IMMUNOGLOBULINUM ANTI-T LYMPHOCYTORUM EX ANIMALE AD USUM HUMANUM. Humán felhasználásra szánt, állati eredetű anti-t limfocita immunglobulin

Átírás

1 ex animale ad usum humanum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur /2013:1928 IMMUNOGLOBULINUM ANTI-T LYMPHOCYTORUM EX ANIMALE AD USUM HUMANUM Humán felhasználásra szánt, állati eredetű anti-t limfocita immunglobulin DEFINÍCIÓ A humán felhasználásra szánt állati eredetű anti-t limfocita immunglobulin steril folyékony vagy fagyasztva szárított készítmény, amely humán limfocita antigénnel immunizált állatok, főként nyulak vagy lovak savójából vagy plazmájából nyert immunglobulinokat tartalmaz. Az immunglobulin azzal a tulajdonsággal rendelkezik, hogy az immunkompetens sejtek, elsősorban a T- limfociták számát és funkcióját csökkenti. A készítmény elsősorban immunglobulin G-t tartalmaz. Tartalmazhat más limfocita alpopulációk illetőleg más sejtek elleni ellenanyagokat is. A készítmény, adott esetben megfelelő oldószerrel történő hígítás után, intravénás alkalmazásra készül. A készítmény tartalmazhat segédanyagokat, pl. stabilizálószereket. Az állati eredetű Embergyógyászati immunszérumok (0084) cikkely vonatkozó rendelkezéseinek felsorolását lásd alább. ELŐÁLLÍTÁS ÁLTALÁNOS RENDELKEZÉSEK Az előállításra alkalmazott módszer bizonyítottan alkalmas legyen emberben ártalmatlan és hatékony, továbbá stabil immunglobulinok megbízható kinyerésére. Az előállítás során felhasznált bármilyen biológiai eredetű reagensnek baktérium-, gomba- és vírusszennyezéstől mentesnek kell lennie. Az előállítási eljárásnak tartalmaznia kell olyan lépést, vagy lépéseket amelyek alkalmasnak bizonyultak az ismert kórokozók kiküszöbölésére vagy inaktiválására. A kifejlesztési vizsgálatok során igazolni kell, hogy az előállítási eljárás olyan terméket eredményez, amellyel kórokozók nem vihetők át; amelyet meghatározott immunológiai aktivitások sora jellemez, nevezetesen: antigén-kötés, komplement-függő és -független citotoxicitás, citokin felszabadulás, T-sejt aktiválás megindítása, sejthalál előidézése; amely nem tartalmaz olyan ellenanyagokat, amelyek humán szövetekkel olyan mértékű keresztreakciót adnak, amely a klinikai ártalmatlanságot veszélyeztetné; amelynek trombocita-elleni ellenanyag tartalma felső határértékhez kötött; amelynek hemoglobin tartalma felső határértékhez kötött. Állatokon végzett megfelelő vizsgálatok és a klinikai vizsgálatok értékelése alapján a készítmény jól tolerálhatónak bizonyult.

