Az ÁLLATI EREDETŰ EMBERGYÓGYÁSZATI IMMUNSZÉRUMOK általános cikkely változásai

Átírás

1 Az ÁLLATI EREDETŰ EMBERGYÓGYÁSZATI IMMUNSZÉRUMOK általános cikkely változásai oldal Új cikkelyszám: 04/2007: oldal A Fehérjetartalom pont első mondata a következőképpen egészül ki: Fehérjetartalom: a címkén feltüntetett mennyiség %-a, de indokolt és engedélyezett esetek kivételével legfeljebb 100 g/l.

2 A GYÓGYSZERANYAGOK általános cikkely változásai oldal Új cikkelyszám: 04/2007: oldal A Definíció rész első és második bekezdése közötti új szövegrész: A cikkely előírásai nem vonatkoznak a növényi drogokra, növényi drogkészítményekre vagy kivonatokra; ezekre a következő cikkelyek előírásai vonatkoznak: Növényi drogok (1433), Növényi drogkészítmények (1434), Kivonatok (0765). Az Előállítás pont első és második bekezdése közötti új szövegrész: A gyógyszeranyagok ellenőrzésére alkalmazni kell az általános fejezet rendelkezéseit. Az Azonosítás pont teljes szövege a következők szerint változott: Ha valamely egyedi cikkelyben az Azonosítás címszó alatt Első azonosítás és Második azonosítás is található, az Első azonosításhoz tartozó vizsgálat(ok) minden körülmények között alkalmazható(k). A Második azonosításhoz tartozó vizsgálat(ok)at akkor használjuk azonosításra, ha az anyag bizonyítottan olyan gyártási tételből származott, amelyről bizonylat igazolja, hogy a cikkely minden más követelményének megfelel. A Vizsgálatok pont Polimorfia (5.9) alpontjának teljes szövege a következők szerint változott: Polimorfia (5.9). Ha egy anyag felhasználása gyógyszerkészítményekben az anyag valamelyik kristályos vagy amorf módosulatának tulajdonságai miatt korlátozott, a megfelelő kristályformát, illetve amorf módosulatot azonosítani kell, a kristálytani tulajdonságokat megfelelő módon ellenőrizni kell, és az azonosságot a feliraton fel kell tüntetni. A Vizsgálatok pont Rokon vegyületek alpontjának első bekezdése helyesen: Hacsak nincs más előírás, a hatóanyagokban lévő szerves szennyezőket jelenteni, ahol lehetséges azonosítani és a táblázat alapján minősíteni kell oldal A Vizsgálatok pont Rokon vegyületek alpontjának második és harmadik bekezdése között új szövegrész: Amennyiben az egyedi cikkely nem tartalmaz megfelelő módszert egy új szennyező ellenőrzésére, megfelelő ellenőrző vizsgálatot kell kifejleszteni, és ezt fel kell venni az anyagra vonatkozó követelmények közé. Ugyanezen alpont utolsó bekezdésének utolsó sora a következő szövegrésszel egészül ki: állati vagy növényi eredetű nyers termékekre, valamint gyógynövénytermékekre nem kell alkalmazni. Az Oldószermaradványok alpontjának második mondata a következőképpen módosul: Amennyiben az oldószermaradványt mennyiségileg meghatározzuk, Szárítási veszteség vizsgálatot viszont nem végzünk, a hatóanyagtartalom, a fajlagos abszorpciós koefficiens és a fajlagos optikai forgatóképesség kiszámításánál az oldószermaradvány-tartalmat kell figyelembe venni. A Felirat pont első bekezdésének utolsó mondata a következő szövegrésszel egészül ki: a csomagoláson vagy a kísérőiraton, illetve a terméket kísérő analízis bizonylaton fel kell tüntetni

3 Folyadékok tisztasága és opálosságának mértéke oldal Új cikkelyszám: 04/2007: oldal Az opálosság műszeres meghatározása részben a Helyesség bekezdés a következőképpen változik: Helyesség: 0 10 NTU: ±(a leolvasott érték 2%-a+0,01) NTU NTU: ±5%.

4 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur /2007: VÍZTARTALOM MEGHATÁROZÁSA FÉLMIKRO-MÓDSZERRREL A víz félmikro-meghatározása a víz, a kén-dioxid és a jód közötti kvantitatív reakción alapul, amely megfelelő vízmentes közegben, kellő tompító kapacitással rendelkező bázis jelenlétében megy végbe. Készülék A készülék titráló edényből áll, amelynek részei: 2 egyforma platinaelektród; szorosan záró nyílások az oldószer és a reagens bejuttatására; nyílás a levegő szárítóanyagon keresztüli bevezetésére; dugóval, folyadékok esetében szeptummal ellátott nyílás a minta bejuttatására. Bemenetrendszer csatlakoztatható továbbá a szárított nitrogén bevezetésére vagy az oldószerek beszívására. A titrálás során figyelembe vesszük a készülék gyártójának használati utasításait. A meghatározás tartama alatt a reagenseket és az oldószereket óvni kell a légnedvességtől. A végpontot két egyforma indikátorelektród alkalmazásával határozzuk meg. Az elektródok olyan elektromos forráshoz csatlakoznak, amely a két elektród között állandó áramerősséget vagy állandó feszültséget biztosít. Ha közvetlen titrálást végzünk (A-módszer), akkor a titráló reagens hozzáadása állandó áramerősség fenntartása esetén feszültségcsökkenést okoz, abban az esetben viszont, ha a feszültséget tartjuk állandó értéken, áramerősség-növekedést idéz elő mindaddig, míg a végpontot el nem érjük. Gyakran használatosak a végpontot automatikusan regisztráló készülékek is.

5 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur A vízegyenérték meghatározása. A titráló edénybe R metanolt szükség esetén szárított formában vagy a titráló reagens előállítója által ajánlott oldószert juttatunk. Ha az alkalmazott készülék lehetővé teszi, a víznyomokat eltávolítjuk a titráló térből, vagy előtitrálást végzünk. Ezután megfelelő mennyiségű vizet juttatunk be kellő formában (R víz vagy bizonylattal ellátott referenciaanyag formájában), majd a szükséges ideig tartó keverés alkalmazásával elvégezzük a titrálást. A vízegyenértéknek az előállító által jelzett érték legalább 80%-át el kell érnie. A titráló reagens vízegyenértékét az első felhasználás előtt, és azután megfelelő időközönként meg kell határozni. Ha nincs más előírás, az A-módszert alkalmazzuk. A-módszer. A titráló edénybe R metanolt, vagy a vonatkozó cikkelyben előírt, illetőleg a titráló oldat előállítója által javasolt oldószert juttatunk. Ha az alkalmazott készülék lehetővé teszi, a víznyomokat eltávolítjuk a titráló térből, vagy előtitrálást végzünk. A vizsgálandó anyagot ezután késedelem nélkül bejuttatjuk, és elvégezzük a titrálást; a víz kivonása céljából szükséges ideig tartó keverést alkalmazunk. B-módszer. A titráló edénybe R metanolt, vagy a vonatkozó cikkelyben előírt, illetőleg a titráló reagens előállítója által javasolt oldószert juttatunk. Ha az alkalmazott készülék lehetővé teszi, a víznyomokat eltávolítjuk a titráló térből, vagy előtitrálást végzünk. A megfelelő mértékben elporított vizsgálandó anyagot ezután késedelem nélkül bejuttatjuk. A rendszerhez pontosan mért térfogatú, annyi titráló reagenst adunk, hogy az előírt térfogathoz viszonyítva kb. 1 ml feleslegben legyen. A folyadékot fénytől védve 1 percig vagy az előírt ideig tartó keverés közben állni hagyjuk. Ezután a titráló reagens feleslegét pontosan ismert mennyiségű vizet tartalmazó R metanollal vagy előírt oldószerrel titráljuk. Alkalmasság. Az adott titráló reagenssel történő meghatározás pontosságát minden egyes vizsgálandó anyag esetében igazolni kell. A következő, példaként szolgáló eljárás 2,5 25 mg vizet tartalmazó minták esetében alkalmazható. Meghatározzuk a vizsgálandó anyag víztartalmát a választott reagens/oldószer rendszer felhasználásával. Ezután egymás után többször (legalább ötször) megfelelő formában levő, ismert mennyiségű vizet adunk a rendszerhez, és az egyesített víztartalmat minden hozzáadás után meghatározzuk. A százalékos visszanyerést (r) minden alkalommal a következő képlettel számítjuk ki:

