechaniai leírásmód alalmazása. A özel harmonius mozgás miatt azonban ezene a szabadsági foona az entrópiajáruléa aár analitiusan is iszámítható. Konformációs entrópia számolásaor a emény szabadsági foo vibrációit több módszer teinti a moleula onformációjától független, és ezért elhagyható additív onstansna. Ezzel szemben más belső oordinátá, pl. a moleula elforgatható ötései mentén levő torziós szöge, széles tartományban változhatna, és gyaran nem harmonius mozgást végezne, eze a rendszer ún. puha vagy lágy szabadsági foai. A lágy szabadsági foo mentén a moleula rendszerint lassziusna teinthető mozgást végez. Mivel az ilyen oordinátá járuléa az entrópiához nehezen becsülhető az anharmonicitás miatt, ezért az entrópiaszámoló módszere gyaran fordítana erre foozott figyelmet. 0

11 A Descartes-oordinátáról belső oordinátára való áttérés során a dq elemi térfogat transzformációja miatt a onfigurációs integrálban lásd 84, 7.. fejezet megjeleni a transzformáció Jacobi-determinánsa. A Jacobi-determinánsról megmutatható, hogy a ötéshossza és a ötésszöge függvénye, és a Herschbach és munatársai által megadott módszerrel [] onstrutívan is iszámolhatóa. Mivel a Jacobi-determináns csa emény szabadsági foo értéétől függ, ezért a moleula onformációjától függetlenne teinthető. Számításaim során a Jacobi-determinánst a onfigurációs entrópiához járuló additív onstansna teintem, és nem veszem figyelembe...3. Abszolút onfigurációs entrópiát számoló módszere A szabadenergia számítására leggyarabban használt módszere a rendszer ét egyensúlyi állapota özötti szabadenergia-ülönbséget számoljá, ilyene pl. a termodinamiai integráció TI, [3], a szabadenergia-perturbáció FEP, [3, 4] és a hisztogramanalízis módszere [5]. Ezenél a módszerenél azonban a megfelelő pontosság elérése érdeében szüséges, hogy a rendszert egy vázisztatius útvonalon át vigyü egyi végállapotból a másiba. Az átmeneti útvonal definiálásaor ügyelni ell arra, hogy ellően sima legyen, és ne legyene benne nagy energetiai ugráso. A ét állapot özötti nagymértéű szerezeti ülönbség gyaran megnehezíti a számítást, néha az ilyen szimuláció nem is ivitelezhetőe [6]. Egy lehetséges megoldás az integrációs útvonal felállításána elerülésére, ha olyan módszert alalmazun, amellyel iszámíthatju a ét végállapot abszolút szabadenergiáját. A rendszer belső energiája iszámítható valamilyen moleuláris mechaniai erőtér force-field alapján, oldószer jelenléte esetén pedig a szolvatációs szabadenergia valamilyen implicit oldószermodellből pl. a gyaran használt MM/PBSA [7] származtatható. A rendszer teljes szabadenergiájána iszámításához ezen ívül meg ell becsülnün az oldott moleula entrópiáját is. Az entrópia inetius és onformációs járuléot is tartalmaz, amelye szétválaszthatóa, és a inetius járulé analitiusan is iszámítható lásd 7.. fejezet. A onformációs járulé azonban függ a moleulán belüli atomo özötti ölcsönhatásotól, iszámítása nem triviális feladat. A megoldás ulcsa ebben az esetben tehát egy hatéonyan műödő módszer, amely alalmas a onformációs entrópia becslésére például moleuláris dinamiai MD vagy Monte Carlo MC egyensúlyi szimuláció alapján. A onformációs entrópia iszámítására vonatozó egyi legorábbi módszer a váziharmonius özelítés [8], amely a moleula egyensúlyi állapotában bejárt bonyolult szerezetű energiafelszínt egy egyszerű, harmonius potenciállal özelíti. Ez a megözelítés