2 ex animale ad usum humanum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Referencia készítmény. Az a gyártási tétel, amely a vizsgálat érvényességének meghatározásánál megfelelőnek bizonyult, és amelynek hatékonysága klinikai kipróbálásokban bizonyítást nyert, vagy ennek gyártási tétele. ÁLLATOK Az illetékes hatóság által engedélyezett fajból származó, egészséges, és kizárólag a T -limfocita elleni ellenanyag termelésére fenntartott állatok használhatók fel. Az állatoknak kivizsgáltnak és igazoltan menteseknek kell lenniük bizonyos, tételesen felsorolt kórokozóktól. Az állatok zárt állományba (telepbe) történő bevonása meghatározott eljárásokat követve történik, beleértve a karantén körülményeinek meghatározását is. Ahol ez célszerű, a tenyészállomány kialakítására és fenntartására használt létesítmény földrajzi elhelyezkedéstől függően, további specifikus kórokozókra történő vizsgálatot is fontolóra kell venni. Az állatok táplálékának ellenőrzött forrásból kell származnia, és a táplálékhoz nem lehet állati fehérjét adni. Az állatok szállítóinak az illetékes hatóság igazolásával kell rendelkezniük. Amennyiben az állatokat antibiotikumokkal kezelték, megfelelő várakozási időnek kell eltelnie a vér, illetve plazma gyűjtése előtt. Az állatokat nem szabad penicillin, illetve penicillinszármazék antibiotikumokkal kezelni. Amennyiben élő vakcinát adnak be, a vakcinázás és az immunglobulin termelésre gyűjtött savó illetve plazma levétele között megfelelő várakozási időt kell beiktatni. Az állatok faját, eredetét és azonosító számát specifikálni kell. IMMUNIZÁLÁS A felhasznált antigéneket adott esetben azonosítani és jellemezni kell. Az antigéneket nevük, és gyártási tételük száma szerint kell azonosítani; eredetüket és készítésüket fel kell jegyezni. A kiválasztott állatokat legalább 1 héttel az immunizálás előtt elkülönítik, és a meghatározott immunizálási rend szerint, megfelelő időközönként ismétlő oltásokkal immunizálják. Adjuvánsokat lehet alkalmazni. Az állatokat általános egészségügyi felügyelet alatt tartják és a fajlagos ellenanyagok termelését minden egyes immunizálási ciklusnál ellenőrzik. A vér, illetve a plazma gyűjtése előtt az állatokat alaposan meg kell vizsgálni. Ha az állatok bármilyen, nem az immunizálási eljárással kapcsolatos, kóros elváltozást mutatnak, sem ezek, sem bármelyik, az érintett csoporthoz tartozó más állat nem használható fel, kivéve, ha nyilvánvaló, hogy felhasználásuk nem rontja a termék ártalmatlanságát. Az állatok immunizálására humán antigéneket, például folyamatos T-limfocita sejtvonalakat vagy timocitákat használnak. A sejtek megfelelő kiválasztási eljárásnak vethetők alá. Az immunizáló antigének legyenek fertőző kórokozóktól mentesek, a mentességet vérben előforduló patogén, elsősorban hepatitis B vírusra (HBV), hepatitis C vírusra (HCV) és humán immunhiányt okozó vírusra (HIV), valamint egyéb, az antigén előállítás kapcsán előforduló releváns kórokozókra validált módszerekkel igazolva. A felhasznált sejteknek meg kell felelniük a sejtpopuláció tisztaságára, valamint az esetleges szennyezőként szóba jöhető kórokozóktól való mentességre vonatkozó meghatározott követelményeknek. VÉR ILLETVE PLAZMA GYŰJTÉSE A vér illetve a plazma gyűjtését vénaszúrással vagy plazmaferezissel végzik. A vénaszúrás helyét leborotválják, megtisztítják és fertőtlenítik. Az állatokat lehet érzésteleníteni, de csak olyan módon, hogy az a termék minőségét nem befolyásolja.