6 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur ahol r = 100W 2 W 1 V 1 = a hozzáadott víz mennyisége, milligrammban; V 2 = a mért víz mennyisége, milligrammban. Kiszámítjuk a mért, egyesített víz regressziós egyenesét a hozzáadott vízzel szemben. Kiszámítjuk az egyenes meredekségét (b), továbbá metszéspontját az y-tengellyel (a) és az extrapolált kalibrációs görbe metszéspontját az x-tengellyel (d). Kiszámítjuk a százalékos visszanyerés átlagát (r). A százalékos hibák (e 1 és e 2 ) kiszámításához az alábbi képleteket használjuk: a M e 1 = 100 M e 2 = 100 d M M ahol a = metszéspont az y-tengelyen, a víz milligrammjában; d = metszéspont az x-tengelyen, a víz milligrammjában; M = az anyag víztartalma, a víz milligrammjában. A reagens/oldószer rendszer alkalmasnak tekinthető, ha: e 1 és e 2 nem nagyobb 2,5%-nál; b értéke: 0,975 1,025 (szórás ± 2,5%);

7 Ph.Hg.VIII. Ph.Eur r értéke: 97,5 102,5%.

8 Adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének... Ph.Hg.VIII. Ph.Eur /2007: ADSZORBEÁLT DIFTÉRIA VAKCINA HATÓÉRTÉKÉNEK MEGHATÁROZÁSA A diftéria vakcina hatóértékét úgy határozzuk meg, hogy a vakcinát tengerimalacoknak adjuk be és ezt vagy diftériatoxinnal történő immunpróba (Avagy B-módszer) vagy a tengerimalacok szérumában a diftériatoxin vagy -toxoid ellen termelt antitestek titerének meghatározása (C-módszer) követi. A vakcina hatóértékét mindkét esetben Nemzetközi Egységekre beállított referenciakészítménnyel összehasonlítva számítjuk ki. A Nemzetközi Egység a Nemzetközi Standard meghatározott mennyiségének hatóértéke; a Nemzetközi Standard alumínium-hidroxidra adszorbeált diftériatoxoid meghatározott mennyisége. A Nemzetközi Standard Nemzetközi Egységekben kifejezett egyenértékét az Egészségügyi Világszervezet (WHO) állapítja meg. Referenciakészítményként a BRP adszorbeált diftéria vakcina használható. Az adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének meghatározására választott módszer a vizsgálat céljától függ. Az A- vagy a B-módszert kell használni: 1. a vakcinák kifejlesztése során, gyártásvalidálás céljából előállított kész gyártási tételek hatóértékének meghatározására; 2. minden alkalommal, amikor az előállítási folyamat lényeges megváltoztatása miatt szükségessé válik annak újravalidálása. Az A- vagy a B-mószer a vakcina kész gyártási tételei hatóértékének rutinszerű meghatározására is használható, de az állatok kímélése érdekében lehetőség szerint a C-módszert kell alkalmazni. A fenti 1. és 2. pontban meghatározott eseteket kivéve a C-módszer akkor használható, ha alkalmazhatóságát az adott termék esetében igazolták. E célból megfelelő számú (rendszerint három) kész gyártási tétel hatóértékét kell meghatározni a C-módszert, valamint az A- vagy a B-módszert alkalmazva. Ahol azonos eredetű diftériatoxoid (Lf/ml-ben kifejezett) hasonló mennyiségeiből különféle (monovalens vagy kombinációs) vakcinákat készítenek, ott feltételezhető, hogy a legnagyobb számú komponenst tartalmazó kombinációra bizonyított megfelelés érvényes a kevesebb összetevőt tartalmazó és a monovalens vakcinákra is. Azokat a kombinált vakcinákat, amelyek teljes sejtes pertussziszkomponenst vagy olyan konjugált b-típusú hemofilusz vakcinát tartalmaznak, amelyet úgy szereltek ki, hogy diftériatoxoiddal vagy hordozóként alkalmazott CRM 197 diftéria-fehérjével együtt van jelen az üvegcsében, külön kell értékelni.

9 Adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének... Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Diftéria- és tetanuszkomponenseket tartalmazó kombinációk diftériakomponens hatóértékének szerológiai meghatározását (C-módszer) az állatok ugyanazon csoportjával végezhetjük, mint amelyet az adszorbeált tetanusz vakcina hatóértékének meghatározására (2.7.8) használtunk, amennyiben bizonyított, hogy a diftéria- és a tetanuszkomponensek immunizációs körülményei (pl. dózisok, időtartam) a kombinált vakcina esetében is érvényesek. Az alábbiakban leírt hatóérték-meghatározások kísérleti elrendezése a vizsgálati és a referenciakészítmény többszöri hígítását alkalmazza. Ha a vizsgálatot végző személy kellő gyakorlattal alkalmazza a módszert egy adott vakcinára, úgy mind a vizsgálati, mind a referenciakészítmény egyetlen hígításán alapuló, egyszerűsített vizsgálati modell is alkalmazható. Ez a modell lehetővé teszi az analitikus számára annak megállapítását, hogy a vizsgált készítmény hatóértéke szignifikánsan nagyobb-e, mint a megkövetelt minimum, de nem ad információt a linearitásról, a párhuzamosságról és a dózis-válasz görbéről. Az egyszerűsített modell alkalmazásával jelentősen csökkenthető a kísérleti állatok száma, ezért a modell használatát a kísérleti és egyéb tudományos célokra felhasznált gerinces állatok védelméről szóló Európai Egyezmény előírásaival összhangban minden analitikusnak fontolóra kell venni. Ahol egyszeri hígításon alapuló meghatározást alkalmaznak, ott megfelelő mutatók alkalmazásával monitorozni kell a termelés és a vizsgálat állandóságát, és szabályos időközönként (pl. 2 évente) el kell végezni a meghatározást többszöri hígítással is. Szerológiai meghatározások esetén a vizsgálat állandóságának monitorozására alkalmas mutatók a következők: a vakcina referenciakészítmény adott dózisának beadása után kapott antitoxintiterek vagy szérumminta pontszámok átlagértékei és szórásai; ellenőrző minták (pozitív és negatív szérumminták) antitoxin-titerei vagy pontszámai; a pozitív szérum-kontrollmintákra és a referenciavakcinából nyert szérummintákra kapott antitoxin-titerek vagy pontszámok aránya. A-MÓDSZER: INTRADERMÁLIS PROVOKÁCIÓS VIZSGÁLAT TENGERIMALACOKON A KÍSÉRLETI ÁLLATOK KIVÁLASZTÁSA ÉS CSOPORTOSÍTÁSA A vizsgálatokhoz azonos törzsállományból származó, egészséges, fehér tengerimalacokat használunk, amelyek mérete lehetővé teszi az előírt számú helyen végzett próbák kivitelezését. A legsúlyosabb és a legkönnyebb állatok testtömege közötti különbség 100 g-nál ne legyen nagyobb. Azonos nemű tengerimalacokat használunk, vagy a hímeket és a nőstényeket egyformán osztjuk el a csoportok között. Az állatokat legalább 6 egyenlő csoportra osztjuk; az egyes csoportokban