12 abból az ötletből származi, hogy a fehérjé és más, hasonlóan jól struturált biológiai maromoleulá az egyensúlyi állapotuban várhatóan is flutuációat végezne, miözben a szabadsági foo özötti orreláció várhatóan nagy mértéű [8]. A onfigurációs térbeli sűrűségfüggvényt ezért egy olyan függvénnyel érdemes özelíteni, amely világos apcsolatot létesít a rendszer entrópiája és az egyes szabadsági foo flutuációi és orreláltságu mértée özött. Az ezene a ritériumona megfelelő legegyszerűbb és legézenfevőbb függvényala a többváltozós Gauss-függvény T ρ q = exp q q σ q q 8 N π detσ ahol N a oordinátá száma, q az eredeti leírás szerint a rendszer fontos belső oordinátáit jelöli, σ pedig a oordinátához tartozó ovarianciamátrix, amelyet a σ = q q q q 9 ij i j j j ifejezés definiál. A többdimenziós Gauss-eloszlás paraméterei a oordinátá ovarianciamátrixából származtathatóa, és a onfigurációs entrópia ezeből analitiusan iszámítható az alábbi összefüggéssel [8]: π detσ N S conf = BN + B ln 0 A Gauss-függvény alaú eloszlás mögött egyúttal az a feltételezés rejli, hogy a rendszer egyetlen, loálisan minimális energiájú állapot örül harmonius flutuációat végez. A flutuációat meghatározó effetív potenciálfüggvény a oordinátá vadratius függvényeént megadható: E eff q = BT T q q q q σ bár az eredeti leírás is megjegyzi, hogy a σ orrelációs mátrix elemei valószínűleg erősen nem-triviális függést mutatna a hőmérsélettől. A ovarianciamátrix diagonalizálásával a ifejezés N tagra esi szét, amiből látszi, hogy a váziharmonius módszer a rendszert valójában N egymástól lineárisan függetlenül mozgó harmonius oszcillátorna teinti. A 8 összefüggés elvileg tetszőleges oordinátaválasztás esetén felírható. Az eredeti Karplus-módszer a belső oordinátá észletét használta, de ezene az azonosítása nagy rendszere esetén bonyodalmas lehet, és gyaran nem egyértelmű. Egyszerűbben ivitelezhető és ézenfevőbb a Descartes-oordinátá használata, ebben az esetben azonban megmutatható, hogy a rendszer transzlációs és forgatási invarianciája miatt a σ orrelációs mátrix szinguláris lesz [9], ami a rendszer túlhatározottságára utal. A Schlitter által

13 bevezetett módszer feloldja a szingularitás problémáját anélül, hogy ilépne a váziharmonius özelítés eretei özül [9]. A Schlitter-módszer a váziharmonius módszerhez hasonlóan a rendszert N független oszcillátorént modellezi, amelye entrópiáját azonban vantummechaniai leírás alapján becsli a vantummechaniai oszcillátor entrópiáját leíró α α Sqm = B ln e + B α e összefüggés segítségével, ahol α = βħω az oszcillátorra jellemző dimenziótlan mennyiség, és ω az oszcillátor frevenciája. A vantummechaniai entrópia a lasszius határesetben ħ 0 visszaadja a lasszius oszcillátor entrópiáját. A nagy frevenciájú emény móduso esetén a vantummechaniai ezelésmód megszünteti az entrópia lasszius divergenciáját a negatív végtelen felé, és a ifagyott szabadsági foo ω entrópiajáruléa is nullához fog tartani. A ifejezés azonban numeriusan nehezen ezelhető, ezért helyette Schlitter az = B e S ln + Sch 3 α ifejezést vezeti be, amely a vantummechaniai entrópia egy ad hoc felső becslése [9]. A módosítás előnye a numerius egyszerűsödés mellett, hogy az új ifejezés önnyebben általánosítható többdimenziós rendszerere. Ehhez az oszcillátor frevenciáját Schlitter a megfelelő oordináta varianciájából származtatta a lasszius határesetben érvényes evipartíciós tétel alapján, amely szerint majd ezt az entrópia 3 ifejezésébe behelyettesítve apta az S mω x = T 4 B Te ln + h = B B Sch m x 5 összefüggést. Az m<x > ifejezés a oordinátá tömeggel súlyozott varianciája, így a ézenfevő iterjesztés több dimenzióra enne a tömeggel súlyozott ovarianciamátrixszal való helyettesítése. Az ebből származó S Te lndet + h = B B / / Sch M σm ifejezésben M az atomi oordinátához tartozó tömege mátrixa, σ pedig a ovarianciamátrix. A determináns nem változi ortogonális transzformáció során, ezért a ifejezés tovább egyszerűsíthető az 6 3