3 ex animale ad usum humanum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur A plazma- és savómintákhoz nem adható mikrobiológiai tartósítószer. A vért, illetve a plazmát olyan módon gyűjtik, hogy a termék sterilitása megmaradjon. A vér illetve a plazma gyűjtését az állatok tartási vagy tenyésztési területétől, és az immunglobulinok tisztítására használt területtől egyaránt elkülönítve kell végezni.. Amennyiben a savót vagy a plazmát a további feldolgozás előtt tárolják, óvintézkedéseket kell tenni a mikrobiológiai szennyezés elkerülésére. A tisztítás előtt az egyes plazma- vagy szérummintákat össze lehet önteni. Az egyedi, illetve a kevert mintákat a tisztítás előtt a következő vizsgálatoknak kell alávetni. Szennyező vírusokra végzett vizsgálatok. Minden keverék mintát megfelelő in vitro módszerekkel kell vizsgálni, beleértve az illető készítmény szempontjából lényeges vírusok széles körének kimutatására alkalmas sejttenyészetekre történt oltást. Adott esetben a szennyező vírusok kimutatására alkalmas vizsgálatot az adszorbeált, keverék mintákon, a gyártás utolsó olyan fázisa után végzik el, amelynél vírusszennyezés kerülhet az anyagba. TISZTÍTÁS ÉS VÍRUS INAKTIVÁLÁS Az immunglobulinokat részleges kicsapással, kromatográfiás úton, immunadszorpcióval vagy más megfelelő kémiai vagy fizikai módszerekkel töményítik és tisztítják. A módszerek kiválasztásával és validálásával kell biztosítani, hogy minden egyes feldolgozási lépésnél elkerüljék a szennyeződést, illetve olyan fehérje-aggregátumok képződését, melyek a készítmény immunbiológiai jellemzőit befolyásolják. Indokolt és engedélyezett esetek kivételével, a vírusok eltávolítására és/vagy inaktiválására validált módszereket kell alkalmazni. A tisztítás és a vírusok eltávolítását és/vagy inaktiválását célzó kezelés után a köztitermékhez stabilizátor adható. A köztitermék a stabilitási adatok alapján megállapított ideig tárolható. Csak olyan köztitermék használható a letöltés előtti késztermék előállítására, amely a következő követelményeknek megfelel. Ha az előállítási módszer tartalmaz olyan lépést a keresztreakciót adó anti-humán ellenanyag adszorbeálására, amely során emberi szövetből és/vagy vörösvérsejtből szármázó anyagot használnak fel, indokolt és engedélyezett esetek kivételével, az emberi eredetű anyagot a kórokozók inaktiválására szolgáló validál módszerrel kell kezelni. Ha az adszorpcióhoz vörösvérsejteket használnak, a vörösvérsejtdonorok feleljenek meg a Humán plazma frakcionálás céljára (0853) c. cikkelyben a vér- és plazmadonorokkal szemben támasztott követelményeknek. Ha más emberi eredetű anyagot használnak fel, az feleljen meg a vérben előforduló, fontosnak tartott kórokozóktól, nevezetesen HBV-től, HCV-től és HIV-től való mentesség követelményének. Ha a vírusok inaktiválására, vagy eltávolítására valamilyen anyagot használnak, ennek maradványai a végtermékben nem válthatnak ki semmiféle mellékhatást az anti T limfocita immunglobulinnal kezelt betegekben. LETÖLTÉS ELŐTTI KÉSZTERMÉK A letöltés előtti készterméket vagy egy köztitermékből, vagy azonos fajú állatokban nyert köztitermékek keverékéből készítik. A gyártási eljárás során, vagy a letöltés előtti késztermék oldat előállítása során a termékhez mikrobiológiai tartósítószer nem adható. A gyártási eljárás során az oldatot baktériumszűrőn bocsátják át.

4 ex animale ad usum humanum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur KÉSZ GYÁRTÁSI TÉTEL A letöltés előtti anti T limfocita immunglobulin készterméket aszeptikus körülmények között, steril, garanciazáras tartályokba töltik. A tartályokat a szennyeződés elkerülése céljából lezárják. Csak olyan kész gyártási tétel kerülhet forgalomba, amely megfelel az Azonosítás, a Vizsgálatok és a Hatóértékmeghatározás címszó alatt leírt követelményeknek. SAJÁTSÁGOK KÜLLEM: FOLYÉKONY KÉSZÍTMÉNY: TISZTA VAGY ENYHÉN OPÁLOS, SZÍNTELEN VAGY HALVÁNYSÁRGA FOLYADÉK; LIOFILIZÁLT KÉSZÍTMÉNY: FEHÉR VAGY ENYHÉN SÁRGA POR VAGY TÖRÉKENY, SZILÁRD TÖMEG, AMELY FELOLDVA FOLYÉKONY KÉSZÍTMÉNYT AD AZ ALÁBBI LEÍRÁSNAK MEGFELELŐEN. AZONOSÍTÁS A. A vizsgálandó készítmény precipitációs vizsgálatát megfelelő fajspecifikus antiszérumokkal végezzük el. A vizsgálat elvégzéséhez ajánlatos az illető ország minden egyes, biológiai eredetű anyagok előállítására használt háziállat fajából származó fajlagos plazmafehérjék, valamint a humán plazmafehérjék elleni specifikus