10 Adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének... Ph.Hg.VIII. Ph.Eur annyi állat legyen, hogy a kapott vizsgálati eredmények megfeleljenek az érvényes meghatározás alább leírt követelményeinek. Ha a provokációra használt toxin nem bizonyult stabilnak vagy nem kielégítően standardizált, úgy a vizsgálatba nemvakcinázott kontrollként további 5 tengerimalacot vonunk be A PROVOKÁCIÓRA HASZNÁLT TOXIN KIVÁLASZTÁSA Olyan diftériatoxin-készítményt választunk, amely 1 Lf-ben lr/100-at tartalmaz, illetve a tengerimalac bőrén minimális reakciót kiváltó adag szeresét tartalmazza 1 Lf-ben. Amennyiben a provokációra használt toxinkészítmény stabilitását igazolták, akkor nem szükséges minden egyes meghatározás alkalmával ellenőrizni a hatóértékét. A PROVOKÁCIÓRA HASZNÁLT TOXINOLDAT KÉSZÍTÉSE A provokációra használt toxinból megfelelő oldószerrel közvetlenül a felhasználás előtt olyan oldatot készítünk, amelynek koncentrációja kb. 0,0512 Lf/0,2 ml. Ebből az oldatból négyszeres hígításokkal egy öt oldatból álló sorozatot állítunk elő, tehát a hígítások koncentrációja rendre: kb. 0,0128, 0,0032, 0,0008, 0,0002 illetve 0,00005 Lf/0,2 ml lesz. A VIZSGÁLATI ÉS A REFERENCIA-KÉSZÍTMÉNYEK HÍGÍTÁSA Mind a vizsgálandó vakcinából, mind a referenciakészítményből R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával hígítási sorozatot készítünk, oly módon, hogy a hígítási faktor legfeljebb 2,5 legyen, és a középső hígítások 1,0 ml-es adagjait az egyes tengerimalacokba szubkután oltva, a toxinpróba intradermális pontszáma az állatokban kb. 3 legyen. IMMUNIZÁCIÓ ÉS PROVOKÁCIÓ Minden egyes tengerimalaccsoport egyedeibe a csoporthoz tartozó vakcinahígításból 1,0-1,0 ml-t oltunk szubkután. 28 nap múlva a tengeri malacokat mindkét lágyékukon leborotváljuk és mind a hat toxinhígításból mindegyik vakcinázott tengerimalacba, hat különböző helyre 0,2 ml-t oltunk intradermálisan, lehetőleg úgy, hogy a szomszédos oltási helyek között ne legyen kölcsönhatás. PROVOKÁCIÓRA HASZNÁLT TOXIN HATÓÉRTÉKÉNEK MEGHATÁROZÁSA Szükség esetén a provokációra használt toxin hígításait, melyek az Lf milliomod részének 80, 40, 20, 10, illetve 5-szörösét tartalmazzák, a nem-vakcinázott kontrollcsoport egyedeibe oltjuk. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE 48 órával a provokációra használt toxin beadása után minden oltás helyét megvizsgáljuk, és feljegyezzük azokat, ahol specifikus diftéria-bőrpír keletkezett.

11 Adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének... Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Feljegyezzük azoknak az oltási helyeknek a számát is, amelyeken nem mutatkozik ilyen reakció; ez utóbbi szám adja meg az intradermális pontszámot (score). Az azonos vakcinahígítással kezelt állatokra vonatkozó intradermális pontszámokat táblázatba foglaljuk, és az adatokból megfelelő transzformáció után pl. (score) 2 képzését követően, vagy arc sin ((score/6) 2 ) képzését követően a párhuzamos egyenesek módszerével kiszámítjuk a vizsgált készítmények relatív hatóértékét. AZ ÉRVÉNYES MEGHATÁROZÁS KÖVETELMÉNYEI A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha: mind a vizsgált vakcina, mind a referenciakészítmény esetében a legkisebb adagszinten kapott intradermális pontszámok középértéke háromnál kisebb, a legnagyobb adagszinten kapott intradermális pontszámok középértéke pedig háromnál nagyobb, ha vizsgáltuk az adott toxin hatóértékét, az Lf milliomod részének 40-szeresét tartalmazó toxinhígítás a kontrollállatoknak legalább 80%-ánál pozitív bőrpírreakciót vált ki, míg az Lf milliomod részének 20-szorosát tartalmazó hígítás az állatoknak kevesebb mint 80%-ánál ad pozitív reakciót (ha ezek a feltételek nem teljesülnek, másik toxint kell választani), a meghatározás megbízhatósági határai (P = 0,95) a becsült hatóérték 50 és 200%-a közé esnek, a statisztikai elemzés alapján az összefüggések lineárisak és párhuzamosak. A vizsgálat megismételhető, de ha több meghatározást végzünk, akkor az összes érvényes meghatározás eredményeit egyesíteni kell. B-MÓDSZER: LETÁLIS PROVOKÁCIÓS VIZSGÁLAT TENGERIMALACOKON A KÍSÉRLETI ÁLLATOK KIVÁLASZTÁSA ÉS CSOPORTOSÍTÁSA A vizsgálatokhoz azonos törzsállományból származó, g testtömegű, egészséges tengerimalacokat használunk. Azonos nemű tengerimalacokat választunk, vagy a hímeket és a nőstényeket azonos arányban osztjuk el a csoportok között. A tengerimalacokat legalább 6 egyenlő csoportba osztjuk; az egyes csoportokban annyi állat legyen, hogy a kapott vizsgálati eredmények megfeleljenek az érvényes meghatározás alább leírt követelményeinek. Ha a provokációra használt toxin stabilitása nem igazolt vagy a toxin nem kielégítően standardizált, úgy nem-vakcinázott kontrollként 5-5 tengerimalacból álló további 4 csoportot vonunk be a kísérletbe. A PROVOKÁCIÓRA HASZNÁLT TOXIN KIVÁLASZTÁSA

12 Adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének... Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Olyan diftériatoxin-készítményt választunk, amely ml-enként legalább 100 LD 50 mennyiséget tartalmaz. Ha a provokációra használt toxinkészítmény bizonyítottan stabil, úgy a halálos adagot nem szükséges minden egyes meghatározás során ellenőrizni. A PROVOKÁCIÓRA HASZNÁLT TOXINOLDAT KÉSZÍTÉSE A provokációra használt toxint közvetlenül a felhasználás előtt, megfelelő hígítószerrel, egy ml-enként közelítőleg 100 LD 50 mennyiséget tartalmazó provokációs toxinoldat eléréséig hígítjuk. Szükség esetén a provokációra használt toxinoldatból ugyanazon hígítószerrel készült 32-szeres, 100-szoros és 320-szoros hígításokat használunk. A VIZSGÁLATI ÉS A REFERENCIAKÉSZÍTMÉNYEK HÍGÍTÁSA Mind a vizsgálandó vakcinából, mind a referenciakészítményből R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával hígítási sorozatokat készítünk oly módon, hogy a hígítási faktor legfeljebb 2,5 legyen, és a közbülső hígítások 1,0 ml-es adagjai az egyes tengerimalacokba szubkután oltva, az állatok közelítőleg 50%-át védje meg a vizsgálathoz előírt diftériatoxin szubkután beadott mennyiségének halált okozó hatásától. IMMUNIZÁCIÓ ÉS PROVOKÁCIÓ Minden egyes vakcinahígítást egy-egy tengerimalac csoporthoz rendelünk, és az egyes hígításokból mindegyik tengerimalacba 1,0 ml-t fecskendezünk szubkután. 28 nap múlva mindegyik állatot a provokációra használt toxinoldat (100 LD 50 ) 1,0 ml-ével szubkután beoltjuk. A PROVOKÁCIÓRA HASZNÁLT TOXIN HATÓÉRTÉKÉNEK MEGHATÁROZÁSA Szükség esetén a provokációra használt toxinoldattal és a belőle készült 3 hígítással 4, egyenként 5 tengerimalacból álló csoportot oltunk. Az egyes hígításokból a csoport minden egyes tengerimalacába 1,0 ml-t fecskendezünk szubkután. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE 4 nappal a provokációra használt toxin befecskendezése után összeszámoljuk a túlélő tengerimalacokat. Az egyes vakcinázott tengerimalac-csoportok túlélő állatainak aránya alapján a szokásos statisztikai módszerek (pl. 5.3) felhasználásával kiszámítjuk a vizsgálandó vakcinának a referenciakészítményhez viszonyított hatóértékét. AZ ÉRVÉNYES MAGHATÁROZÁS KÖVETELMÉNYEI A vizsgálat csak akkor értékelhető, ha:

13 Adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének... Ph.Hg.VIII. Ph.Eur mind a vizsgálandó vakcina, mind a referenciakészítmény esetében az állatok 50%-át megvédő adag a tengerimalacoknak adott legnagyobb és legkisebb adagok közé esik; adott esetben, az 5-5 állatot tartalmazó 4 csoportban a provokációra használt toxinoldattal és 3 hígításával beoltott elhalt állatok száma azt mutatja, hogy a provokációra használt toxinadag megközelítőleg 100 LD 50 értékű volt; a meghatározás megbízhatósági határai (P = 0,95) a becsült hatóérték 50 és 200%-a közé esnek; a statisztikai analízis nem mutat eltérést a linearitástól és a párhuzamosságtól. A vizsgálat megismételhető, de ha egynél több meghatározást végzünk, akkor a hatóértéket az összes érvényes meghatározás egyesített eredményeiből kell kiszámítani. C-MÓDSZER. ANTITESTEK MEGHATÁROZÁSA TENGERIMALACOKBAN A KÍSÉRLETI ÁLLATOK KIVÁLASZTÁSA ÉS CSOPORTOSÍTÁSA A vizsgálatokhoz azonos törzsállományból származó, egészséges, g testtömegű tengerimalacokat használunk. Azonos nemű tengerimalacokat választunk, vagy a hímeket és a nőstényeket azonos arányban osztjuk el a csoportok között. Az állatokat legalább 6 egyenlő csoportra osztjuk; az egyes csoportokban annyi állat legyen, hogy a kapott vizsgálati eredmények megfeleljenek az érvényes meghatározás alább leírt követelményeinek. Negatív szérumkontrollként azonos eredetű, nem-vakcinázott tengerimalacok egy további csoportját használjuk. Ha a vizsgálat megbízhatósága bizonyított, úgy referencia negatív szérumkontroll is használható. REFERENCIAKÉSZÍTMÉNY Alkalmas referenciakészítményként BRP adszorbeált diftéria vakcinát vagy olyan, a klinikai vizsgálatokban hatásosnak bizonyult kész gyártási tétel vakcinát, illetőleg egy ezt reprezentáló gyártási tételt használunk, amelyet BRP adszorbeált diftéria vakcinára vagy az adszorbeált diftériatoxoid Nemzetközi Standardra állítottak be. A VIZSGÁLATI ÉS A REFERENCIAKÉSZÍTMÉNYEK HÍGÍTÁSA Mind a vizsgálati, mind a referenciakészítményből R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával hígítási sorozatot készítünk; a 2,5-5-szörös léptékű hígítási sorozatok bizonyultak alkalmasnak. Sorozatonként legalább 3 hígítást alkalmazunk, az összehasonlító vakcina esetében pl. 0,5-16 NE/ml koncentrációjú tartományban, míg a vizsgálandó vakcina esetében pl. 1:2-1:125 koncentrációjú tartományban. Az immunizálási célra szánt hígításokat célszerű a készítésüket

14 Adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének... Ph.Hg.VIII. Ph.Eur követően 1 órán belül felhasználni. Minden egyes tengerimalac csoporthoz egy hígítást rendelünk. IMMUNIZÁLÁS Mindegyik tengerimalac nyakszirtjébe szubkután fecskendezzük az adott csoporthoz rendelt hígítás 1,0 ml-ét. VÉRMINTA VÉTELE nappal az immunizálást követően mindegyik vakcinázott és kontroll tengerimalacból alkalmas módszerrel vérmintát veszünk. SZÉRUMMINTÁK KÉSZÍTÉSE A szérumminták gyakori fagyasztása és olvasztása kerülendő. A mikrobiológiai szennyezés elkerülésére ajánlatos a műveleteket lamináris légáramlású fülkében végezni. AZ ANTITEST-TITER MEGHATÁROZÁSA Az egyes szérumminták relatív antitest-titerét vagy pontszámát (score) megfelelő immunkémiai módszerrel határozzuk meg (2.7.1). Az alább bemutatott módszerek (enzim-kapcsolt immunszorbens meghatározás (ELISA) és a Vero-sejt meghatározás) alkalmasnak bizonyultak. A HATÓÉRTÉK KISZÁMÍTÁSA A vizsgálandó vakcina referenciakészítményhez viszonyított hatóértékét Nemzetközi Egységekben számítjuk ki, a számításhoz a szokásos statisztikai módszereket (pl. 5.3) használjuk. AZ ÉRVÉNYES MEGHATÁROZÁS KÖVETELMÉNYEI A vizsgálat csak akkor értékelhető, ha: a megbízhatósági intervallumok (P = 0,95) a becsült hatóérték %-a közé esnek; a statisztikai elemzés a dózis-válasz görbék meredekségének szignifikanciáját mutatja, valamint nem jelent eltérést a linearitástól és párhuzamosságtól (szignifikáns eltérések esetére az 5.3 fejezet ad meg alternativákat). A vizsgálat megismételhető, de ha egynél több meghatározást végzünk, akkor a hatóértéket az összes érvényes vizsgálat eredményeinek egyesítésével kell kiszámítani. A következő fejezet tájékoztatásul szolgál

15 Adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének... Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének meghatározása: irányelvek C-MÓDSZER. ANTITESTEK MEGHATÁROZÁSA TENGERIMALACOKBAN SZÉRUMMINTÁK KÉSZÍTÉSE Szérumminták készítésére a következő technika bizonyult alkalmasnak. A vérmintákat tartalmazó csöveket hatszor átfordítjuk, majd 2 órán át 37 C-on és újabb 2 órán át 4 C-on állni hagyjuk. Ezután a mintákat szobahőmérsékleten 800 g alkalmazásával 20 percig centrifugáljuk. A szérumot ezt követően steril csövekbe töltjük át és 20 C alatti hőmérsékleten tároljuk. Ezzel az eljárással legalább 40%- os szérumkitermelés érhető el. AZ ANTITEST-TITER MEGHATÁROZÁSA Az antitest-titer meghatározására az immunkémiai módszerekre példaként alább bemutatott ELISA és Vero-sejt vizsgálat alkalmasnak bizonyult. Antitest-titer meghatározása tengerimalac-szérumban, enzim-kapcsolt immunszorbens meghatározással (ELISA). A vizsgálati és a referenciaszérumok hígításait diftériatoxoiddal borított ELISA lemezeken készítjük. A meghatározás teljesítményjellemzőinek folyamatos ellenőrzése céljából mindegyik lemezen egy pozitív és egy negatív tengerimalac szérumkontroll mintát is elhelyezünk. A lemezekre tengerimalac-igg elleni peroxidáz-kapcsolt nyúl vagy kecske antitestet, majd peroxidáz-szubsztrátumot adunk. Megmérjük az optikai sűrűséget, és a szokásos statisztikai módszerek (pl. 5.3) alkalmazásával kiszámítjuk a relatív antitest-titert. Reagensek és felszerelés ELISA lemezek: 96 mélyedés, oszlopok: 1-12, sorok: A-H. Diftéria tengerimalac-antiszérum (humán felhasználásra szánt vakcinákhoz) (pozitív kontrollszérum), amelyet tengerimalacok BRP adszorbeált diftéria vakcinával történt immunizálásával nyertek. Peroxidáz-konjugátum. Tengerimalac IgG elleni, peroxidáz-kapcsolt nyúl vagy kecske antitest. Diftériatoxoid. Karbonát fedő tompítóoldat (ph 9,6). 1,59 g R vízmentes nátrium-karbonátot és 2,93 g R nátrium-hidrogén-karbonátot 1000 ml R vízben oldunk. Az oldatot 150 ml-es palackokba töltjük és autoklávban 15 percig 121 C-on sterilezzük. Nátrium-klorid-tartalmú foszfát tompítóoldat (ph 7,4) (PBS) ml R