14 S Sch = B + BTe lndet Mσ 7 h alara [9]. Ha olyan oordinátarendszert választun, amelyben a σ ovarianciamátrix diagonális, aor a 7 ifejezés több, 5 alaú ifejezés összegére esi szét, amelye az egyes főomponense mentén történő flutuáció entrópiajáruléai. A Schlitter-módszer ugyan egy ad hoc éplettel özelíti a rendszer entrópiáját, de megmutatható, hogy a vantummechaniai entrópia α szerinti sorfejtésével a 3 éplethez hasonló formulá családja állítható elő [0], és az ω frevenciá iszámításával az entrópia aár egzatul is megadható [0]. A Schlitter-módszerrel apcsolatban fontos megjegyezni, hogy a iindulásént használt és az eredményént apott 7 ifejezés a inetius és onfigurációs entrópiát egyaránt tartalmazza, emiatt a apott entrópiaértée teintetében özvetlenül nem hasonlítható össze a pusztán onfigurációs entrópiát számoló módszereel. Ez a ülönbség a módszere özött gyaran feledésbe merül, a módszere tárgyalásaor eveset hangsúlyozzá. A inetius entrópia, mivel nem függ az atomi onfigurációtól, ugyanazon rendszer ét állapota özötti entrópiaülönbség számolásaor iesi és nem ad járuléot, ezért a gyaorlati alalmazásban a jelenléte nem ooz gondot. Anna ellenére, hogy az abszolút entrópiaértée mégsem összehasonlítható a étféle típusú módszer esetén, informatívna tartottam a Descartes-oordinátáat használó módszereet is szerepeltetni a ülönböző módszere összehasonlításában, mert egyszerűségü miatt igen elterjedt a használatu. A váziharmonius özelítés jól használható abban az esetben, ha a moleuláris rendszer valóban egyetlen, minimális energiájú állapot örüli harmonius flutuációt végez. A legtöbb rendszer viszont ennél bonyolultabb felépítésű, a termius flutuáció során több, loálisan minimális energiájú állapotot is bejár, és eze örnyezetében sem feltétlenül érvényes a harmonius özelítés. Megmutattá, hogy ugyan az anharmonicitásból eredő hibá icsi [], a módszer jelentős hibát övet el azzal, hogy a váziharmonius móduso lineárisnál magasabb rendű orrelációit elhanyagolja []. Azora a rendszerere, amelye több loális energiaminimumot is meglátogatna a termius flutuáció öveteztében, a váziharmonius módszer jelentősen túlbecsülheti a onfigurációs entrópiát. Ilyen rendszere tipiusan a fehérjé, amelye natív állapotuban flexibilis huroat vagy szabadon forgó felszíni oldalláncoat is tartalmazna. Eze mozgása nem csa a rendszer hátterében rejlő energiafüggvény anharmonicitását türözi, de több szabadenergia-minimum jelenlétét is 4

15 5 mutatja a rendszerben. Emiatt a onformációs entrópia becsléséne pontosításához az állapottérbeli sűrűség pontosabb özelítésére van szüség. A váziharmonius módszer megjelenése óta számos, más elven műödő módszer látott napvilágot, amelye a váziharmonius módszer hibáit igyeezte iüszöbölni. A oordinátá özötti lineárisnál magasabb rendű orreláció figyelembe vehető az entrópia ölcsönös információn alapuló ifejtésével. A ölcsönös információ definíciója ét változó esetén,, q q S q S q S q q I + = 8 ahol S és S az együttes és az egyváltozós entrópia []. Független változó esetén az együttes entrópia a marginális, egyváltozós entrópiá összegére esi szét, ezért eor a ölcsönös információ értée nulla, egyéb esetben pedig pozitív érté. A ölcsönös információ és a marginális entrópiá ismeretében a változó együttes entrópiája a 8 ifejezés átrendezésével megadható:,, q q I q S q S q q S + = 9 Kettőnél több változó esetén a ölcsönös információ definíciója a 8 ifejezéssel analóg módon iterjeszthető, három változó esetén,,,,,,, q q q S q q S q q S q q S q S q S q S q q q I = = 30 illetve több változó esetén általánosan [] = < < + = N s l l l l s s q s q S q q I,,,, K K K 3 A 9 ifejezéssel analóg módon a rendszer teljes entrópiája több változó esetén is előállítható a ölcsönös információ segítségével, a 3 egyenlete átrendezésével < < < = + = j i j i j i j i N i i N q q q I q q I q S q q S K K,,,,, 3 3 alaban. A 3 összefüggés jelentősége, hogy apcsolatot teremt az együttes entrópia és a marginális S entrópiá özött. Ha a oordinátarendszert úgy vesszü fel, hogy a oordinátá ovarianciamátrixa diagonális legyen, aor látható, hogy a váziharmonius módszer csa a marginális entrópiáat, vagyis a 3 éplet jobb oldalána első tagját veszi figyelembe. Az elhagyott, ölcsönös információ jellegű tago a rendszer magasabb rendű orrelációiról tartalmazna információt, ami a övetező gondolatmenettel belátható. A ölcsönös információt evivalens módon definiálhatju [] az DOI:0.5774/PPKE.ITK.0.00

