5.14. EMBERI FELHASZNÁLÁSRA SZÁNT, GÉNBEVITELT CÉLZÓ GYÓGYSZEREK

Átírás

1 5.14. EMBERI FELHASZNÁLÁSRA SZÁNT, GÉNBEVITELT CÉLZÓ GYÓGYSZEREK Ez az általános fejezet tájékoztató jellegű. 01/2010:51400 Ez az általános fejezet emberi felhasználásra szánt, génbevitelt célzó gyógyszerekről szóló szövegeket tartalmaz. Az alábbiakban leírt szövegek az említett készítmények előállítására és ellenőrzésére vonatkozó követelmények kialakításának alapjait képezik. Egy adott gyógyszer esetében a követelmények alkalmazásáról és további szövegek szükségességéről az illetékes hatóság dönt. A szövegeket úgy tervezték, hogy azok az engedélyezett készítményekre alkalmazhatóak legyenek. Az illetékes hatóság dönti el, hogy az alább leírtak egy részét, vagy egészét mennyiben szükséges a klinikai vizsgálat különböző fázisaiban alkalmazni. A fejezet rendelkezései nem zárnak ki olyan alternatív előállítási és ellenőrzési módszerek alkalmazását, amelyeket az illetékes hatóság elfogadhatónak tart. Az emberi felhasználásra szánt, génbevitelt célzó gyógyszerekre vonatkozó, további részletes ajánlások találhatók az Emberi Felhasználásra Szánt Gyógyszerek Bizottsága (CHMP) által kiadott Note for Guidance on the Quality, Preclinical and Clinical Aspects of Gene Transfer Medicinal Products (CPMP/BWP/3088/99) és Guideline on Development and Manufacture of Lentiviral Vectors (CHMP/BWP/2458/03) ( A génbevitelt célzó gyógyszerek minőségi, preklinikai és klinikai szempontjaira vonatkozó útmutató, és A lentivírus vektorok kifejlesztésére és gyártására vonatkozó útmutató ) című dokumentumokban (beleértve a dokumentumok átdolgozott kiadásait is). DEFINÍCIÓ Ebben az általános fejezetben a génbevitelt célzó gyógyszer (GTMP) kifejezés olyan eljárással előállított készítményt jelöl, amelynek célja valamely profilaktikus, diagnosztikus vagy terápiás gén (azaz egy nukleinsavrész) in vivo vagy ex vivo bevitele emberi vagy állati sejtekbe, és a gén ezt követő in vivo expressziója. A génbevitel egy vírus vagy nem-vírus eredetű vektornak nevezett expressziós rendszerrel történik. A vektort állati vagy emberi sejt is tartalmazhatja. Rekombináns vektorok, például vírusvektorok és plazmidok. A rekombináns vektorokat vagy közvetlenül injektálják a betegbe (in vivo génbevitel) vagy gazdasejtekbe viszik be, mielőtt ezeket a genetikailag módosított sejteket beadnák a betegnek (ex vivo génbevitel). A vírusvektorok különböző vírusokból származnak (például adenovírusokból, himlővírusokból, retrovírusokból, lentivírusokból, adeno-társultvírusokból, herpeszvírusokból). Ezek a vektorok szaporodók, nem szaporodók vagy feltételesen szaporodók lehetnek. A plazmidvektorok a nukleinsavakat egyszerű (például csupasz DNS) vagy különböző molekulákkal (pl. lipidekkel, polimerekkel) kapcsolt formában tartalmazhatják. A GTMP-vel bevitt genetikai anyag olyan nukleotidszekvenciákból áll, amelyek géntermékeket, antiszensz transzkriptumokat vagy riboszomális enzimeket kódolhatnak. A kémiai úton szintetizált oligonukleotidok nem tartoznak ezen általános fejezet tárgyköréhez. A bevitelt követően a bevitt genetikai anyag a vektor integráló vagy nem integráló státuszától függően maradhat citoplazmatikus vagy episzomális, illetve beépülhet a gazdasejt genomjába. Genetikailag módosított sejtek. A genetikailag módosított eukarióta- vagy baktériumsejtek olyan, vektorok által módosított sejtek, amelyek a kívánt terméket expresszálják. ELŐÁLLÍTÁS 1

