VACCINUM RABIEI EX CELLULIS AD USUM HUMANUM. Veszettség elleni vakcina, embergyógyászati célra (sejttenyészetekben előállított)

Átírás

1 Vaccinum rabiei ex cellulis ad usum humanum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur /2014:0216 VACCINUM RABIEI EX CELLULIS AD USUM HUMANUM Veszettség elleni vakcina, embergyógyászati célra (sejttenyészetekben előállított) DEFINÍCIÓ Az embergyógyászati célra, sejttenyészetekben előállított veszettség elleni (rabies) vakcina a fix veszettség vírus megfelelő törzséből előállított, fagyasztva szárított készítmény. A vírust szövettenyészeten szaporítják, és validált módszerrel inaktiválják. A vakcinát közvetlenül a felhasználás előtt, a feliraton feltüntetettek szerint kell reszuszpendálni; az így kapott tiszta vagy opálos folyadék sav-bázis indikátor jelenléte miatt színes lehet. ELŐÁLLÍTÁS ÁLTALÁNOS ELŐÍRÁSOK A vakcina előállítása vírus oltócsíra-rendszeren, illetve amennyiben a vírusszaporítás sejtvonal felhasználásával történik, sejtbank-rendszeren alapszik. Bizonyítani kell, hogy az előállítás módszere állandóan olyan vakcinát eredményez, amely megfelel az immunizáló képességre, az ártalmatlanságra és a stabilitásra vonatkozó követelményeknek. Indokolt és engedélyezett esetektől eltekintve, a kész gyártási tételben található vírus nem származhat az oltócsíra-törzstételtől számított nagyobb számú átoltásból, mint a klinikai vizsgálatokban a biztonságosság és hatásosság szempontjából megfelelőnek talált vírus, az átoltások száma azonban a hatóságilag jóváhagyott kivételes esetekben sem haladhatja meg az ötöt, a klinikai vizsgálatokban alkalmazott átoltási szinthez képest. Az előállítást validálni kell annak igazolására, hogy a termék, amennyiben vizsgálnánk, megfelelne az emberi felhasználásra szolgáló immunszérumokra és vakcinákra előírt abnormális toxicitási vizsgálat (2.6.9) követelményeinek. A VÍRUS SZAPORÍTÁSÁRA SZOLGÁLÓ SZUBSZTRÁTUM A vírust humán diploid sejtvonalon, az illetékes hatóság által elfogadott, folyamatosan fenntartott sejtvonalon (5.2.3), vagy meghatározott kórokozóktól mentes csirkeállományból származó csirkeembrió sejteken (5.2.2) szaporítják. OLTÓCSÍRA-TÉTELEK Az alkalmazott rabies vírustörzset az adott törzs eredetére és az izolálást követő műveletekre vonatkozó feljegyzések alapján azonosítják. Az oltócsíra-szaporítótétel az oltócsíra-törzstételből számított legfeljebb öt átoltásból készül. Vírusszaporításra csak az az oltócsíra-szaporítótétel alkalmas, amely megfelel az alábbi vizsgálatok követelményeinek. Azonosítás. A rabies vírust minden egyes oltócsíra-szaporítótételben fajlagos ellenanyagok felhasználásával kell azonosítani. Vírustartalom. A termelés állandóságának bizonyítására minden egyes oltócsíra-szaporítótétel vírustartalmát sejttenyészeten immunfluoreszcens módszerrel meg kell határozni.