16 I ρ q, q ρ 33 q, q = q, q ln dq dq ρ q ρ q alaban is, ahol ρ az együttes, ρ pedig a marginális sűrűségfüggvénye. A 33 összefüggés nem más, mint a ét változót függetlenne teintő ρ q ρ q eloszlás és az együttes ρ q,q eloszlás özötti Kullbac-Leibler divergencia, vagyis a ölcsönös információ a független modell és a valódi eloszlás özötti információülönbséget méri. A 33 ifejezés általánosítható változóra olyan módon, hogy a független modell helyett a változó özös eloszlását az alacsonyabb rendű sűrűségfüggvényeből származtatju. Eze alapján a változó ölcsönös információja [] I q, K, q = ρ q, K, q ρ q, K, q ln dqi 34 ˆ ρ q, K, q i= Egyezést a ölcsönös információ orábbi, 3 definíciójával aor apun, ha a független modellt az ún. általánosított Kirwood-szuperpozíció özelítéssel GKSA [3] előállított sűrűségfüggvénnyel helyettesítjü, amely a változós sűrűségfüggvényt az alacsonyabb rendű sűrűségfüggvénye segítségével becsli a s+ ˆ ρ q, K, q = ρ s ql, K, q l s 35 s= l < K< ls ˆ q alaban, amely a ét változóra érvényes ρ q, q = ρ q ρ összefüggés általánosítása. A GKSA által adott sűrűségfüggvényről megmutatható, hogy az eggyel alacsonyabb rendű sűrűségfüggvénye ismeretében a legjobb özelítését adja a valódi sűrűségfüggvényne [4]. A. rendű ölcsönös információ tehát a 34 alapján azt az információmennyiséget méri, amely már nem állítható elő a. rendű eloszláso segítségével, vagyis a oordinátá özötti. rendű orreláció mértéét. A ölcsönös információn alapuló ifejtést MIE számos entrópiabecslő módszer felhasználja a másod- és magasabbrendű orreláció figyelembevételére. Az egyi ilyen a Numata és munatársai által létrehozott módszer, amely a váziharmonius módszerrel apott entrópiát iegészíti a móduso anharmonicitásáért és a özöttü fellépő másodrendű orrelációért felelős orreciós tagoal [5]. A Numata-módszer által számolt entrópia N i= S Numata = S qi, q j 36 qi I i< j amelyből a ölcsönös információt a módszer a 8 éplet alapján számolja, ezáltal csa egyváltozós és étváltozós együttes entrópia számolására van szüség. ρˆ Az eloszláso anharmonicitásána figyelembevételére a Numata-módszer a nem-paraméteres -legözelebbi 6

17 szomszéd -NN entrópiabecslést használja [6, 7]. A -legözelebbi szomszéd módszer az egyes adatponto helyén ad becslést a mintavételezett sűrűségfüggvényre az adatpont. legözelebbi szomszédjától való távolsága alapján, az formula segítségével, ahol f ˆ xi = 37 n V R V R s i, s i, j s / s π Ri, = Γ s + az s dimenziós, R i, sugarú gömb térfogata, R i, az i. adatpont és a. legözelebbi szomszédjána távolsága, n pedig az adatponto száma [6]. A sűrűségfüggvény alapján a teljes eloszlás entrópiája becsülhető a n n s / s nπ R i, lim ln fˆ xi = lim = + γ ln H L ln 39 n n n i= i= Γ s + ifejezés segítségével, amelyben H az egzat információs entrópia, a orreciós tago pedig j L 0 = 0, L j = i = / i, j, és γ = 0,577 az Euler-onstans [8]. Az eloszlás entrópiája 38 eze alapján n s / s nπ H NN = ln Ri, + ln L + γ 40 n i= Γ s + A legözelebbi szomszéd entrópiát számoló módszere előnye, hogy a mintát generáló eloszlás függvényalajára nem teszne a priori feltételezéseet, és nem használna paramétereet. Hátrányu viszont, hogy a onvergencia eléréséhez nagyszámú n ~ 0 6 mintára van szüség [9]. A minta mögött álló folytonos eloszlás megbecslésére más módszereet is alalmazna, pl. paraméteres becslést Fourier-soro segítségével [7], vagy anizotróp magfüggvényeel történő nem-paraméteres becslést [30], amelye a legözelebbi szomszéd módszerhez hasonlóan lassú onvergenciát mutatna. Egészen más megözelítést alalmazna Meirovitch és munatársai, ai egy omplex reonstruciós algoritmust használna az egyes onformáció valószínűségéne iszámítására [3-33]. Enne a módszerne viszont a megvalósítása örülményes, és igen nagy a számításigénye. A Wang és Brüschweiler-féle D entrópia módszere Gauss-magfüggvényeen alapuló sűrűségbecslést végez a onformációs térben, majd a differenciális entrópiát a 7 definíciója 7