2 Az előállítás során használt anyagok. A gyártás során felhasznált nyersanyagokat, beleértve a vírus oltócsíra-tételt és adott esetben a sejtbank-rendszert, minősíteni kell. Indokolt esetek kivételével, minden anyagot megfelelő gyártóhelyen, elismert minőségbiztosítási rendszer keretein belül kell előállítani. A készítmények azonosságának, (adott esetben) hatóértékének, tisztaságának és mikrobiológiai minőséggel, valamint bakteriális endotoxin szennyezéssel összefüggő ártalmatlanságának ellenőrzésére megfelelő specifikációkat kell kialakítani. A felhasznált víz minősége feleljen meg az ide vonatkozó megfelelő cikkelyeknek (Tisztított víz (0008), Nagytisztaságú víz (1927), Injekcióhoz való víz (0169)). Adott esetben a felhasznált szarvasmarha szérum feleljen meg a Szarvasmarha szérum (2262) cikkely követelményének. Amennyiben lehetséges, az előállítás során mellőzni kell az antibiotikumok használatát. Vírusbiztonság. Lásd az fejezet követelményeit. Fertőző szivacsos agyvelőbetegség (5.2.8). A fertőző szivacsos agyvelőbetegségre vonatkozóan kockázatbecslést kell végezni, és a kockázat minimalizálására megfelelő intézkedéseket kell végrehajtani. Rekombináns vektorok ELŐÁLLÍTÁS ÁLTALÁNOS RENDELKEZÉSEK A vírusvektorok előállítása, amennyiben lehetséges, sejtbank rendszeren és vírus oltócsíra-rendszeren alapul. A plazmidvektorok előállítása baktérium-sejtbank rendszeren alapul. Az előállítási eljárásnak bizonyítottan állandó minőségű vektort kell eredményeznie. Indokolt és engedélyezett esetektől eltekintve, a késztermékben levő vektor nem mehet át a kiinduló oltócsíra törzstételtől számított több átoltáson vagy szubkultúrán, mint az a vektor, amely a klinikai vizsgálatban ártalmatlanság és hatékonyság szempontjából megfelelőnek bizonyult. A VEKTORSZAPORÍTÁSHOZ HASZNÁLT SZUBSZTRÁTUM A felhasznált szubsztrátumok feleljenek meg az Európai Gyógyszerkönyv (5.2.2, fejezet és ezen általános fejezet Emberi felhasználás céljára szánt plazmidvektorok előállítására használt baktériumsejtek című alfejezete) ide vonatkozó követelményeinek. A VEKTOR JELLEMZÉSE A vektor előállításával kapcsolatos adatokat, beleértve a vektor eredetét és a későbbi változtatásokat különös tekintettel a kivágott és módosított régiókra dokumentálni kell. A vektort megfelelő validált módszerekkel kell jellemezni. A vektor genetikai stabilitását a gyártás során alkalmazott legnagyobb (vagy azt meghaladó) passzázs számnál, vagy a vektorszaporításra használt sejtvonal legnagyobb (vagy azt meghaladó) sejtosztódási számánál megfelelő módszerekkel vizsgálni kell. SZAPORÍTÁS ÉS ARATÁS A sejtbankokkal és az ezekből származó sejttenyészetekkel végzett minden műveletet olyan területen kell végezni, ahol egyidejűleg nem dolgoznak más sejtekkel vagy vektorokkal. A sejtszuszpenziók készítése 2

3 során használt minden állati vagy emberi eredetű anyagot, valamint a sejttenyésztő tápfolyadékot minősíteni kell. Az aratás tisztaságát az egyes alfejezetekben leírt megfelelő vizsgálatokkal igazolni kell. TISZTÍTOTT ARATÁS Az ömlesztett hatóanyagot a tisztított rekombináns vektorok (vírusvektorok, illetve csupasz vagy komplex plazmidok) gyártási tétele képezi. KÉSZTERMÉK Indokolt és engedélyezett esetektől eltekintve, a késztermék formulálása és szétosztása aszeptikus körülmények között, steril tartályok felhasználásával történik (3.2). A késztermék stabilitásának értékelésénél olyan stabilitási terveket kell alkalmazni, amelyek az eltartási időt, a tárolási körülményeket, a vizsgálandó gyártási tételek számát, a vizsgálat rendjét és az elvégzendő meghatározásokat is tartalmazzák MEGHATÁROZÁSOK ÉS VIZSGÁLATOK A GTMP-k feleljenek meg a megfelelő alfejezetekben leírt meghatározások és vizsgálatok követelményeinek. Genetikailag módosított sejtek A rekombináns vektorral módosítandó sejtek esetében a rekombináns vektorra vonatkozó adatokat a Rekombináns vektorok részben leírtak szerint kell dokumentálni. ELŐÁLLÍTÁS SEJTSZUBSZTRÁTUM Xenogén sejvonalak esetében, ideértve a baktériumsejteket is, törzs- és szaporító-sejtbankot is magában foglaló sejtbank-rendszert kell létrehozni. Amennyiben lehetséges, autológ és allogén sejtek esetében is törzs- és szaporító-sejtbankot is magában foglaló sejtbank-rendszert kell létrehozni. TRANSZFEKCIÓ/TRANSZDUKCIÓ A rekombináns vektor felhasználásával (plazmiddal vagy vírusvektorral) transzfektált vagy transzdukált sejteket, a Rekombináns vektorok részben leírtak szerint minősíteni, az eljárást pedig validálni kell. A sejteket aszeptikus körülmények között kezeljük olyan helyen, ahol egyidejűleg nem dolgoznak más sejtekkel vagy vektorokkal. A sejtmanipuláció lépései során felhasznált összes reagensnek teljes mértékben minősítettnek kell lennie. Indokolt és engedélyezett esetek kivételével, az antibiotikumok használatát mellőzni kell. A transzfekciót és transzdukciót aszeptikus körülmények között kell elvégezni. KÉSZTERMÉK Fagyasztva tárolás esetén a genetikailag módosított sejtek életképességét a fagyasztás előtt, valamint a felolvasztás után is vizsgálni kell. 3