16 Adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének... Ph.Hg.VIII. Ph.Eur vízben, keverés közben, 80,0 g R nátrium-kloridot, 2,0 g R kálium-dihidrogénfoszfátot, 14,3 g R dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrátot és 2,0 g R káliumkloridot oldunk. Az oldatot, a kistálykiválás elkerülésére, szobahőmérsélketen tartjuk. Felhasználás előtt térfogatának tízszeresére hígítjuk. Citromsav oldat. 10,51 g R citromsav-monohidrátot 1000 ml R vízben oldunk, majd az oldat ph-ját R nátrium-hidroxid 400 g/l töménységű oldatával 4,0-re állítjuk be. Mosó tompítóoldat. Literenként 0,5 g R poliszorbát 20-at tartalmazó PBS. Hígító blokkoló tompítóoldat. Literenként 0,5 g R poliszorbát 20-at és 25 g szárított fölözött tejet tartalmazó PBS. Peroxidáz szubsztrátum. Röviddel a felhasználás előtt 10 mg R diammónium- 2,2 -azinobisz(3-etilbenzotiazolin-6-szulfonát)-ot (ABTS) 20 ml citromsav oldatban oldunk. Az oldathoz, közvetlenül a felhasználás előtt, 5 µl R tömény hidrogén-peroxid oldatot mérünk. Vizsgálat Az alábbi leírás példa egy alkalmas lemezbeosztásra, azonban más elrendezés is használható. A lemez 1A-H mélyedéseibe a negatív kontrollszérum, a 2A-H és a 12A-H mélyedésekbe pedig a pozitív kontrollszérum kerül; ezek szolgálnak a meghatározás nyomon követésére. A 3-11A-H mélyedések a vizsgálati minták elhelyezésére szolgálnak. Az ELISA lemezek minden egyes mélyedését 100 µl diftériatoxoid-oldattal (0,5 Lf/ml karbonát fedő tompítóoldatban (ph 9,6)) vonjuk be. A lemezeket egy éjszakán át nedves légtérben 4 C-on tartjuk. A hőmérsékletváltozás zavaró hatását elkerülendő, 4 lemeznél többet ne rakjunk egymásra. Másnap a lemezeket mosó tompítóoldattal alaposan mossuk. A lemezeket ezután mélyedésenként 100 µl hígító blokkoló tompítóoldat hozzáadásával blokkoljuk, majd nedves légtérben 1 órán át 37 C-on inkubáljuk. Ezt követően mosó tompítóoldattal újabb alapos mosást végzünk. A lemezek mindegyik mélyedésébe 100 µl hígító blokkoló tompítóoldatot viszünk, kivéve az A-sor mélyedéseit. A negatív kontrollszérumból, a pozitív kontrollszérumból (kb. 0,01 NE/ml-ből), és a vizsgálati szérumból megfelelő hígításokat készítünk. A negatív kontrollszérumot az 1-es oszlophoz, a pozitív kontrollszérumot a 2-es és 12-es oszlophoz, a vizsgálati szérumokat pedig a 3-11-es oszlopokhoz rendeljük, majd mindegyik szérum 100 µl-ét azon oszlop első két mélyedésébe adjuk, amelyhez az illető szérumot rendeltük. Sokcsatornás mikropipetta segítségével kétszeres sorozathígítást készítünk úgy, hogy a B-sortól a H-sorig az egyik mélyedésből a következő mélyedésbe 100 μl-t viszünk át. Az utolsó sorból 100 µl-t elvetünk abból a célból, hogy mindegyik mélyedés 100 µl-t tartalmazzon. Ezután a lemezt 2 órán át 37 C-on inkubáljuk, majd mosó tompítóoldattal alaposan mossuk. A peroxidáz-konjugátumból hígító blokkoló tompítóoldattal megfelelő hígítást készítünk (2000-szeres hígítás alkalmasnak

17 Adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének... Ph.Hg.VIII. Ph.Eur bizonyult) és a hígításból 100 µl-t mérünk mindegyik mélyedésbe. A lemezeket ezután nedves légtérben 1 órán át 37 C-on inkubáljuk, majd mosó tompítóoldattal alaposan mossuk. Mindegyik mélyedésbe 100 µl peroxidáz-szubsztrátumot mérünk, majd a lemezt szobahőmérsékleten, fénytől védve, 30 percig állni hagyjuk. Ezután a mélyedések abszorbanciáját 405 nm-en a szubsztrátum hozzáadásának sorrendjében leolvassuk. Antitest-titer meghatározása tengerimalac-szérumban Vero-sejt meghatározással. Az alkalmazott módszer végpontja vagy a metabolikus gátlás (1. módszer) vagy a citotoxicitás (2. módszer), amelyet a sejtek mikroszkópos (sejtmorfológia) vagy vizuális (szín) vizsgálatával állapítanak meg. A kimutatási határ az egyes antitoxinokra jellemző, és általában 0,015 NE/ml (1. módszer) és 0,05 NE/ml (2. módszer) közé esik. Végpontnak azt a legnagyobb szérumhígítást tekintjük, amely a sejteket a diftériatoxin hatásától megvédi. Az antitoxin-aktivitást a tengerimalac vagy a WHO referenciastandard segítségével számítjuk ki és Nemzetközi Egység/ml-ben fejezzük ki. Reagensek és felszerelés Laposaljú szövettenyésztő lemezek: 96 mélyedés, oszlopok: 1-12, sorok: A-H. 75 cm 2 -es szövettenyésztő lombikok. Diftériatoxin. Tengerimalac diftéria-antiszérum (humán felhasználású vakcinákhoz) (pozitív kontrollszérum, amelyet tengerimalacok BRP adszorbeált diftéria vakcinával történt immunizálásával nyernek. Vero-sejtek (afrikai zöldmajom vesesejtek). Használatra megfelelőek a P2-P15 sejtátoltások. 1. Módszer. A diftériatoxin a Vero-sejtekre nézve sejtkárosító hatású, azok feloldódását eredményezi. Ezt a sejtkárosító hatást a diftériatoxin ellen ható antitestek gátolhatják. Ebből következően egy diftéria vakcina hatóértéke közvetett módon meghatározható ezen sejttenyészeti rendszer segítségével, ha immunizált állatokból származó különböző szérumhígításokat egy állandó toxinkoncentráció mellett tenyésztünk. A Vero-sejt meghatározásnál sárga szín jelzi az életképes, vörös szín pedig az elhalt sejteket. Ha a sejteknek csupán egy része halt el, az eredmény narancsszín lehet. Reagensek és felszerelés Módosított MEM. Minimum Essential Medium (MEM) Earle-féle sókkal, L- glutamin és nátrium-bikarbonát nélkül. Módosított 199-es táptalaj. 199-es táptalaj Hank-féle oldattal és L-glutaminnal,