18 alapján numerius integrálással számolja [34]. A módszer a torziós szögeet omplex oordinátáá alaítja, amivel iüszöböli a periodicitás problémáját, majd a számolást a q i i i i iϕ iϕ N = q, K, q = e, K, e 4 N i omplex adatpontoal végzi, ahol adatpontoat ezután a omplex ovarianciamátrix i ϕ j az i. adatpont j. torziós oordinátája. Az C ij iϕ iϕ i j iϕ iϕ i j = qiq j qi q j = e e e e 4 diagonalizálásával apott m főomponensere vetíti. A vetített c i = q i adatponto entrópiáját a módszer főomponensenént számolja i. A. főomponens esetén a i c adathalmazt a módszer a omplex sí feletti folytonos eloszlássá alaítja egy előre meghatározott σ varianciájú Gauss-függvénnyel történő onvolúcióval, és az így apott fˆ z = n n i= m e πσ i i z c z c σ sűrűségfüggvényne az entrópiáját a 7 definíció alapján a S = fˆ x + iy fˆ D, B ln x + iy dx dy 45 ifejezés numerius integrálásával apja. Az egy állapothoz tartozó S ref = B lnπeσ entrópiaértéet a módszer referenciaént ezeli, és levonja az egyes főomponensere számolt entrópiaértéeből. A teljes entrópia ezután az D = S D, S S 46 összefüggés alapján, az egyes főomponensere apott értée összegzésével apható. A D entrópia módszere már épes figyelembe venni az egyes főomponense mentén történő flutuáció anharmonicitását, azonban tartalmaz egy, a sűrűségbecslés sávszélességét meghatározó paramétert σ, amely nem vihető át ülönböző rendszere özött [34, 35]. ref 8

19 .. ABC fehérjé Az ATP-ötő azetta ATP Binding Cassette, ABC fehérjé egy főént membránfehérjéet tartalmazó, minden organizmusban jelen lévő fehérjecsalád, amelye fontos szerepet játszana ülönféle vegyületene biológiai membránoon való átjuttatásában [36]. Az ABC fehérjé megtalálható proariótában, a sejt számára alapvető tápanyago curo, aminosava, fémomplexe felvételére szolgáló importere és a áros anyago eltávolítására is épes exportere formájában. Euariótában csa ABC exporter fehérjé ismerte. Az emberi genomban eddig 49 ABC fehérjét azonosította [37], amelye számos ülönböző szubsztrát transzportjában veszne részt pl. foszfolipide, szterolo, gyógyszere, exotoxino [36]. Az ABC fehérjéne aár funcióju elvesztése, aár túlzott műödésü oozhat patológiás állapotot. Az ABC fehérjé többségében található mutáció ülönféle betegségeet oozhat, mint amilyen a cisztás fibrózis [38, 39], a Dubin-Johnson szindróma [40], a ettes típusú diabetes mellitus [4] vagy az adrenoleuodisztrófia [4]. A daganato emoterápiás ezeléssel szemben mutatott szélesörű ellenállóépességéne, multidrog-rezisztenciájána MDR egyi fő mechanizmusáért is ABC fehérjé felelőse [36, 43, 44]. A tumorsejte rezisztenciájána leggyaoribb oa a sejtből gyógyszere ipumpálására alalmas ABC transzportere megnöveedett expressziója. Ezene a transzporterene pl. P-glioprotein/multidrog-rezisztencia fehérje /MDR, MRP, BCRP/ABCG a szubsztrátspecificitása alacsony, ezért változatos émiai tulajdonságú vegyületeet tudna eltávolítani a sejtből, és így az egyes gyógyszere sejten belüli oncentrációját a hatásos szint alá csöentheti. A emoterápiás drogo és más, pl. idegrendszeri gyógyszere hatéonyságána a növeléséhez ívánatos lenne a drogrezisztenciát oozó ABC fehérjé műödéséne modulálása is moleulatömegű gátlószereel. Ehhez azonban az ABC exportere szerezeténe és műödéséne a részletes ismerete szüséges.... ABC exportere felépítése és onformációi Az ABC exportere membránba ágyazott fehérjé, amelye a citoplazmatius oldalon ét nuleotidötő domént NBD, a membránon belül pedig ét transzmembrán domént TMD tartalmazna [45, 46]. Bizonyos exportere esetén egy fehérjeláncon egy NBD és egy TMD található féltranszportere, más esetben egy láncon található mind a négy domén. ábra. A féltranszportere homo- vagy heterodimerént műödne [36]. Az exportfolyamatot az ATP nuleotidötő doménehez történő ötődése és/vagy hidrolízise 9