4 Ha a sejteket rövid időn belül nem használják fel, a stabilitást a sejtek életképességének és a bevitt gén kifejeződésének igazolásával határozzuk meg. Abban az esetben, ha a genetikailag módosított sejteket az emberi felhasználás előtt mikrokapszulázzák, a mikrokapszulázáshoz felhasznált valamennyi komponenst a késztermék részének kell tekinteni, és következésképpen ezek minőségellenőrzését és teljes körű jellemzését (például fizikai épség, szelektív permeabilitás, sterilitás) is el kell végezni. MEGHATÁROZÁSOK ÉS VIZSGÁLATOK A xenogén, allogén és autológ sejtek ellenőrzése a következőket foglalja magában: a sejtek azonosítása, számlálása és életképességük meghatározása; a beillesztett gén általános épségének és funkciójának vizsgálata, a sejtenkénti kópiák számának, valamint a génbevitel és -kifejeződés hatékonyságának meghatározása; mikrobiológiai vizsgálatok (2.6.1 vagy ), az endotoxintartalom, a mikoplazma- (2.6.7) és az esetleges vírusszennyezettség meghatározása, adott esetben a vektorszaporodás vizsgálata. Ahol a sejtek korlátozott hozzáférhetősége miatt indokolt, az illetékes hatóság csökkentett vizsgálati programot is jóváhagyhat. A termék bizonyos vizsgálatok befejezése előtt is felszabadítható, amennyiben erre valamilyen időkorlát miatt szükség van. EMBERI FELHASZNÁLÁSRA SZÁNT PLAZMIDVEKTOROK DEFINÍCIÓ Az emberi felhasználásra szánt plazmidvektorok kettősszálú, gyűrű alakú bakteriális DNS-molekulák, amelyek vagy a szóban forgó gént, vagy az antiszensz szekvenciát vagy riboszomális enzimeket kódoló nukleotidszekvenciát és ezek expressziós kazettáját hordozzák. Sokszorozódásuk a baktériumokban a kromoszómán kívül (extrakromoszomálisan) történik. A plazmidvektorokat arra használják, hogy emberi sejtekbe in vivo genetikai anyagot vigyenek át, vagy hogy segítségükkel autológ, allogén, xenogén, vagy bakteriális sejteket genetikailag módosítsanak az emberi felhasználást megelőzően. A plazmidvektorok jelen lehetnek csupasz DNS-ként, de kombinálhatják őket mesterséges szállítórendszerekkel, például lipidekkel (lipoplexek), polimerekkel (poliplexek) és/vagy peptidligandumokkal is, amelyek elősegítik a sejtmembránon történő átjutást és a sejtbe való bejutást, vagy amelyek specifikus receptoron keresztül történő szállítást tesznek lehetővé. A mesterséges szállító rendszerekhez kapcsolt plazmidok nem képezik jelen fejezet tárgyát. ELŐÁLLÍTÁS A PLAZMIDOK FELÉPÍTÉSE A plazmidvektor általában a következőkből áll: a plazmidvektor gerince, amely egyrészt restrikciós endonukleáz felismerési helyeket tartalmaz a genetikai inzertek beillesztésére, másrészt a plazmid előállításhoz szükséges bakteriális 4

5 alkotóelemeket, például olyan szelektálható genetikai markereket, amelyekkel a rekombináns vektort hordozó sejtek felismerhetők; a genetikai inzert kifejeződésének elősegítéséhez szükséges szabályozó genetikai alkotóelemek; a genetikai inzert; egy poliadenilációs jel. A plazmid DNS-t nukleotidszekvenciáját is beleértve teljes körűen jellemezni kell, a genetikai inzert azonosításával, eredetével, izolálásának módjával és nukleotidszekvenciájával együtt. A plazmid alkotóelemeinek forrását és funkcióit, mint például a replikációs, vírus- és eukarióta promótereket, valamint a szelekciós markereket kódoló géneket, dokumentálni kell. ÁLTALÁNOS ELŐÍRÁSOK Sejtbankok. A plazmidvektorok előállítása bakteriális sejtbankrendszer létrehozásán és jellemzésén alapul, amely törzssejtbankból (master cell bank: MCB), a szaporító-sejtbankokból (WCB) és a végterméksejtekből (EOPC) áll. A rendszer elemeinek meg kell felelnie az ezen általános fejezet Emberi felhasználásra szánt plazmidvektorok gyártására használt bakteriumsejtek című alfejezetében előírt követelményeknek. Az előállítás beleértve a sejtbank létesítését is során felhasznált nyersanyagokat minősíteni kell. Szelekciós technikák. Indokolt és engedélyezett esetek kivételével, szelekciós genetikai markerként használt antibiotikumrezisztencia-gének, különösen a klinikumban hasznos antibiotikumok rezisztenciagénjei, nem képezhetik a vektor részét. A rekombináns plazmidokra vonatkozóan előnyösebb egyéb szelekciós technikákat alkalmazni. Referenciastandardok. A formulált plazmid egy megfelelő gyártási tételét, lehetőleg olyat, amelyet klinikailag már értékeltek, teljes körűen jellemezni kell, és a rutinszerűen végzett ellenőrző vizsgálatokhoz szükséges referenciastandardként kell használni. SZAPORÍTÁS ÉS ARATÁS A plazmid DNS-t a gazdatörzs baktérium sejtjeibe viszik, és az MCB létrehozásához a transzformált baktérium egyetlen klónját felszaporítják. Innentől kezdve a WCB-t az MCB-ből származtatják. Az EOPC-ket a WCB-ből, az előállítási körülmények között végzett fermentálással nyerik. Ahhoz, hogy a letöltés előtti késztermékhez eljussanak, a plazmid DNS-t a learatott sejtekből kivonási lépést alkalmazva izolálni, majd tisztítani kell. Indokolt és engedélyezett esetek kivételével, az előállításhoz cézium-klorid etídium-bromid sűrűséggradiens nem használható. A TISZTÍTOTT PLAZMID Az előállítási eljárást úgy kell optimalizálni, hogy az a szennyezők eltávolítását folyamatosan biztosítsa, ugyanakkor a készítmény aktivitása megmaradjon. Egy adott szennyezőre vonatkozó vizsgálat követelményei a következőktől függnek: a gyártási és tisztítási eljárásoknak a szennyező eltávolítására vagy inaktiválására való képessége, amit specifikus kvantitatív módszerek használatával, folyamatvalidálás során igazoltak; a szennyezővel összefüggő potenciális toxicitás; a genetikai inzert hatékonyságának a szennyezővel összefüggő esetleges csökkenése. Ha a szelekciót specifikus antibiotikumrezisztencia alapján végezték, a maradék antibiotikum eltávolításának igazolásához a tisztítási eljárás validálási vizsgálataiból származó adatokra van szükség. 5