18 Adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének... Ph.Hg.VIII. Ph.Eur nátrium-bikarbonát nélkül. Magzati szarvasmarhaszérum. Nátrium-bikarbonát 7,5%-os oldata. Tripszinoldat: tripszin 2,5%-os oldata. EDTA oldat: etiléndiamin-tetraecetsav 0,02%-os (Verzene 1:5000) oldata. Módosított D-PBS. Dulbecco-féle sótartalmú foszfát tompítóoldat (D-PBS), kalcium és magnézium nélkül. L-glutamin 200 mm töménységű oldata. Penicillin/sztreptomicin oldat. Primer táptalaj. 50 ml módosított MEM-hez 440 ml R vizet, L-glutamin 200 mm töménységű oldatának 5 ml-ét és nátrium-bikarbonát 7,5%-os oldatának 10 ml-ét elegyítjük. Ezen táptalaj 25 ml-éhez magzati szarvasmarhaszérum 1,25 ml-ét adjuk. Fenntartó táptalaj. A primer táptalajjal azonos, azzal az eltéréssel, hogy az 1,25 ml helyett 0,5 ml magzati szarvasmarhaszérumot adunk 20 ml dúsított MEM-táptalajhoz. A-táptalaj. 50,0 ml módosított 199-es közeghez 440,0 ml R vizet, L-glutamin 200 mm-os oldatának 5,0 ml-ét és nátrium-bikarbonát 7,5%-os oldatának 10,0 ml-ét elegyítjük. B-táptalaj. 150,0 ml A-táptalajhoz 3,0 ml magzati szarvasmarhaszérumot és 0,3 ml penicillin/sztreptomicin oldatot elegyítünk. C-táptalaj. 22,0 ml A-táptalajhoz 0,44 ml magzati szarvasmarhaszérumot és 0,44 ml penicillin/sztreptomicin oldatot elegyítünk. A Vero-sejteket szövettenyésztő lombikokban (pl. 75 cm 2 /250 ml) 36±1 C hőmérsékletű inkubátorban tenyésztjük, 5% CO 2 -tartalom és 90% relatív páratartalom mellett. A sejteket először a primer táptalajon tenyésztjük. 2-3 nap növekedés után a primer táptalajt a fenntartó táptalajra cseréljük. Amint összefolyó egysejtréteg keletkezik, a felülúszó tenyészfolyadékot elöntjük, és a sejtréteget módosított D-PBS folyadékkal óvatosan mossuk. A lombikba ezután 1 térfogatrész tripszin oldat és 1 térfogatrész EDTA oldat elegyét adjuk. A lombikot enyhe körkörös mozgatással keverjük és a CO 2 -inkubátorban addig inkubáljuk (kb. 3 perc), amíg a sejtek egysejtrétegről történő letöredezése meg nem indul. A lombik oldalát ezután erőteljesen kopogtatva elősegítjük a sejtek leesését. A sejteket homogén szuszpenzió készítése céljából 5-6 ml friss C-táptalajjal újraszuszpendáljuk. A C-táptalajjal kb sejt/ml tartalmú szuszpenziót készítünk.

19 Adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének... Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Mindegyik mélyedésbe az 1. oszlop kivételével 25 µl B-táptalajt mérünk. Az A1, A2 és A11 mélyedésekbe tengerimalac diftéria-antiszérum (humán felhasználású vakcinákhoz) (pozitív kontrollszérum, 0,40 NE/ml tartalmú munkahígítás B-táptalajban) µl-ét mérjük. Az 1., 2. és 11. oszlopok B-G mélyedéseibe µl tengerimalac szérummintát mérünk. Az 1., 2. és 11. oszlopok H sorába µl negatív kontrollszérumot mérünk. Többcsatornás mikropipettát használva, végig a lemezen, (az A-G sorokban a 2-es oszloptól a 10- es oszlopig és a H sor 8-as oszlopáig) felezőhígítást végzünk. Az A-G sorok 10-es oszlopában levő mélyedésekből és a H8 mélyedés tartalmából µl folyadékot elvetünk. A diftériatoxint izotóniás sóoldattal feloldjuk úgy, hogy 50 NE/ml tartalmú oldatot nyerjünk. Ebből a diftériatoxin-hígításból a B-táptalajjal 50-szeres hígítást készítünk, hogy 1,0 NE/ml tartalmú munkaoldatot kapjunk. Ezen munkaoldat 25 µl-ét az A12-es és a B12-es mélyedésekbe visszük (toxin kontroll). A B12-estől a H12-es mélyedésekig felező hígítást végzünk úgy, hogy 25 µl-t viszünk át az egyik mélyedésből a következőbe. Az egyes hígítások között cseréljük a pipettavéget. A H12 mélyedés tartalmából elvetünk 25 µl-t. A B12-H12 mélyedésekbe a B-táptalaj µl-ét mérjük, majd a diftériatoxin munkahígításból (1,0 NE/ml) µl-t mérünk az 1-10 oszlopok A-H sorainak mindegyik mélyedésébe, kivéve a H9 és H10 mélyedéseket (csak sejtek, szérum és toxin nélkül). A lemezeket ezután fedővel lefedjük és enyhén összerázzuk, majd CO 2 - inkubátorban, párás tartályban, legalább 2 órán át 37 C-on inkubáljuk. Ezt követően mindegyik mélyedésbe 200 µl, ml-enként sejtet tartalmazó sejtszuszpenziót mérünk. A lemezeket ezután zárólemezzel lefedjük és 5 napon át 37 C-on inkubáljuk. A mikrobiológiai szennyezőkre mikroszkópos ellenőrzést végzünk. A sárga mélyedéseket negatívként regisztráljuk, míg a vörösszínű mélyedéseket pozitívként értékeljük, ez utóbbiak az elhalt sejteket jelzik. A sárga és a vörös közötti szín az életképes és az elhalt sejtek keverékét jelzi, ezt pozitív/negatívként értelmezzük. A színváltozáson alapuló eredmények mikroszkópos vizsgálattal megerősíthetők, az életképes és az elhalt sejtek összeszámlálásával. A tengerimalac antiszérumminták hatóértékét úgy kapjuk meg, hogy összehasonlítjuk a toxin teljes semlegesítését mutató standardkészítmény utolsó mélyedését az ugyanezen hatást mutató minta utolsó mélyedésével. A hatóérték számításánál figyelembe kell venni, hogy a végpont egy negatív mélyedés és egy pozitív/negatív mélyedés között is lehet. 2. Módszer. Az életképes sejtek mitokondriális dehidrogenáza a tiazolilkék MTT-t egy kék/fekete formazán-termékké redukálja és ily módon lehetővé teszi a jelenlevő élő sejtek kvantitatív mérését; a pozitív reakció jelzi, hogy az antitoxin semlegesítette a toxint. Fehér vagy színtelen mélyedések az életképes sejtek hiányára utalnak, jelezve, hogy az antitoxin elégtelen a toxin semlegesítésére.