20 biztosítja. Az NBD- ét aldoménre osztható, amelye özül a Rec A típusú aldoménben [47] helyezedne el az ATP ötőhelyét alotó ún. Waler A és B motívumo [48], az α- heliális aldoménben pedig az ún. signature szevencia található. ábra [37]. A atalízis szempontjából nélülözhetetlen oldallánco találhatóa a Waler B és az ún. switch motívumban más néven H-huro [49]. Bioémiai és szerezeti vizsgálato megmutattá, hogy az ATP a Waler motívumohoz és a szemözti NBD-ben található signature szevenciához ötődi, és a beötődés az NBD- szoros asszociációját dimerizációját teszi lehetővé. ábra [50, 5]. A atalízishez végül a Waler B motívumban levő Glu oldallánc oordinálja a nuleofil támadást végző vízmoleulát, a H-huroban található His oldallánc pedig a γ-foszfát pozícionálásában vesz részt [5]. Az ATP-ötött holo állapotban a transzmembrán doméne citoplazmatius szaaszai is ontatusba lépne egymással, és egy ún. alul zárt onformációt alotna 3.A. ábra [53, 54]. Nuleotido hiányában a röntgendiffraciós szerezeteben az NBD- eltávolodást mutatna egymástól 3.B. és 3.C. ábra [54-56].. ábra. A multidrog-rezisztenciában szerepet játszó ABC exporter fehérjé felépítése. [36] A P- glioprotein P-gp és az MRP fehérje esetén a műödéshez szüséges doméne egy polipeptidláncon találhatóa. Az ABCG fehérje ún. féltranszporter, amely homodimerént műödi. A nuleotidötő doméne NBD mellett az ábrán a transzmembrán hélixe topológiája is látható. A TMD- egyenént 6 transzmembrán hélixet tartalmazna szüre téglalapo. Az MRP esetén az N-terminálison további 5 transzmembrán hélix található, amely azonban a transzporthoz nem szüséges [57]. A gliozilációs helyeet Y alaú jele mutatjá a fehérjeláncoon. 0

21 . ábra. ATP-ötött NBD dimer szerezete. PDB ID: IXF Az ábra az extracelluláris irányból nézve mutatja az NBD dimer fontosabb szerezeti elemeit. A Waler A, B sárga és é és a signature barna motívumo az ATP ötésében veszne részt, a switch motívum narancs és a D-huro piros az ATP hasításáért felelőse. Az X-huro rózsaszín és a Q-huro lila feltehetően NBD és a TMD özötti allosztérius ommuniációban veszne részt. A Q-huro tartalmazza az ATP és ADP megülönböztetésére alalmas Gln oldalláncot. Az ATP ötött onformációját pálciamodell mutatja, a ötött Mg + iono szüre gömböént láthatóa. Az NBD- helyzetétől függően megülönböztethetün egy ún. alul zárt 3.B. ábra és egy alul nyitott 3.C. ábra apo szerezetet. Az NBD- özötti távolság a jelenleg ismert három apo szerezete alapján széles tartományban mozoghat, az egér MDR3 fehérje esetében PDB ID: 3G5U az NBD- tömegözéppontjána távolsága 44,8 Å, az MsbA bateriális exporter alul zárt apo szerezetében PDB ID: 3B5X 4,3 Å, az alul nyitott szerezetében PDB ID: 3B5W még nagyobb, 74,8 Å. A megoldott szerezete sofélesége és ülönböző drogötődési vizsgálato is rávilágította arra, hogy az ABC transzportere nagyon flexibilise [58], ezért egyetlen statius onformáció, mint egy röntgendiffraciós szerezet, valószínűleg nem elegendő a fehérje szerezeténe leírására és a drogötőhelye azonosítására. Az ABC fehérjé dinamiai jellemzőit ezért ísérleti és elméleti módszereel egyaránt soat vizsgáljá, azonban a ísérleteből apott eredménye nincsene összhangban egymással és a ristályosítás során apott szerezeteel. Az utóbbi idősza egyi gyaran alalmazott ísérleti módszere az eletron paramágneses rezonancia EPR spetroszópia [59-6] és az EPR jelenségen alapuló dupla eletron-eletron rezonancia DEER spetroszópia [63], amellyel megmérhető ét spinjelölt aminosav távolsága a célfehérje ülönböző onformációiban. Az MsbA fehérjén végzett DEER mérése azonban azt mutattá, hogy az NBD- átlagos eltávolodása meghaladja azt, ami az alul nyitott röntgendiffraciós szerezeten is mérhető PDB ID: 3B5W [63]. Két adott oldallánc özötti

22 DOI:0.5774/PPKE.ITK.0.00 távolság émiai eresztötéssel cross-lining is megmérhető. Humán MDR fehérjén végzett eresztötési vizsgálato azt mutatjá, hogy ha a TMD- citoplazmatius szaaszaina távolságát isméretű émiai reagenssel rögzítjü, aor is atív marad [64]. A műödéshez ez alapján az NBD- túlzott eltávolodása sem szüséges, így tehát nem egyértelmű, hogy fiziológiás örülménye mellett az NBD- az apo állapotban mennyire távolodna el egymástól. Ugyanaor mindét ísérleti módszerne megvanna a maga orlátai, és nem adna atomi szintű információt a fehérjében történő mozgásoról. A legtöbb esetben eze a ísérleti módszere csa a fehérjében levő ét pont özötti távolságról adna információt ülönböző örülménye mellett pl. hőmérsélet, ATP vagy szubsztrát jelenléte vagy hiánya, míg a ét pont elmozdulásána irányát nem fedi fel. Az atomi felbontású számítógépes módszere ebben az esetben segíthetne a ísérleti adato értelmezésében. 3. ábra. ABC exportere onformációi. A jelenleg megoldott röntgendiffraciós szerezete alapján az ABC exporterene háromféle onformációja ismert. Nuleotid jelenlétében megfigyelhető az alul zárt holo forma PDB ID: HYD A, amelyben az NBD- szorosan özrefogjá a ötött nuleotidoat. Az apo forma esetén az alul zárt apo szerezetben PDB ID: 3B5X B az NBD- nincsene ontatusban egymással, de távolságu nem jelentős. Az alul nyitott apo szerezetben PDB ID: 3G5U C az NBD- eltávolodása jelentős, és a transzmembrán doméne citoplazmatius oldalán nagyméretű nyílás figyelhető meg. Az ábrán a Sav866, és MsbA bateriális és az egér MDR3 fehérjé láthatóa, háromféle orientációból. Referenciaént a membránnal párhuzamos ún. önyöhélixre fetetett piros nyíl szolgál. A membrán helyét szüre sáv jelöli.