6 A folyamat állandó ellenőrzöttségének igazolására megfelelő gyártásközi ellenőrzéseket kell alkalmazni. Ilyen például az egyes extrakciós lépések után a plazmidok mennyiségének és formájának, valamint az endotoxinok mennyiségének meghatározása. Csak olyan tisztított plazmid gyártási tétel használható fel, amely megfelel a következő követelményeknek. A tisztított plazmid azonossága és épsége. A tisztított plazmid azonossága és épsége megfelelő módszerekkel, például szekvenálással vagy nukleinsav amplifikációs technikával (NAT) (2.6.21) állapítható meg. Restrikciós hasításos analízist akkor lehet alkalmazni, ha ez elegendőnek bizonyul a plazmidban potenciálisan végbemenő kritikus változások kimutatására és a plazmid azonosságának megerősítésére. Plazmid DNS. A következő kimutatási módszerek példaként szolgálnak. Az 500 ng/ml-nél nagyobb DNS-koncentrációkat 260 nm-en végzett abszorbancia méréssel lehet meghatározni. Az 50 µg/ml töménységű kettős szálú DNS-oldat abszorbanciája 1 (fajlagos abszorpciós koefficiens: 200). Az 500 ng/ml-nél kisebb DNS-koncentrációkat a kettős szálú DNS-hez specifikusan kötődő fluoreszcens festékkel történő inkubálás után határozzuk meg. A kalibrációs görbe felvételéhez DNS referenciastandardot használva. A plazmid DNS koncentrációjának meghatározására referenciastandard használatával folyadékkromatográfiás módszer is alkalmazható. Egyes esetekben a kapilláris elektroforézis használata is elfogadható. DNS-formák. A plazmid DNS-t, például az alábbiakban megadott megfelelő analitikai módszerek egyikének alkalmazásával, a következő formák aránya szerint jellemezzük: szuperhelikális, multimer, laza monomer és lineáris. A szuperhelikális formák mennyiségi meghatározására aninoncserén alapuló nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiát (HPLC) vagy kapilláris elektroforézist lehet alkalmazni. A kapilláris elektroforézis más formák mennyiségi meghatározására is alkalmas. Maradék gazdasejt-eredetű DNS. Amennyiben az eljárást a gazdasejt-eredetű DNS eltávolítására nem validálták, a maradék koncentrációját megfelelő módszerrel meg kell határozni. Érzékenysége és specifikussága miatt a kvantitatív PCR ajánlott, de egyéb megfelelő technikák is alkalmazhatók. Maradék RNS. Amennyiben az eljárást az RNS eltávolítására nem validálták, a maradék koncentrációját meg kell határozni. Fordított fázisú HPLC (RP-HPLC) vagy alacsonyabb kimutatási határ elérése érdekében kvantitatív reverz transzkriptáz polimeráz-lánc reakció (RT-PCR) használható (2.6.21). Maradék gazdasejt-eredetű fehérje. Ha az eljárást a gazdasejt-eredetű fehérjék eltávolítására nem validálták, a maradék koncentrációját megfelelő standard fehérjemeghatározási módszerekkel (2.5.33) SDS-PAGE-t követő ezüst-festés vagy specifikus immunmeghatározás, például western blot vagy ELISA alkalmazásával meg kell határozni. Mikrobiológiai vizsgálat. Az illető készítménytől függően, a vizsgált plazmid feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményeinek (2.6.1). Más lehetőségként az összes életképes mikroorganizmus-számot (2.6.12) is meghatározhatjuk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint az illető készítményre jóváhagyott határérték. LETÖLTÉS ELŐTTI KÉSZTERMÉK A letöltés előtti késztermék előállítása során több tisztított aratás egyesíthető. Stabilizátor vagy más segédanyagok hozzáadása engedélyezett. A formulált terméket baktérium-visszatartó szűrőn kell szűrni. 6