2 Vaccinum rabiei ex cellulis ad usum humanum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Idegen kórokozók (2.6.16). Az oltócsíra-szaporítótétel feleljen meg a vírus oltócsíra-tételekre vonatkozó követelményeknek. Amennyiben a vírust egéragyban oltották át, speciális, egérvírusok kimutatására szolgáló vizsgálatokat kell végezni. VÍRUSSZAPORÍTÁS ÉS ARATÁS A sejtbankkal és az abból származó sejttenyészetekkel végzett valamennyi tevékenységet aszeptikus körülmények között kell végezni, olyan területen, ahol más sejtekkel nem dolgoznak. Jóváhagyott állati (de nem humán) szérum a tápfolyadékban használható, de az utolsó tápfolyadék, amely a vírusszaporítás során a sejttenyészet fenntartására szolgál, nem tartalmazhat állati szérumot. A tápfolyadékok humán albumint tartalmazhatnak. A sejtszuszpenziók és tápfolyadékok készítésénél használt szérum és tripszin igazoltan mentes legyen fertőző idegen mikroorganizmusoktól. A tápfolyadékok tartalmazhatnak savbázis indikátort, például fenolvöröst, és jóváhagyott antibiotikumokat, a legkisebb hatásos mennyiségben. A vakcina előállításához használt sejttenyészet legalább 500 ml-ét mint nem fertőzött (kontroll) sejtkultúrát félre kell tenni. A vírustartalmú folyadék egy vagy több alkalommal aratható az inkubáció ideje alatt. Az ugyanazon termelő sejttenyészetről folyamatosan leöntött aratások összegyűjthetőek és egyszeri különálló aratásnak tekinthetőek. Csak az az egyszeri aratás használható inaktivált vírusaratás előállítására, amely megfelel az alábbi követelményeknek. Azonosítás. Az egyszeri aratásban a rabies vírust fajlagos ellenanyagok felhasználásával kell azonosítani. Vírustartalom. A fertőző vírust szövettenyészeten kell titrálni, a titerérték a termelés állandóságának követésére alkalmas. Kontrollsejtek. Az egyszeri aratáshoz használt termelő sejttenyészet kontrollsejtjei feleljenek meg az azonosítás és az idegen kórokozókra vonatkozó vizsgálat (2.6.16) követelményeinek. TISZTÍTÁS ÉS INAKTIVÁLÁS A vírusaratás alkalmas eljárással koncentrálható és/vagy tisztítható. A vírusaratást validált módszerrel kell inaktiválni a folyamat jól meghatározott, mindig azonos szakaszában, a tisztítás és koncentrálás előtt, alatt, vagy után. A rabies vírus inaktiválás módszerének hatékonyságának bizonyítására, a vírus inaktíválását megelőző minden lépésénél biztosítani kell a vírus aggregálódásához vezető mindennemű körülmény elkerülését. A készítményben jelenlévő bármely inaktiválandó aggregátumot azonnal el kell távolítani az inaktiválási folyamat megkezdése előtt, például egy megfelelő szűrési módszerrel. A módszerről a folyamatvalidálási értékelő jelentésben igazolni kell, hogy állandóan hatékony a rabies vírus inaktiválására oly módon, hogy biztosítsa annak állandó immunogén aktivitását. Az állandóság kimutatása a következőkön alapul: - az inaktiválás kinetikája állandónak bizonyul legalább egymást követő 5 tétel esetén. A megfelelő időpontokban gyűjtött vírusmintákat egy érzékeny szubsztrátba beoltjuk az inaktiválási görbe létrehozásához. Amennyiben szükséges, az inaktiváláshoz használt ágenst oltás előtt semlegesítik; - a teljes inaktiváláshoz szükséges időtartamot, a követelt inaktiválási idő meghatározásához állapítjuk meg. A maradék fertőző vírus vizsgálatát alkalmazzuk erre a célra. A rutinszerű termeléskor alkalmazott teljes inaktiválási időtartamnak legalább kétszer annyinak kell lennie, mint amennyi a teljes vírus inaktiváláshoz szükséges. Amennyiben béta-propiolaktont használnak, annak koncentrációja a folyamat során nem haladhatja meg az 1:3500 V/V-t.