szérumokat használni. A készítményben legyenek kimutathatók az anti T limfocita immunglobulin termelésére használt állatból származó fehérjék. B. A készítményt megfelelő immunelektroforézis technikával vizsgáljuk. A vizsgálandó készítményt és a készítmény előállítására használt állatok normál savóját hasonlítjuk össze, melyeket olyan töménységűre hígítunk, hogy azok a gélen jól látható gammaglobulin ívet adjanak. A vizsgálathoz a készítmény előállítására használt állatok normál savója elleni antiszérumot használnak. A vizsgálandó készítmény fő összetevője feleljen meg az előállításra használt állat normál savója IgG összetevőjének. C. A készítmény feleljen meg a vizsgálatokban előírt követelményeknek. VIZSGÁLATOK Oldhatóság. A feliraton szereplő mennyiségű folyadékot hozzáadjuk a fagyasztva szárított készítményt tartalmazó tartályhoz. A készítmény a feliraton meghatározott időn belül teljesen oldódjon fel. Kivehető térfogat (2.9.17) A készítmény feleljen meg a kivehető térfogatra vonatkozó követelménynek. ph (2.2.3) A ph legyen az illető készítményre elfogadott ph érték határértékén belül. Ozmolalitás (2.2.35): Adott esetben a feloldás után az ozmolalitás legalább 240 mosmol /kg legyen. Fehérjék (2.5.33): A fehérjék mennyisége a feliraton megadott mennyiség %-a legyen. Stabilizátor. A stabilizátor mennyiségét alkalmas fizikai-kémiai módszerrel határozzuk meg. A készítmény a feliraton megadott mennyiség legalább 80 %-át, de legfeljebb 120 %-át tartalmazza.

5 ex animale ad usum humanum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Molekulaméret eloszlás. Méretkizárásos kromatográfiás vizsgálatot végzünk (2.2.30). Vizsgálati oldat. A vizsgálandó készítményt 0,9 g/l R nátrium kloriddal az alkalmazott kromatográfiás rendszernek megfelelő koncentrációra hígítjuk. A 2-20 g/l tartományban levő koncentráció általában megfelelő. Összehasonlító oldat. A BRP humán immunoglobulint (molekulaméret) 0,9 g/l R nátrium kloriddal ugyanolyan fehérjekoncentrációra hígítjuk, mint a vizsgálati oldatot. Oszlop: méretei: magasság: 0,6 m, átmérő: 7,5 mm, állófázis molekulatömegű globuláris fehérjék elválasztására alkalmas minőségű R méretkizárásos kromatográfiás célra szánt szilikagél. Mozgófázis: 4,873 g R dinátrium-hidrogénfoszfát-dihidrátot, 1,741 g R nátrium-dihidrogén-foszfátmonohidrátot és 11,688 g R nátrium kloridot oldunk 1 l R vízben oldunk. Áramlási sebesség: 0,5 ml/perc. Meghatározás: spektrofotométerrel, 280 nm-en. Injektálás: µg fehérje. Retenciós idő: A vizsgálati oldat kromatogramján megjelenő csúcsokat az összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő csúcsokkal összehasonlítva azonosítjuk; a dimereknél rövidebb retenciós idővel megjelenő csúcsok polimereknek és aggregátumoknak felelnek meg. A rendszeralkalmasság: összehasonlító oldat: az első csúcs az IgG monomernek felel meg, a dimernek megfelelő csúcs a monomerhez képest 0,85 ± 0,05 relatív retenciós idővel jelenik meg. vizsgálati oldat: a monomer és a dimer relatív retenciója 1 ± 0,05 az összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő megfelelő csúcsokra vonatkoztatva. Követelmények: a monomer és dimer együtt: az összes csúcs területösszegének legalább 95%-a, összes polimer és aggregátum: az összes csúcs területösszegének legfeljebb 5%-a. Tisztaság. Poliakrilamid-gél elektroforézist használunk (2.2.31), redukáló és nem redukáló körülmények között. Felbontó gél. Nem redukáló körülmények között 8%-os akrilamid gélt; redukáló körülmények között 12 %-os akrilamid gélt használunk. Vizsgálati oldat: A vizsgálandó készítményt 0,5-2 mg/ml fehérjekoncentrációra hígítjuk. Összehasonlító oldat. Az összehasonlító készítményből a vizsgálati oldattal megegyező fehérjekoncentrációjú oldatot készítünk. Felvitel: 10 µl Detektálás: Coomassie festés Eredmények: Az összehasonlító oldat elektroforetogramjával összehasonlítva a vizsgálati oldat elektroforetogramján nem jelenhetnek meg további sávok.