7 A végső gyártási tétel előállítására csak olyan letöltés előtti késztermék használható, amely megfelel a következő követelménynek. Sterilitás (2.6.1). A készítmény feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményeinek. VÉGSŐ GYÁRTÁSI TÉTEL Csak olyan végső gyártási tétel szabadítható fel, amely az alábbiakban az Azonosítás, Vizsgálatok és Meghatározás címszók alatt megadott követelményeknek megfelel. AZONOSÍTÁS A plazmidvektort restrikciós hasításos analízissel vagy szekvenálással azonosítják. A biológiai aktivitásra vonatkozó vizsgálat is alkalmas a termék azonosítására. VIZSGÁLATOK A végleges gyártási tétellel az alábbi vizsgálatokat kell elvégezni. Küllem. ph (2.2.3): az illető készítményre jóváhagyott határértékeken belül. Kivehető térfogat (2.9.17). A készímény feleljen meg a kivehető térfogat vizsgálat követelményeinek. Maradék nedvesség (2.5.12): az adott fagyasztva szárított készítményre jóváhagyott határértékeken belül. DNS formák. A specifikus monomer szuperhelikális forma százalékos arányát a tisztított plazmidnál leírtak szerint kell meghatározni. Sterilitás (2.6.1). A készítmény feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményeinek. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint az illető készítményre jóváhagyott határérték. MEGHATÁROZÁS Plazmid DNS: nem kevesebb, mint a címkén feltüntetett mennyiség. A meghatározás például az alábbiakban felsorolt módszerek egyikével végezhető. Az 500 ng/ml-nél nagyobb DNS-koncentrációkat 260 nm-en végzett adszorbanciaméréssel lehet meghatározni. 50 µg/ml töménységű ketttős szálú DNS-oldat abszorbanciája 1 (fajlagos abszorpciós koefficiens: 200). Az 500 ng/ml-nél kisebb DNS-koncentrációkat a kettős szálú DNS-hez specifikusan kötődő fluoreszcens festékkel történő inkubálás után határozzuk meg. A kalibrációs görbe felvételéhez DNS referenciastandardot használunk. A plazmid DNS koncentrációjának meghatározására referenciastandard alkalmazásával végzett folyadékkromatográfiás módszer is használható. Egyes esetekben a kapilláris elektroforézis használata is elfogadható. Biológiai aktivitás: ahol erre mód van, a biológiai aktivitást in vitro vagy in vivo biológiai vizsgálatokkal kell elvégezni. Pozitív kontrollként jól meghatározott, reprezentatív referenciastandardot kell használni. A plazmidvektorok meghatározására alkalmazott biológiai módszerek általában a releváns sejtvonal in vitro transzfekcióját jelentik, amit a kifejeződő genetikai inzert valamilyen funkcionális meghatározása követ. 7

8 Az ilyen funkcionális meghatározások a genetikai inzert által kódolt termék aktivitásáról, nem pedig magának a genetikai inzert expressziójának mértékéről adnak információt. Az expresszált termék épségének és mennyiségének meghatározásakor szükségessé válhat, hogy a biológiai módszereket western blot, vagy ELISA módszerekkel is kiegészítsék. FELIRAT A feliratnak tartalmaznia kell: a plazmid DNS koncentrációját; az ajánlott humán adagot; fagyasztva szárított készítmények esetében: az oldószer nevét és térfogatát; azt az időtartamot, amelyen belül a feloldott készítményt fel kell használni. EMBERI FELHASZNÁLÁSRA SZÁNT PLAZMIDVEKTOROK ELŐÁLLÍTÁSÁRA HASZNÁLT BAKTÉRIUMSEJTEK Az emberi felhasználásra szánt plazmidvektorok előállítása baktériumsejtbank-rendszer használatán alapul, a törzssejtbank (master cell bank: MCB), a szaporító-sejtbankok (WCB) és a végterméksejtek (EOPC) kialakításával és jellemzésével. A plazmidvektorok gyártására szolgáló baktériumsejtbank olyan, baktériumsejteket tartalmazó ampullák gyűjteménye, amelyeket meghatározott körülmények között azonos összetételben tárolnak, és amelyek a transzformált gazda-törzs egyetlen klónjából származó sejtek keverékéből származnak. Az MCB-nek ismert, dokumentált történettel kell rendelkeznie, és lehetőleg minősített letéti forrásból kell származnia. A WCB-t az MCB-ből származó egy vagy több ampulla elszaporításával állítják elő. A banki állomány előállításánál használt módszereket és reagenseket, valamint a tárolási körülményeket dokumentálni kell. Az MCB-ket és a WBC-ket a banki állomány egy adott mennyiségének vagy a sejtbank egy szubkultúrájának vizsgálatával minősítik. A következő táblázat mutatja be azokat a vizsgálatokat, amelyeket az előállítás minden egyes lépésénél el kell végezni. 8