3 Vaccinum rabiei ex cellulis ad usum humanum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Csak az az inaktivált vírust tartalmazó szuszpenzió alkalmas letöltés előtti késztermék vakcina előállítására, amely megfelel az alábbi követelményeknek. Maradék fertőző vírus. A maradék fertőző rabies vírus kimutatására közvetlenül az inaktiválás végeztével, vagy az inaktiválás után azonnal lefagyasztott és 70 C-on tárolt mintából amplifikációs vizsgálatot kell végezni. Az inaktivált vírusszuszpenzió legalább 25 adag vakcinának megfelelő mennyiségét a vakcina termelésére használt sejttenyészettel azonos sejttenyészetre vagy más jóváhagyott sejttípusra kell felvinni. A vizsgálathoz használt sejteknek optimális érzékenységűnek kell lenni a maradék fertőző rabies vírusra való tekintettel, például Vero, BHK-21 vagy neuroblasztóma sejtekre, melyek az alkalmazható rabies vírusra köztudottan nagyfokú érzékenységgel bírnak. Más sejtek használata esetén azoknak legalább ugyanolyan fokú érzékenységgel kell rendelkezni, mint az erre a célra meghatározottaknak. Átoltás 7 nap elteltével végezhető. A tenyészeteket összesen 21 napig kell fenntartani, majd a sejttenyészetek rabies vírustartalmát immunfluoreszcens módszerrel vagy más összehasonlítható érzékenységű módszerrel kell vizsgálni. Az inaktivált, learatott vírus megfelel a vizsgálatnak, amennyiben nem mutatható ki replikálódó vírus. Maradék gazdasejt eredetű DNS. Amennyiben folyamatos sejtvonalat használnak a vírus szaporítására, a maradék gazdasejt eredetű DNS mennyisége egy alkalmas módszerrel meghatározva emberi adagonként legfeljebb 10 ng lehet. LETÖLTÉS ELŐTTI KÉSZTERMÉK VAKCINA A letöltés előtti késztermék vakcina egy vagy több inaktivált vírusszuszpenzióból készül. A letöltés előtti késztermék vakcinához jóváhagyott stabilizátor adható, annak érdekében, hogy a termék aktivitása a fagyasztva szárítás folyamata alatt és után megmaradjon. Csak az a letöltés előtti késztermék vakcina használható fel a kész gyártási tétel előállítására, amely megfelel az alábbi követelményeknek. Glikoprotein-tartalom. A glikoprotein-tartalmat megfelelő immunkémiai módszerrel (2.7.1), például egyszerű radiális immundiffúzióval, enzimhez kapcsolt immunszorbens meghatározással vagy ellenanyagkötő vizsgálattal kell meghatározni. A tartalomnak az adott termékre elfogadott határértékek közé kell esnie. Sterilitás (2.6.1). A letöltés előtti késztermék vakcina feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményeinek. A vizsgálatot minden táptalaj esetében 10 ml vakcinával végezzük. KÉSZ GYÁRTÁSI TÉTEL A letöltés előtti késztermék vakcinát aszeptikus körülmények között steril tartályokba töltik le, és a vakcina stabilitásának kedvező nedvességtartalom eléréséig fagyasztva szárítják. A tartályokat ezután úgy kell lezárni, hogy az anyag a szennyeződéstől és a nedvesség behatolásától védve legyen. Csak az a kész gyártási tétel szabadítható fel, mely megfelel az alábbi, Azonosítás, Vizsgálatok és Hatóérték-meghatározás pontokban előírt követelményeknek. Amennyiben a szarvasmarha szérumalbuminra vonatkozó vizsgálat a letöltés előtti késztermék vakcinában megfelelő eredménnyel zárult, ezek a vizsgálatok a kész gyártási tétel esetében elhagyhatók. AZONOSÍTÁS A vakcinában a rabies antigén megfelelő immunkémiai módszerrel (2.7.1), fajlagos, lehetőleg monoklonális ellenanyag alkalmazásával vizsgálva kimutatható a vizsgálat a vakcina azonosítására is használható.

4 Vaccinum rabiei ex cellulis ad usum humanum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur VIZSGÁLATOK Glikoprotein-tartalom. A glikoprotein-tartalmat megfelelő immunkémiai módszerrel (2.7.1), például egyszerű radiális immundiffúzióval, enzimhez kapcsolt immunszorbens meghatározással vagy ellenanyagkötő vizsgálattal kell meghatározni. A tartalomnak az adott termékre elfogadott határértékek közé kell esnie. Szarvasmarha szérumalbumin: legfeljebb 50 ng emberi adagonként, alkalmas immunkémiai módszerrel (2.7.1) meghatározva. Sterilitás (2.6.1). A vakcina feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményeinek. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint 25 NE egyszeri emberi adagonként. Pirogének (2.6.8). A pirogének vizsgálatát csak abban az esetben kell elvégezni, amennyiben a nem endotoxin jellegű pirogén anyagok jelenléte bizonyított. A vakcina feleljen meg a vizsgálat követelményeinek. Indokolt és engedélyezett esetek kivételével minden egyes nyúlnak 1 ml egyetlen humán adagot kell beadni a vakcinából, tízszeresére-százszorosára hígított térfogatban. Víztartalom (2.5.12): legfeljebb 3,0%. HATÓÉRTÉK-MEGHATÁROZÁS A veszettség elleni vakcina hatóértékét úgy határozzák meg, hogy az egereknek intracerebrálisan beadott veszettség vírus halálos adagja hatásának kivédéséhez szükséges adagot egy referenciakészítmény azonos védettséget nyújtó adagjával hasonlítják össze. Ehhez az összehasonlításhoz egy Nemzetközi Egységben kalibrált hatóértékű rabies vakcina referenciakészítmény és egy megfelelő, felülfertőzésre használható rabies víruskészítmény szükséges. Állatvédelmi okok miatt, alternatívaként a natív glikoprotein-tartalom meghatározására egy validált szerológia hatásvizsgálat vagy immunkémiai vizsgálat (2.7.1.) elvégzése javasolt. Az alternatív módszer validált a felülfertőzés vizsgálatra és az illetékes hatóság által, egy adott termékre elfogadott. A Nemzetközi Egység a Nemzetközi Standard meghatározott mennyiségének aktivitása. A Nemzetközi Standard Nemzetközi Egységben kifejezett egyenértékét az Egészségügyi Világszervezet (WHO) állapítja meg. A következőkben leírt felülfertőzési vizsgálat a párhuzamos egyenesek módszerét használja, a vizsgálandó vakcina, illetve a referenciakészítmény esetében egyaránt legalább három-három pontot felvéve. Amennyiben az analitikusnak egy adott vakcinára vonatkozóan már van tapasztalata a módszerrel, egyszerűsített vizsgálat is végezhető, a vizsgálandó vakcina és a referencia készítmény egyetlen hígítását alkalmazva. Az ilyen vizsgálat lehetővé teszi az analitikus számára annak megállapítását, hogy a vakcina hatóértéke a megkövetelt legalacsonyabb értéknél szignifikánsan nagyobbe, de nem ad teljes körű felvilágosítást az egyes egyedi hatóérték meghatározások érvényességéről. Az egyetlen hígítást alkalmazó egyszerűsített vizsgálat ugyanakkor lehetővé teszi a vizsgálathoz szükséges állatok számának jelentős csökkentését, és ezt a Kísérleti és egyéb tudományos célokra felhasznált gerinces állatok védelméről szóló európai egyezmény (European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes) rendelkezéseivel összhangban minden laboratóriumnak figyelembe kell vennie. A vizsgálati állatok kiválasztása és csoportosítása. A vizsgálathoz kb. 4 hetes, egészséges, g súlyú, azonos tenyészállományból származó nőstény egereket használunk. Az egereket hat, a vizsgálat érvényességéhez elegendő számú egyedből álló csoportra osztjuk, illetve a felülfertőző szuszpenzió titrálására négy darab, öt egyedből álló csoportot hozunk létre.

5 Vaccinum rabiei ex cellulis ad usum humanum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur A felülfertőző szuszpenzió elkészítése. Az egereket a veszettség vírus CVS törzsével intracerebrálisan oltjuk, és amikor az egerek már a veszettség tüneteit mutatják, de még mielőtt elhullanának, leöljük az állatokat, eltávolítjuk az agyukat, és az agyszövetből megfelelő hígító folyadékban homogenizátumot készítünk. A durva darabos részeket centrifugálással eltávolítjuk, és fertőző szuszpenzióként a felülúszó folyadékot használjuk. A szuszpenziót kis térfogatokban ampullákba osztjuk, leforrasztjuk, és 60 C alatti hőmérsékleten tároljuk. A szuszpenzióból egy ampullányit felolvasztunk, és megfelelő hígító folyadékban hígítási sorozatot készítünk belőle. Mindegyik hígítással egy öt egérből álló csoportot intracerebrálisan oltunk. Az adott hígításból minden egyes egérnek 0,03 ml-t adunk be. Az állatokat 14 napon át megfigyelés alatt tartjuk. Az 5. és a 14. nap között elhullott, vagy a veszettség jeleit mutató állatok száma alapján kiszámítjuk az egyes hígításokból a hígítatlan szuszpenzió LD 50 értékét. A