23 ... ABC exportere műödési mechanizmusa Az ATP beötődése során a ét nuleotidötő domén szoros ölcsönhatásba lép egymással, amely megteremti az ATP hasításána a lehetőségét. Mivel mindét NBD tartalmaz nuleotidötő motívumoat, egy teljes transzporterben összesen ét ATP beötődésére és hasítására van lehetőség. A ét ATPáz hasítóhely műödési mechanizmusára többféle modell született [65]. Az ún. alternating sites modell [66] szerint a transzport során a ét nuleotidötő-hely felváltva erül egy olyan, az ATP-t erősen ötő állapotba, amely lehetővé teszi a nuleotid hidrolízisét. A modell szerint a hidrolízis után valószínűleg a eletezett töltése taszító hatására [50] az ATP ötőhely meggyengül és felnyíli, amely lehetővé teszi a nuleotid icserélődését az adott ötőhelyen. A szubsztrát transzportja a membrán túlsó oldalára a nuleotid hidrolízisével egyidőben történi. A hidrolizált nuleotid icserélődése özben a szemözti ötőhelyen létrejöhet az ATP-t erősen ötő onformáció, és egy újabb nuleotid elhasításával egy övetező szubsztrát transzportja is beövetezhet. Az viszont nem egyértelmű, hogy a felnyílás a ét NBD teljes disszociációjával jár-e, és hogy egy szubsztrát transzportjához mindét ATP elhasadása szüséges-e [66, 67]. Az irodalomban leírt mási modell a transzportmechanizmusra az ún. processive clamp műödés [68-70]. Ez a modell a ét ATP egymást övető elhasadását jósolja, amely után az NBD- disszociálna, és a transzporter az alul nyitott onformációt veszi fel. A szerezeteben megfigyelt aszimmetria miatt a ét nuleotid hidrolízise valószínűleg nem történi egyidejűleg. A processive clamp modellt azonban izolált NBD- vizsgálatával apott adato alapján állítottá fel, ezért elépzelhető, hogy nem türözi helyesen a teljes transzporterben végbemenő eseményeet. Multidrog exportereben a hidrolitius ativitást a transzportálandó szubsztrát beötődése rendszerint foozza, de a hidrolízis valószínűleg szubsztrát nélül is végbemehet, ami létrehoz egy ún. alapativitást. Mivel a transzportot az ATP beötődése és hidrolízise hajtja, az ATP ötőhely és a transzmembrán doméne özött ell, hogy legyen valamilyen ommuniáció. Az NBD és TMD özötti interfészben több olyan hurot és oldalláncot azonosította, amelyne szerepe lehet a transzporteren belüli ommuniáció megvalósításában. Az interfész egyi fontos régióját épezi az intracelluláris huro rövid szaaszai, az ún. coupling hélixe 4. ábra [53]. Eze a mindössze ét fordulatból álló hélixe a membránnal párhuzamos állásúa, és ét antiparallel hélixet ötne össze, amelye a transzmembrán hélixe intracelluláris meghosszabbításai. A coupling hélixe az NBD-en a Rec A-szerű és a heliális aldomén özötti ároban foglalna helyet, ezáltal létesítve 3