9 Meghatározás Gazdatörzs MCB WCB EOPC-k* Azonosság és tisztaság Életképesség A baktériumtörzs jellemzése - Genotipizálás/fenotipizálás - A plazmid jelenléte a DNS plazmid szekvenciája a kópiák száma restrikciós térkép a plazmidot megtartó sejtek %-a Véletlenszerű kórokozók Tisztaság, szélesztéssel Bakteriofágok jelenléte *Az EOPC-k olyan sejtek, amelyek legalább annyi átoltásból származnak, amennyit az előállítás során alkalmaznak. Az analízist minden egyes új WCB validálására egyszer kell elvégezni, kivéve a tisztaságot, amelyet minden fermentálás esetében vizsgálni kell. - - AZONOSÍTÁS ÉS TISZTASÁGI VIZSGÁLAT Életképesség. Az életképes sejtek számának meghatározása a baktériumsejtek hígított alikvotjából, megfelelő tápfolyadékra való szélesztés után, az egyedi telepek számlálásával történik. A baktériumtörzsek biokémiai és élettani jellemzése. Az előállításra szánt baktériumtörzstől függően, a sejt azonosságának faji szinten történő igazolására, megfelelő biokémia és élettani vizsgálatokat kell végezni. Genotipizálás/fenotipizálás. A baktériumsejtek genotípusát a megfelelő specifikus fenotípusmarkerekkel vagy megfelelő genetikai analízissel határozzuk meg. A plazmid jelenléte Szekvenálás. A plazmid teljes nukleinsavszekvenciáját igazolni kell. Kópiák száma. A plazmid DNS izolálása és tisztítása ismert számú baktériumból történik, a kópiák száma megfelelő módszer, például kvantitatív PCR (2.6.21) alkalmazásával határozható meg. Restrikciós térkép. A restrikciós endonukleáz hasítást megfelelő felbontásban kell elvégezni, annak igazolására, hogy a baktériumsejtekben a plazmid szerkezete változatlan maradt. A plazmidot megtartó sejtek százaléka. Azon baktériumok százalékos arányának meghatározására, amelyek a plazmidot megtartották, a plazmidban jelen lévő bakteriális elemek, például a szelektálható genetikai markerek használhatók fel. VÉLETLENSZERŰ KÓROKOZÓK ÉS ENDOGÉN VÍRUSOK A tisztaság vizsgálata szélesztéssel. Az esetleges baktériumszennyezés kimutatása céljából a baktériumsejteket megfelelő táptalajon szélesztik és az előírt körülmények között inkubálják. A szennyező organizmusok növekedése gátlásának vizsgálatára további vizsgálatokat kell végezni, meghatározott 9

10 számú releváns pozitív kontroll baktérium jelenlétében. Megfelelő számú telep vizsgálata során szennyezés nem fordulhat elő. Bakteriofágok jelenléte. A bakteriofágok jelenlétének vizsgálatára a baktériumsejteket olyan táptalajra oltva inkubálják, amely lehetővé teszi a bakteriofágok szaporodását. A vizsgálat validálása referencia bakteriofágtörzs és a szaporodásukat lehetővé tevő sejtek mint pozitív kontrollok felhasználásával történik. Megfelelő számú telepet vizsgálva, szennyezés nem fordulhat elő. EMBERI FELHASZNÁLÁSRA SZÁNT ADENOVÍRUS VEKTOROK DEFINÍCIÓ Az emberi felhasználásra szolgáló adenovírus vektorok fagyasztva szárított vagy folyékony rekombináns adenovírus-készítmények, amelyeket genetikailag úgy módosítottak, hogy alkalmazásuk révén emberi szomatikus sejtekbe genetikai anyagot lehessen bevinni in vivo vagy ex vivo. ELŐÁLLÍTÁS A VEKTOR FELÉPÍTÉSE Az adenovírus vektor tervezésére és létrehozására különböző megközelítések léteznek. Az optimális megközelítést a klinikai felhasználás célja határozza meg. Olyan módszert kell választani, amely a replikációra képes adenovírus vektorok termelődésének kockázatát a lehető legkisebbre csökkenti, vagy amely a lehetséges segítő (helper) vírusokat az előállítás során hatékonyan megsemmisíti. A VEKTOR ELŐÁLLÍTÁSA Az előállítási eljárásnak bizonyítottan állandó minőségű vektort kell eredményeznie. Indokolt és engedélyezett esetektől eltekintve, a késztermékben levő vektor nem mehet át a kiinduló oltócsíra törzstételtől számított több átoltáson, mint az a vektor, amelyik a klinikai vizsgálatok során ártalmatlanság és hatékonyság szempontjából megfelelőnek bizonyult. A vektor genetikai és fenotípusos stabilitását a termelésben alkalmazott legnagyobb átoltásszámnál (vagy azon túlmenően) megfelelő módszerrel vizsgálni kell. A VEKTOR SZAPORÍTÁSÁRA HASZNÁLT SZUBSZTRÁTUM A vektor szaporítása sejtbankrendszeren alapuló, folyamatosan fenntartott sejtvonalakon (5.2.3) történik. A replikációra képes adenovírusok keletkezése jelentős lehet, ha a vírusgenom és a komplementáló sejtek genomja között nagyfokú homológia fordul elő. Ezt az előfordulást a két genom közötti homológia csökkentésével minimalizálni lehet. Ajánlatos az előállításra olyan sejteket használni, amelyek a vektorral semmilyen homológ szekvenciát nem mutatnak. VEKTOR OLTÓCSÍRATÉTEL A vektor előállítása oltócsírarendszeren alapul. A felhasznált adenovírustörzs azonosítását a törzsre vonatkozó előzetes feljegyzések alapján amelyek a vírus eredetére és a későbbi manipulációkra, elsősorban a kivágott vagy módosított területekre vonatkozó információkat is tartalmazzák végezzük el. A genetikai inzert(eke)t (beillesztéseket) és a szomszédos 10