20 Adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének... Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Reagensek és felszerelés MEM (Minimal Essential Media). Újszülött borjúszérum. Antibiotikum oldat (ml-enként egység penicillint, 10 mg sztreptomicint és 25 µg amfotericin B-t tartalmaz). L-glutamin 200 mm-os oldata. Tripszin-EDTA. Tiazolilkék MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium-bromid]. 1 M HEPES tompítóoldat (ph 8,1). 18,75 g HEPES-t 82,5 ml R vízben és 30,0 ml 2 M nátrium-hidroxidban oldunk. Glükóz oldat (10%-os). Teljes táptalaj. 200 ml MEM, 10 ml újszülött borjúszérum, 3,0 ml 1 M HEPES tompítóoldat (ph 8,1), 2,0 ml glükóz-oldat (10%), 2,0 ml antibiotikum oldat és 2,0 ml L-glutamin 200 mm-os oldatának elegye. Sótartalmú foszfát tompítóoldat (ph 7,2) (PBS). 10,0 g R nátrium-kloridot, 0,75 g R kálium-kloridot, 1,44 g R dinátrium-hidrogén-foszfát-dodekahidrátot és 0,125 g R kálium-dihidrogén foszfátot R vízzel 1000,0 ml-re oldunk. A ph-t szükség esetén beállítjuk (2.2.3). Az oldatot 15 percig 120 C-on autoklávozzuk. Tiazolilkék MTT oldat. 0,1 g tiazolilkék MTT-t 20 ml PBS-ben oldunk. Az oldatot szűréssel (0,2 µm) sterilezzük és sötét palackban tároljuk. ph-beállító oldat. 40 ml R ecetsavat 1,25 ml 1 M sósav mérőoldattal és 8,75 ml R vízzel elegyítünk. Kivonó tompítóoldat (ph 4,7). 10 g R nátrium-laurilszulfátot R vízben oldunk és 50 ml R dimetilformamid hozzáadása után R vízzel 100 ml-re hígítunk. Az oldat ph-ját megfelelő mennyiségű ph-beállító oldattal beállítjuk (2.2.3). A Vero-sejteket szövettenyésztő lombikokban (pl. 75 cm 2 /250 ml) 36±1 C hőmérsékletű inkubátorban, 5% CO 2 -tartalom és 90% relatív páratartalom mellett, teljes táptalajban tenyésztjük. 6-7 nap növekedés után összefolyó egysejtréteg keletkezik, a felülúszó tenyészfolyadékot elöntjük, és a sejtréteget tripszin-edtaval 3-szor mossuk: a közeget óvatosan kipipettázzuk, 0,5-1 ml tripszin-edta hozzáadása után a lombikot körkörösen mozgatjuk, majd a tripszint kiöntjük. Ezt a műveletet kétszer elvégezzük, és harmadszorra a lombikot 5 percre az inkubátorba helyezzük, amíg a sejtek letöredezése az egysejtrétegről meg nem indul. A sejtek leesését a palack falának erőteljes kopogtatásával elősegítjük. A sejteket 6-25 ml frissen készült teljes táptalajjal homogén szuszpenzió készítése céljából

21 Adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének... Ph.Hg.VIII. Ph.Eur újraszuszpendáljuk. Teljes táptalajban kb sejt/ml tartalmú szuszpenziót készítünk. Az 1. oszlop kivételével mindegyik mélyedésbe 50 µl teljes táptalajt mérünk. Az A1 mélyedésbe 100 µl, az A11 mélyedésbe pedig 50 µl tengerimalac diftériaantiszérumot (humán felhasználású vakcinához) (pozitív kontrollszérum, 0,12 NE/ml tartalmú munkahígítás teljes táptalajban) mérünk. A B1-G1 mélyedésekbe szükség esetén hígítva tengerimalac szérumminták µl-ét mérjük. Ugyanezen minta µl-ét a megfelelő sor B11-G11 mélyedéseibe visszük. A negatív kontrollszérum 100 µl-ét a H1 mélyedésbe, 50 µl-ét a H11 mélyedésbe mérjük. Többcsatornás mikropipettát használva felező hígítást végzünk végig a lemezen, az egyik mélyedésből a következőbe (az 1-11 oszlopból az A-G sorokba és az 1-8 oszlopból a H sorba) 50 µl-t viszünk át. Ismert aktivitású és Lf-tartalmú diftériatoxint olyan alkalmas munka-törzsoldattá hígítunk, amely teljes táptalajban legalább 4 legkisebb sejtkárosító dózist tartalmaz. A hígított toxin 50 µl-ét mérjük minden egyes mélyedésbe, a következő mélyedések kivételével: H9 és H10 (sejtkontroll), A11-H11 (szérumkontroll) és A12-H12 (toxinkontroll). Az A12 mélyedésbe 100 µl hígított toxint mérünk és felező hígítást végzünk, úgy, hogy végig a lemezen (A12-H12) az egyik mélyedésből a következőbe 50 µl-t viszünk át. A H12 mélyedés tartalmából 50 µl-t elvetünk. A H9 és H10 mélyedésekbe 50 µl teljes táptalajt mérünk. A lemezeket fedővel lefedjük és 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, hogy a toxin semlegesítése megtörténjen. Ezután minden egyes mélyedésbe 50 µl, mlenként közelítőleg sejtet tartalmazó sejtszuszpenziót adunk. A lemezeket lezárjuk és 6 napon át 37 C-on inkubáljuk. Ezt követően mikroszkópos vizsgálattal ellenőrizzük a mikrobiológiai szennyezést. Ezután mindegyik mélyedésbe 10 µl tiazolilkék MTT oldatot mérünk, majd a lemezeket további 2-4 órán át 37 C-on inkubáljuk. Az inkubálás után eltávolítjuk a közeget és mindegyik mélyedésbe 100 µl kivonó tompítóoldatot (ph 4,7) mérünk, majd a lemezeket 37 C-on inkubáljuk és egy éjszakán át állni hagyjuk, elősegítve ezzel a kivonási folyamatot. Amint a kivonás és a szolubilizálás teljessé vált, a lemezeket vizuálisan vizsgáljuk, vagy 570 nm-en leolvassuk az abszorbanciákat. A kék/fekete színű mélyedéseket negatívként regisztráljuk (az összes sejt él, az antitoxin semlegesítette a toxint); a fehér vagy színtelen mélyedések az elhalt sejteket jelzik (nem történt meg a toxin semlegesítése), az ilyen mélyedéseket pozitívként regisztráljuk. A vizsgálati antitoxin hatóértékét úgy kapjuk meg, hogy a referenciaantitoxinkészítmény utolsó, a toxin semlegesítését jelző mélyedését összehasonlítjuk az antitoxin-készítmény utolsó, ugyanezt az effektust mutató mélyedésével. A vizsgált minta semlegesítő antitoxin-titerét a hígítási faktor és a referenciakészítmény végpontbeli NE/ml értékének szorzata adja. A vizsgálat

22 Adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének... Ph.Hg.VIII. Ph.Eur akkor értékelhető, ha a toxinkontroll összes sejtje elhalt, és a referencia-antitoxin legalább az első két vizsgált hígításnál semlegesítést produkál.

23 Biológiai értékmeghatározások Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur /2007: ADSZORBEÁLT TETANUSZ VAKCINA HATÓÉRTÉKÉNEK MEGHATÁROZÁSA A tetanusz-vakcina hatóértékét úgy határozzuk meg, hogy a vakcinát állatoknak (tengerimalacoknak vagy egereknek) adjuk be, és ezt vagy tetanusztoxinnal történő provokáció követi (A- vagy B-módszer), vagy a tengerimalacok szérumában a tetanusztoxoid ellen termelt antitestek titerét határozzuk meg (C-módszer). A vakcina hatóértékét mindkét esetben Nemzetközi Egységekre beállított referenciavakcinával összehasonlítva számítjuk ki. Az A- és a B-módszer helyett azokban az országokban, ahol a bénuláson alapuló módszer nem kötelező, az LD 50 -módszer alkalmazható. Az LD 50 -módszernél az eljárás és az állatok száma megegyezik a bénuláson alapuló módszerben alkalmazottal, azzal a különbséggel, hogy a vizsgálat végpontja a bénulás helyett az állatok elhullása. A Nemzetközi Egység az adszorbeált tetanusztoxoid Nemzetközi Standardja meghatározott mennyiségének hatóértéke. A Nemzetközi Standard Nemzetközi Egységekben kifejezett egyenértékét az Egészségügyi Világszervezet (WHO) állapítja meg. A BRP adszorbeált tetanusz vakcinát a Nemzetközi Standardra vonatkoztatva, Nemzetközi Egységekre kalibrálják. Az adszorbeált tetanusz vakcina meghatározására választott módszer a vizsgálat céljától függ. Az A- vagy a B-módszert kell használni: 1. a vakcinák kifejlesztése során, a termelés validálása céljából előállított gyártási tételek hatóértékének meghatározására; 2. minden alkalommal, amikor az előállítási folyamat jelentős megváltoztatása miatt szükségessé vált annak újravalidálása. Az A- és a B-módszer a vakcina kész gyártási tételeinek rutinszerű hatóértékmeghatározására is használható, de az állatok kímélése érdekében e célra ha lehetséges a C-módszert kell alkalmazni. A fenti 1. és 2. pontban meghatározott eseteket kivéve a C-módszer akkor használható, ha alkalmazhatóságát az adott termék esetében igazolták. E célból megfelelő számú (rendszerint három) kész gyártási tétel hatóértékét kell meghatározni a C-módszert, valamint az A- vagy a B-módszert alkalmazva. Ahol azonos eredetű tetanusztoxoid (Lf/ml-ben kifejezett) hasonló mennyiségeiből különféle (monovalens vagy kombinációs) vakcinákat készítenek, ott feltételezhető, hogy a legnagyobb számú komponenst tartalmazó kombinációra bizonyított megfelelés érvényes a kevesebb összetevőt tartalmazó és a monovalens vakcinákra is. Azokat a kombinált vakcinákat, amelyek teljes sejtes pertussziszkomponenst vagy olyan konjugált b-típusú hemofilusz vakcinát