24 apcsolatot az NBD- és a TMD- özött [53]. Az NBD- oldalán a coupling hélixeel ölcsönható egyi fontos régió az ún. Q-huro. ábra, amely az ATP γ-foszfátjával és az ATP-hez ötött fémionnal egy onzervált Gln oldallánc segítségével létesít apcsolatot [53]. Ez az oldallánc épes a nuleotidötő-helyen levő ATP és ADP megülönböztetésére [7], ezért vélhetően a doméne özötti ommuniációban is fontos szerepet játszi. Az NBD- és TMD- özötti apcsolódási felület mási fontos régiója a nuleotidötő doméneben a signature szevencia N-terminális oldalán található ún. X-huro. ábra, amely az ABC fehérjé B és C családjában onzervált GERG szevenciamotívumot tartalmazza. Az X- huro a szemözti NBD Rec A-szerű aldoménhez apcsolódó coupling hélixszel lép ölcsönhatásba, és fontos szerepet játszi az ATP hidrolízis és a transzport csatolásában [7]. Szintén fontos szerezeti elem az alul zárt apo szerezetben található ún. tetrahélix-öteg, amely mindét TMD-ből a TM3 és TM4 transzmembrán hélixe citoplazmatius szaaszaiból áll [73]. Ez a négy hélix a transzporter hossztengelye mentén egy szoros hélixöteget alot, amely elzárja a citoplazmatius oldalon a transzporter belső csatornáját. Célzott targeted moleuláris dinamiai szimuláció azt mutatjá, hogy a tetrahélix-öteg szétesése a transzporter citoplazmatius felnyílásána egy lényeges lépése, amely az NBD- disszociációja után övetezi be [73]. Az ATP ötődéséne és hidrolíziséne a TMD onformációváltozásaihoz és a szubsztrát transzloációjához való csatolódásána megértése nagymértében segítené olyan drogo tervezését, amelyeel a transzporter műödése szabályozható lenne. 4. ábra. A coupling hélixe elhelyezedése. Az ábrán a ét NBD zöld és cián és a velü ölcsönhatásba lépő coupling hélixe narancs látható az extracelluláris irányból nézve a Sav866 fehérje szerezete PDB ID: HYD alapján. A coupling hélixe a transzmembrán doméne intracelluláris végeit átötő α-hélixe, amelye fontos szerepet játszana az NBD- és a TMD- özötti allosztérius ommuniációban. 4

25 ..3. Moleuláris dinamiai számításo ABC fehérjéel Az ABC fehérjé belső mozgásaina atomi felbontású felderítésére széles örben alalmazna moleuláris dinamiai MD szimulációat. Több számításos vizsgálat szól az ATP stabilizáló hatásáról csa izolált NBD dimereet tartalmazó rendszereben [67, 74-78]. Az NBD dimereel vagy monomereel ATP vagy ADP jelenlétében végzett szimuláció fényt derítene a hidrolízis által induált lehetséges onformációs változásora. Anna ellenére, hogy nincs egyértelmű utalás arra, hogy az egyi NBD-ben történt hidrolízis elősegíti vagy gátolja-e a szemözti trans ötőhelyen a hidrolízist [77, 78], a legtöbb szimulációs eredmény és félig nyitott röntgendiffraciós szerezet azt jelzi, hogy a heliális aldomén a trans NBD-ben ifelé fordul az ATP hidrolízise után [67, 74], ami elősegítené a nuleotid icserélődését. Ez a ifordulás a transz NBD-ben a Q- és X-huro együttmozgását jelentené, amiről ísérleti módszereel megmutattá, hogy fontos szerepet játszana a TMD felé történő ommuniációban [7, 79]. Kevés tanulmány számol be teljes hosszúságú ABC fehérjéel lipid örnyezetben végzett szimulációról, mivel a biológiailag releváns idősáláon való mintavételezés ilyen nagy rendszere esetén magas számítási teljesítményt íván. A bateriális B vitamin importer BtuCD rendszert iterjedten vizsgáltá MD szimuláció segítségével. Lipid ettősrétegben végzett 5 ns időtartamú szimulációal megmutattá, hogy az ATP ötődés az NBD-ben és a TMD-ben is induál onformációs változásoat, ami azt jelzi, hogy az ATP ötődés maga lehet a atalitius cilus hajtóereje [80]. Elasztius hálózati analízist és irányított moleuláris dinamiai szimulációat szintén alalmazta a B vitamin transzport lehetséges mechanizmusána feltárására [8]. A BtuCD rendszert részletesen vizsgáltá Ivetac és munatársai [8], ai moleuláris dinamiai számításo és főomponens-analízis segítségével aszimmetrius záródást mutatta i az ATP-ötött transzporter nuleotidötő doménjeiben, ami az ABC transzportere alternáló hidrolízis mechanizmusát [66] támasztja alá. A teljes Sav866 transzporterrel végzett szimuláció segítségével sierült rámutatni olyan oldalláncora a Q- és X-huroban, amelye egymástól függően több ülönböző onformációs állapotot is felvehetne, és ezáltal moleuláris apcsolóént továbbíthatjá a onformációs változásoat az NBD és a TMD özött [7]. Mindmáig azonban nem történt szisztematius vizsgálat az NBD-ben eredő és a TMD felé továbbított onformációs változáso teljes útvonaláról. Moleuláris dinamiai vizsgálatoat használta az ABC fehérjé globális stabilitásána és szerezeti integritásána felmérésére is. A mostanra visszavont MsbA 5