11 szabályozó régiókat, beleértve a nukleotidszekvenciát is, részletesen le kell írni. Dokumentálni kell azt a módszert is, amellyel a beillesztett genetikai anyagot a vektorba bevitték. A vektor előállítására csak olyan oltócsíratétel használható, amely megfelel a következő követelményeknek. Azonosítás. A vektor az oltócsíra-törzstételben és minden oltócsíra-szaporítótételben immunkémiai módszerekkel (2.7.1), nukleinsav amplifikációs technikákkal (NAT) (2.6.21) vagy restrikciós hasításos analízissel azonosítható. Genetikai és fenotípusos jellemzés. A következő vizsgálatokat végezzük el. A vektor genomjának teljes szekvenálását a termék egy gyártási tételének megfelelő átoltásszinten végezzük, és az analitikailag meghatározott szekvenciát összehasonlítjuk a vektor kialakításának adatain, valamint a rendelkezésre álló adatbázisokon alapuló elméleti szekvenciával. A vektor DNS-ének restrikciós hasításos analízisét az oltócsíra-törzstételen, minden egyes oltócsíraszaporítótételen és a termék egy gyártási tételén végezzük el. A vírus DNS-t kivonjuk, tisztítjuk, és megfelelő módon hasítjuk. A hasított fragmentumokat gélelektroforézissel vagy kapilláris elektroforézissel elválasztjuk, és az észlelt restrikciós mintázatot a vektor kialakításának adatain alapuló elméleti restrikciós mintázattal hasonlítjuk össze. A beillesztett genetikai anyag (genetikai inzert) termékének (termékeinek) expressziójára és biológiai aktivitására vonatkozóan megfelelő számú izolált szubklónt vizsgálunk, a termék gyártási tételéhez hasonló átoltásszinten. Az alacsonyabb szintű kifejeződést vagy biológiai aktivitást mutató szubklónok esetében további jellemzésre van szükség. A vektor koncentrációja. A fertőző vektor titerét vagy a vektorrészecskék koncentrációját az oltócsíratörzstételben és minden egyes oltócsíra-szaporítótételben meghatározzuk. Idegen kórokozók (2.6.16). Az oltócsíra-törzstétel és minden egyes oltócsíra-szaporítótétel feleljen meg az idegen kórokozókra előírt vizsgálat követelményeinek. Replikációra képes adenovírusok (RCA-k). Az RCA-k a rekombináns vírus DNS és a komplementáló sejtek genomjába integrált adenovírus szekvenciák homológ rekombinációi révén jönnek létre. Az RCA-k kimutatására az illetékes hatóság által jóváhagyott, megfelelő módszert használunk. Általában fertőzési meghatározást végzünk, olyan érzékeny detektor sejtvonalakon, amelyek nem képesek a vektorból kivágott géneket komplementálni. Szükség szerint a vírusszaporodás egyéb indikátorai is használhatók. Ha a vizsgálandó mintában, a vektor kialakítása és az alkalmazott sejtvonalak alapján, RCA-k jelenléte nem feltételezhető, úgy adott esetben a detektor sejtvonalon legalább 2, de lehetőleg 3 vagy 4 egymást követő továbboltását kell végezni. A továbboltások végén tapasztalt sejtkárosító hatás a készítményben levő RCA-k jelenlétét jelzi. Minden egyes meghatározás pozitív kontrollokat is tartalmaz, az érzékenység nyomon követésére. Ha a vizsgálandó mintában az RCA-k jelenléte feltételezhető, plakk meghatározást vagy a detektor sejtvonalon határhígítási meghatározást végzünk. SZAPORÍTÁS ÉS ARATÁS A sejtbankkal, illetőleg az ebből származó sejttenyészetekkel végzett műveleteket megfelelően elkülönített helyen kell végezni, ahol egyidejűleg nem dolgoznak más sejtekkel vagy más vektorokkal. A sejtszuszpenziók készítése során használt minden állati vagy emberi eredetű anyagnak, valamint a sejttenyésztő folyadékoknak minősítettnek kell lenniük. A sejttenyésztő folyadék tartalmazhat phindikátort, például fenolvöröst és, a legalacsonyabb hatékony koncentrációban, megfelelő antibiotikumokat is, de az előállítás során antibiotikummentes szubsztrátum használata előnyösebb. 11