24 Biológiai értékmeghatározások Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur tartalmaznak, amelyet úgy szereltek ki, hogy tetanusztoxoiddal együtt van jelen az üvegcsében, külön kell értékelni. Diftéria- és tetanuszkomponenseket tartalmazó kombinációk tetanuszkomponens hatóértékének szerológiai meghatározását (C-módszer) az állatok ugyanazon csoportjával végezhetjük, mint amelyet az adszorbeált diftéria vakcina hatóértékének meghatározására (2.7.6) használtunk, amennyiben bizonyított, hogy a tetanusz- és a diftériakomponensek immunizációs körülményei (pl. dózisok, időtartam) a kombinált vakcina esetében is érvényesek. Az alábbiakban leírt hatóérték-meghatározások kísérleti elrendezése a vizsgálati és a referenciakészítmény többszöri hígítását alkalmazza. A többszöri hígítást alkalmazó meghatározások során nyert hatóérték-adatok alapján lehetővé válhat, hogy a kísérleti állatok számának csökkentése mellett is statisztikailag értékelhető eredményeket kapjunk. Ez például egy olyan egyszerűsített modell használatával érhető el, amely mind a vizsgálati, mind az összehasonlító készítmények esetében egyetlen hígítást alkalmaz. Egy ilyen modell lehetővé teszi az analitikus számára annak megállapítását, hogy a vizsgált készítmény hatóértéke szignifikánsan nagyobb-e, mint a megkövetelt minimum, de nem nyújt információt a dózis/válasz görbékről, illetve ezek linearitásáról, párhuzamosságáról és meredekségéről. Az egyszerűsített modell alkalmazásával jelentősen csökkenthető a kísérleti állatok száma, ezért a modell használatát a kísérleti és egyéb tudományos célokra felhasznált gerinces állatok védelméről szóló Európai Egyezmény előírásaival összhangban minden analitikusnak fontolóra kell venni. Ahol egyszeri hígításon alapuló meghatározást alkalmaznak, ott megfelelő mutatók alkalmazásával monitorozni kell a termelés és a vizsgálat állandóságát, és szabályos időközönként (pl. 2 évente) el kell végezni a meghatározást többszöri hígítással is. Szerológiai meghatározások esetén a vizsgálat állandóságának monitorozására alkalmas mutatók a következők: a vakcina referenciakészítmény adott dózisának beadása után kapott antitoxintiterek vagy szérumminta pontszámok átlagértékei és szórásai; ellenőrző minták (pozitív és negatív szérumminták) antitoxin-titerei vagy pontszámai; a pozitív szérum-kontrollmintákra és a referenciavakcinából nyert szérummintákra kapott antitoxin-titerek vagy pontszámok aránya. A-MÓDSZER. PROVOKÁCIÓS VIZSGÁLAT TENGERIMALACOKON A KÍSÉRLETI ÁLLATOK KIVÁLASZTÁSA ÉS CSOPORTOSÍTÁSA A vizsgálathoz azonos törzsállományból származó, egészséges, g testtömegű tengerimalacokat használunk. Azonos nemű tengerimalacokat

25 Biológiai értékmeghatározások Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur használunk, vagy a hímeket és a nőstényeket egyformán osztjuk el a csoportok között. Az állatokat legalább 6 egyenlő csoportra osztjuk; az egyes csoportokban annyi állat legyen, hogy a kapott vizsgálati eredmények megfeleljenek az érvényes meghatározás alább leírt követelményeinek. Ha a provokációra használt toxin aktivitását kell meghatározni, úgy nem-vakcinázott kontrollként további három, egyenként öt tengerimalacból álló csoportot vonunk be a vizsgálatba. A PROVOKÁCIÓRA HASZNÁLT TOXIN KIVÁLASZTÁSA Olyan tetanusztoxin-készítményt választunk, amely ml-enként az 50%-ban bénulást előidéző dózisnak legalább ötvenszeresét tartalmazza. Ha a provokációra használt toxinkészítmény stabilitását igazolták, úgy nem szükséges minden egyes meghatározás során a bénulást előidéző dózis megállapítása. A PROVOKÁCIÓRA HASZNÁLT TOXINOLDAT KÉSZÍTÉSE A provokációra használt toxint közvetlenül a felhasználás előtt alkalmas oldószerrel (pl. nátrium-klorid-tartalmú pepton tompítóoldattal (ph 7,4)) úgy hígítjuk, hogy a kapott, provokációra használt toxinoldat stabil legyen, és mlenként az 50%-ban bénulást okozó dózisnak kb. ötvenszeresét tartalmazza. Szükség esetén a toxinaktivitás meghatározása céljából a provokációra használt toxinoldatot ugyanazzal az oldószerrel 16-szorosára, 50-szeresére és 160-szorosára hígítjuk. A VIZSGÁLATI ÉS AZ ÖSSZEHASONLÍTÓ KÉSZÍTMÉNYEK HÍGÍTÁSA Mind a vizsgálandó vakcinából, mind a referencia-készítményből R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával hígítási sorozatot készítünk, oly módon, hogy a hígítási lépték legfeljebb 2,5 legyen, és a középső hígítások 1,0 ml-es adagjait az egyes tengerimalacokba szubkután oltva, az állatoknak kb. 50%-át védje meg az ezen vizsgálatban előírt mennyiségű, szubkután beadott tetanusztoxin bénulást előidéző hatásától. IMMUNIZÁCIÓ ÉS PROVOKÁCIÓ Minden egyes tengerimalac-csoport egyedeibe a csoporthoz tartozó vakcinahígításból 1,0-1,0 ml-t oltunk szubkután. 28 nap múlva minden állatot az 50%-os bénulást okozó dózis ötvenszeresét tartalmazó provokációra használt toxinoldat 1,0 ml-ével oltunk szubkután. A PROVOKÁCIÓRA HASZNÁLT TOXIN HATÓÉRTÉKÉNEK MEGHATÁROZÁSA Szükség esetén, a provokációra használt toxinoldat három hígításával egy-egy állatcsoportot oltunk, oly módon, hogy három, egyenként öt tengerimalacból álló csoport egyedeibe az adott csoporthoz rendelt toxinoldat-hígításból 1,0-1,0 ml-t oltunk szubkután. Az 50%-os bénulást okozó dózissal megfelelő számú vizsgálatot