6 ex animale ad usum humanum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Anti A és Anti B hemagglutininek (2.6.20, A-módszer) 1:64 hígítás esetében nem mutatható ki agglutináció. Adott esetben a vizsgálandó készítményt a használati előírásban szereplő módon hígítjuk, mielőtt a vizsgálat céljára történő hígítást elvégezzük. Hemolizinek. A vizsgálandó készítményből ha szükséges, a feliraton megadott hígítást követően 1:64 arányú hígítást készítünk.. Az 1:64 hígítású elegyből 6 egyenlő térfogatrészt kiveszünk. Három oldathoz A1, B illetve 0 csoportú vörösvérsejt-szuszpenzió R nátrium klorid 9 g/l-es oldatával készített 10 % V/V hígításának azonos térfogatrészét adjuk. A megmaradó 3 oldathoz A1, B, illetve 0 csoportú vörösvérsejtszuszpenzió R nátrium klorid 9 g/l-es oldatával készített 10 % V/V hígításának majd komplementforrásként, friss AB csoportú savónak az oldatokkal azonos térfogatát adjuk. A keveréket homogenizáljuk, és 37 Cº-on 1 órán át inkubáljuk. A felülúszó folyadékot hemolízis előfordulására vizsgáljuk. Hemolizis jelei nem fordulhatnak elő. Trombocita elleni ellenanyagok. Megfelelő módszerrel vizsgálva a trombocita elleni ellenanyagok szintje nem haladhatja meg az adott készítményre engedélyezett értéket. Víztartalom (2.5.15): legfeljebb 3% lehet. Sterilitás (2.6.1) A készítmény feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményeinek. Pirogének (2.6.8) Indokolt és engedélyezett esetek kivételével, a készítmény feleljen meg a pirogénvizsgálat követelményeinek. Ha nincs más előírás, 1 ml/testtömegkg mennyiséget adunk be a nyulaknak. TARTALMI MEGHATÁROZÁS A biológiai aktivitást a célsejteken okozott komplement-függő citotoxicitás mérésével határozzuk meg. Áramlásos citometriát végzünk az elpusztult, propidium-jodiddal festődő sejtek leolvasásával. Az aktivitást az 50 %-os citotoxicitást (sejtölő hatást) kifejtő anti T limfocita immunglobulin milligramm / milliliter értékben megadott koncentrációjával fejezik ki. Limfocita elválasztó közeg. Kereskedelmi forgalomban levő, alacsony viszkozitású, 1,077 g/ml sűrűségű elválasztó közeget használnak. Komplement. A meghatározás céljára megfelel a kereskedelmi forgalomban levő komplement. Tompított sóoldat (ph 7,2). 8 g R nátrium kloridot, 0,2 g R kálium kloridot, 2,18 g R dinátriumhidrogénfoszfátot, és 0,2 g R káluim-dihidrogénfoszfátot R vízben feloldunk és az oldatot R vízzel 1000,0 ml-re hígítjuk. Tompítóoldat áramlási citometriához. 40 ml 0,1 V/V%-os R nátrium azidot és 10 ml fötális borjúsavót adunk 440 ml tompított sóoldathoz (ph 7,2). A fötális borjúsavót felhasználás előtt 56 Cº-on 30 perces hőkezeléssel inaktiváljuk. Az elegyet 4 Cº-on tároljuk. Propidium-jodid oldat. R propidium-jodidból tompított sóoldattal (ph 7,2) 1 mg /ml töménységű oldatot készítünk. Ezt a törzsoldatot 2-8 Cº-on tároljuk, és 1 hónapon belül felhasználjuk. A tartalmi meghatározás céljára a törzsoldatot áramlási citometriához való tompítóoldattal 5 µg/ml töménységűre hígítjuk. Ezt az oldatot 2-8 Cº-on tároljuk, és 3 órán belül felhasználjuk. Mikrotitráló lemezek. Az immunglobulin hígítások készítésére U vagy V alakú mélyedésekkel ellátott, nem előkezelt, polisztirol vagy polivinil-klorid lemezeket használunk.