vizsgált vakcina hatóértékének meghatározása. A vizsgálandó vakcinából, illetve a referenciakészítményből egyaránt három hígításból álló, ötszörös léptékű hígítási sorozatot készítünk. A hígításokat olyan módon készítjük el, hogy azok, amelyek a vakcina legnagyobb mennyiségét tartalmazzák, várhatóan a vele oltott állatoknak több mint 50%-át megvédjék, azok pedig, amelyek a legkisebb mennyiséget tartalmazzák, az oltott állatoknak várhatóan kevesebb, mint 50%-át védjék meg. Az így elkészített hat hígítást hat állatcsoporthoz rendelve, minden egyes állatnak 0,5 ml-t adunk be intraperitoneálisan az illető csoporthoz rendelt hígításból. 7 nap elteltével a vizsgálandó vakcinából, illetve a referenciakészítményből a fentiekben leírtak szerint újra három-három, a korábbival azonos hígítást készítünk, és az oltásokat ezen hígításokkal megismételjük. A második oltást követően 7 nappal a felülfertőző vírusból szuszpenziót készítünk olyan módon, hogy az előzetes titrálás alapján a szuszpenzió 0,03 ml-enként kb. 50 LD 50-nel egyenértékű mennyiséget tartalmazzon. Minden egyes vakcinázott egérnek ebből a szuszpenzióból intracerebrálisan 0,03 ml-t adunk be. A felülfertőző szuszpenzióból három megfelelő hígításból álló sorozatot készítünk. Az öt-öt egeret tartalmazó négy kontrollcsoporthoz 1-1 hígítást rendelünk hozzá, és az egereket a megfelelő hígítás 0,03 ml-ével intracerebrálisan oltjuk. Mindegyik csoportot 14 napon át megfigyelés alatt tartjuk, és csoportonként feljegyezzük az elhullott vagy a veszettség tüneteit mutató állatok számát a fertőzést követő 5. és 14. nap között. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, amennyiben mind a vizsgált vakcina, mind a referenciakészítmény esetében, az 50%-os védelmet nyújtó adag az egereknek beadott legnagyobb és legkisebb adagok értékei között van a felülfertőző szuszpenzió titrálása azt mutatja, hogy a szuszpenzió 0,03 ml-e legalább 10 LD 50-et tartalmaz a statisztikai elemzés szerint a dózis-válasz görbék meredeksége szignifikáns, és eltérésük a linearitástól és a párhuzamosságtól nem szignifikáns a konfidenciaintervallum (P = 0,95) a becsült hatóérték %-a közé esnek. A vakcina megfelel a vizsgálat követelményeinek, ha a becsült hatóérték legalább 2,5 NE emberi adagonként. Alternatív végpontok alkalmazása. Amennyiben valamely laboratórium a fenti vizsgálati módszert rutinszerű alkalmazásra meghonosította, az elhullás, mint végpont, helyettesíthető a klinikai tünetek megfigyelésével, így az elhullás időpontjánál korábbi végpont alkalmazásával az állatok szenvedése lerövidíthető. Az alábbiak példaként szolgálhatnak. Az intracerebrális oltást követően a veszettség-fertőzés kifejlődése egerekben a klinikai tünetek alapján 5 fokozattal jellemezhető: 1. fokozat: felborzolt szőr, púpos hát,

6 Vaccinum rabiei ex cellulis ad usum humanum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur fokozat: lelassult mozdulatok, az éberség csökkenése (előfordulhatnak körkörös mozdulatok), 3. fokozat: rázó mozgás, reszketés, rángások, 4. fokozat: bénulásszerű állapot és bénulás tünetei, 5. fokozat: moribund állapot. Az egereket a fertőzés utáni 4. naptól kezdve legalább naponta kétszer meg kell figyelni. A klinikai tüneteket a táblázathoz hasonló táblázatban kell feljegyezni. A tapasztalatok azt mutatják, hogy a 3. fokozat végpontként való alkalmazásával egyenértékű vizsgálati eredményeket kapunk, mint ha az elhullást alkalmazzuk végpontként. Ezt minden laboratóriumban igazolni kell megfelelő számú, mind a klinikai tüneteket, mind az elhullást, mint végpontot alkalmazó vizsgálat pontozása alapján táblázat. - Példa a veszettség elleni vakcina hatóértékének megállapítására szolgáló vizsgálat klinikai tüneteinek feltüntetésére szolgáló táblázatra Napok a fertőzés után Klinikai tünetek Felborzolt szőr, púpos hát Lelassult mozdulatok Az éberség csökkenése Körkörös mozgás Rázó mozgás Reszketés Rángások Bénulásszerű állapot Bénulás Moribund állapot FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni a vakcina készítéséhez használt sejtek biológiai eredetét.