7 ex animale ad usum humanum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Mikrokémcsövek. Citometriás mérésre megfelelő csöveket használunk. Sejtszuszpenzió. Alvadásgátolt vért gyűjtünk legalább egy egészséges donortól. A perifériás vér egymagvú sejtjeit a levétel után azonnal a limfocita elválasztó közegben történő sűrűséggrádiens centrifugálással úgy szeparáljuk, hogy az egymagvú sejtek a plazma és az elválasztó közeg között jól látható, tiszta réteget képezzenek. Ezt a sejtréteget gyűjtjük és tompított sóoldatot(ph 7,2) tartalmazó centrifugacsövekbe visszük át. A csöveket 400 g-vel 2-8 Cº-on 10 percig centrifugáljuk. A felülúszót elöntjük, a sejtüledéket az áramlási citometriához való tompítóoldatban újraszuszpendáljuk. A sejtek centrifugálásának és újraszuszpendálásának eljárását kétszer megismételjük. A harmadik centrifugálás után a sejtüledéket 1 ml áramlási citometriához való tompítóoldatban újraszuszpendáljuk. A sejtszámot és az élő sejteket Bürker kamra segítségével megszámoljuk. A sejtszámot az áramlási citometriához való tompítóoldattal / ml töménységre állítjuk be. A sejtszuszpenziót 4 Cº-on tároljuk, és 12 órán belül felhasználjuk. Ha szükséges, az első egymagvú sejtüledék 20% fötális savót tartalmazó tompított sóoldatban (ph 7,2) is újraszuszpendálható, és 2 Cº-on 1 éjszakán át tárolható. Ezt követően 400 g-vel 2-8 Cº-on 10 percig centrifugáljuk. A felülúszót elöntjük. A sejtüledéket áramlási citometriához való tompítóoldatban újraszuszpendáljuk. A sejtszámot és az élő sejteket Bürker kamra segítségével megszámoljuk. A sejtek legalább 90%-ának élő sejtnek kell lennie. A sejtszámot áramlási citometriához való tompítóoldattal / ml töménységre állítjuk be. A következő módszer alkalmazásával a sejteket le is lehet fagyasztani (azonnali lefagyasztás), majd folyékony nitrogénben tárolni. Tompítóoldat fagyasztás céljára. 20 ml szövettenyésztő táptalajhoz 25 ml fötális borjúsavót és 5 ml dimetil-szulfoxidot (DMSO) adunk. Ezt az elegyet 2-8 Cº-on tároljuk, és 3 órán belül felhasználjuk. Ampullánként sejtet fagyasztunk le. Az ampullákat folyékony nitrogénben tároljuk. Tompítóoldat felolvasztás céljára. 450 ml sejttenyésztő táptalajhoz 50 ml fötális borjúsavót adunk. Ezt az elegyet 2-8 Cº-on tároljuk, és 3 órán belül felhasználjuk. Minden egyes ampullát 37 Cº-os vízfürdőben rázatva olvasztunk fel. A sejtek ismételt szuszpendálását szintén a felolvasztásra szánt tompítóoldattal végezzük, majd a szuszpenziót 200 g-vel 2-8 Cº-on 10 percig centrifugáljuk. A felülúszót elöntjük. A sejtüledéket áramlási citometriához való tompítóoldatban szuszpendáljuk. A sejtek centrifugálásának és újraszuszpendálásának eljárását megismételjük. A második centrifugálás után a sejtüledéket 1 ml áramlási citometriához való tompítóoldatban szuszpendáljuk. A sejtszámot és az élő sejteket Bürker kamra segítségével megszámoljuk. A sejtek legalább 90%-ának életképesnek kell lennie. A sejtszámot áramlási citometriához való tompítóoldat hozzáadásával / ml töménységre állítjuk be. A sejtszuszpenziót 4 Cº-on tároljuk, és 3 órán belül felhasználjuk. Vizsgálati oldatok. A liofilizált készítményeket a feliraton megadott módon feloldjuk. Áramlási citometriához való tompítóoldat felhasználásával három, egyenként legalább 7 hígításból álló független hígítási sorozatot készítünk. Összehasonlító oldatok. A liofilizált készítményeket a használati utasításban megadott módon oldjuk fel. Áramlási citometriához való tompítóoldat felhasználásával három, egyenként legalább 7 hígításból álló független sorozatos hígítást készítünk. A vizsgálati oldat és az összehasonlító oldat minden egyes hígításából 75 µl-t adunk a mikrotitráló lemez egyes mélyedéssorozataihoz. Minden egyes mélyedésbe 25 µl-t mérünk az egymagvú sejtek szuszpenziójából, és 25 µl-t a nyúl komplementből. A lemezeket 37 Cº-on 30 percig inkubáljuk. A lemezeket ezután után 200 g-vel 4 Cº-on 8 percen át centrifugáljuk, a felülúszót elöntjük és a lemezeket jégen tartjuk. Az áramlási citfotometriás mérésre történő előkészítést lépésenként végezzük, mindig csak meghatározott számú mélyedést használva fel, azért, hogy az R propidium jodiddal történő jelölés

8 ex animale ad usum humanum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur meghatározott időn belül mehessen végbe. Meghatározott számú lyukban óvatosan újra szuszpendáljuk a sejtüledéket 200 µl propidium-jodid oldattal. A szuszpenziókat csövekbe visszük át. A csöveket 25 Cº-on 10 percig inkubáljuk, ezután azonnal jégre helyezzük. A fluoreszcencia mérését áramlási citométerrel végezzük. Az előre történő fényszórás (Forward Scattered light: FSC) és a fluoreszcencia (a propidium jodid FL2 vagy FL3) alapján meghatározzuk azt a területet, ahol az összes propidium-jodid pozitív sejt elhelyezkedik. Meghatározzuk a propidium jodid pozitív sejtek százalékos arányát, kapuzás nélkül, de a sejttörmeléket kizárva. Minden egyes vizsgálati oldat illetve referencia oldat mintából legalább 3000 sejtet vizsgálunk. Az elhalt sejtek százalékos arányát használjuk fel arra, hogy a vizsgálandó készítmény hatóértékét, mint az 50%-os citotoxicitás eléréséhez szükséges, mg/ml-ben kifejezett koncentrációt meghatározzuk. A meghatározást a vizsgálati és a referencia készítményekkel nyert adatok felhasználásával kapott szigmoid dózis-hatás görbére történő illesztéssel és 4 paraméteres logisztikai modell (lásd: például 5. 3 fejezet) valamint a megfelelő szoftver alkalmazásával végezzük el. A vizsgálat csak akkor érvényes, ha a propidium-jodid pozitív sejtek %-os aránya a görbe alsó aszimptotikus szakaszán kevesebb, mint 15%, és a görbe felső aszimptotikus szakaszán legalább 80%. A készítmény becsült aktivitásának az illető készítményre jóváhagyott aktivitás %-a között kell lennie. A konfidencia határértékeknek (P=0,95) a becsült hatóérték %-a között kell lenniük. ELTARTÁS Fénytől védve, a feliraton megadott hőmérsékleten tároljuk. Lejárati idő: A lejárati időt a tartalmi meghatározás kezdetétől számítjuk. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni: folyékony készítmények esetében: a tartályban levő készítmény térfogatát és fehérjetartalmát, liofilizált készítmények esetében: az oldáshoz használandó folyadék nevét és térfogatát, a tartályban levő fehérje mennyiségét, azt, hogy az immunszérumot a feloldás után azonnal fel kell használni, a teljes feloldódáshoz szükséges időt, az állatfaj eredetét, adott esetben a stabilizátor nevét és mennyiségét, a hígítás mértékét a készítmény felhasználása előtt.