12 Indokolt és engedélyezett esetek kivételével, az előállítás semmilyen szakaszában nem alkalmazható penicillin vagy sztreptomicin. Az előállított sejttenyészetek egy részét mint nem fertőzött sejttenyészetet (kontroll sejtek) félre kell tenni. Tisztított aratás készítésére azok az aratások használhatók, amelyek megfelelnek az alábbi követelményeknek. Azonosítás. A vektort immunkémiai módszerekkel (2.7.1), NAT (2.6.21) alkalmazásával vagy restrikciós hasításos analízissel kell azonosítani. A vektor koncentrációja. Az egyedi aratásokban meg kell határozni a fertőző vektor titerét és a vektorrészecskék koncentrációját. Idegen kórokozók (2.6.16). Az egyedi aratás feleljen meg az idegen kórokozókra előírt vizsgálat követelményeinek. Kontroll sejtek. A kontroll sejtek feleljenek meg az azonosításra előírt vizsgálat (5.2.3) és az idegen kórokozókra előírt vizsgálat (2.6.16) követelményeinek. TISZTÍTOTT ARATÁS A tisztítási eljárás előtt több egyedi aratás egyesíthető. A szennyezők megfelelő eltávolításának igazolására a tisztítási eljárást validálni kell. A késztermék előállítására csak olyan tisztított aratás használható fel, amely megfelel a következő követelményeknek. Azonosítás. A vektort immunkémiai módszerekkel (2.7.1), NAT (2.6.21) alkalmazásával vagy restrikciós hasításos analízissel kell azonosítani. A genom épsége. A vektor genomjának épségét megfelelő módszerekkel, például restrikciós hasításos analízissel igazolják. A vektor koncentrációja. A tisztított aratásban meghatározzák a fertőző vektor titerét és a vektorrészecskék koncentrációját. Maradék gazdasejt-eredetű fehérje. A maradék gazdasejt-eredetű fehérje koncentrációját megfelelő immunkémiai módszerrel (2.7.1) határozzák meg, kivéve, ha az eljárást a gazdasejt-eredetű fehérjék megfelelő eltávolítására validálták. Maradék gazdasejt-eredetű DNS. A maradék gazdasejt-eredetű DNS koncentrációját megfelelő módszerrel határozzák meg, kivéve, ha az eljárást a gazdasejt-eredetű DNS megfelelő eltávolítására validálták. Érzékenysége és specificitása miatt a kvantitatív polimeráz-lánc reakció (PCR) ajánlott, de egyéb megfelelő technikák is alkalmazhatók. Maradék reagensek. Amennyiben a tisztítási eljárás során reagenseket használtak, a tisztított aratáson ezekre az anyagokra vonatkozó vizsgálatokat kell végezni, kivéve, ha az eljárást a reagensek megfelelő eltávolítására korábban már validálták. Maradék antibiotikum. Amennyiben az előállítási eljárás során antibiotikumot használtak, a maradék antibiotikum koncentrációt, mikrobiológiai értékméréssel (2.7.2-ből adaptálva) vagy egyéb megfelelő módszerrel (például folyadékkromatográfiás eljárással), meg kell határozni, kivéve, ha az eljárást az antibiotikumok megfelelő eltávolítására korábban már validálták. LETÖLTÉS ELŐTTI KÉSZTERMÉK A letöltés előtti késztermék előállítása során több tisztított aratás egyesíthető. A késztermékhez stabilizátor vagy más segédanyagok adhatók. A formulált terméket baktérium visszatartó szűrőn kell átszűrni. 12

13 A végső gyártási tétel előállítására csak olyan letöltés előtti késztermék használható fel, amely megfelel a következő követelménynek. Sterilitás (2.6.1). A letöltés előtti késztermék feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményeinek. VÉGSŐ GYÁRTÁSI TÉTEL Csak olyan végső gyártási tétel szabadítható fel, amely megfelel az alábbiakban az Azonosítás, Vizsgálatok és Meghatározás pontokban megadott minden egyes követelménynek. Amennyiben a letöltés előtti készterméken a szarvasmarha szérumalbuminra vonatkozó vizsgálatok (ha a vektor gyártásához szarvasmarha szérumalbumint használtak), és az RCA-kra vonatkozó vizsgálatok megfelelő eredménnyel zárultak, ezek a vizsgálatok a végső gyártási tétel vizsgálatánál elhagyhatók. AZONOSÍTÁS A vektort immunkémiai módszerekkel (2.7.1), NAT (2.6.21) alkalmazásával vagy restrikciós hasításos analízissel kell azonosítani. VIZSGÁLATOK Ozmolalitás (2.2.35): az illető készítményre jóváhagyott határértékeken belül. ph (2.2.3): az illető készítményre jóváhagyott határértékeken belül. Kivehető térfogat (2.9.17). A termék feleljen meg a kivehető térfogat vizsgálati követelményeinek. Maradék nedvesség (2.5.12): az illető fagyasztva szárított készítményre jóváhagyott határértékeken belül. Szarvasmarha szérumalbumin: amennyiben az előállítás során szarvasmarha szérumot használtak, annak mennyisége megfelelő immunkémiai módszerrel (2.7.1) meghatározva nem haladhatja meg az illető készítményre jóváhagyott határértéket. Replikációra képes adenovírus (RCA) koncentráció: az illető készítményre jóváhagyott határértékeken belül. Vektoraggregátumok. A vektoraggregátumokat megfelelő módszerekkel (például fényszórás vizsgálatával) kell meghatározni. Sterilitás (2.6.1). A termék feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményeinek. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): az illető készítményre jóváhagyott határérték alatt. Hőstabilitás. A vektor végső gyártási tételéből származó mintákat olyan hőmérsékleten, és annyi ideig kell tartani, amelyet az illető készítményre adaptáltak és engedélyeztek. Melegítés után a fertőző vektorok teljes koncentrációját az alábbiakban leírt Meghatározás szerint kell meghatározni, egy nem melegített mintával párhuzamosan. A nem melegített és a melegítés után nyert teljes vektorkoncentráció becsült különbsége az illető készítményre jóváhagyott határértéken belül legyen. MEGHATÁROZÁS A vektorrészecskék koncentrációja. Megfelelő módszerrel (például folyadékkromatográfiával, abszorbanciaméréssel vagy NAT (2.6.21) alkalmazásával) fizikai titrálást végzünk. Minden egyes meghatározás validálásához megfelelő vektor referenciastandardot használunk. 13

14 A vizsgálandó készítmény vektorrészecskéinek koncentrációja nem lehet kisebb, mint a feliraton feltüntetett koncentráció. A fertőző vektor titere. A vizsgálandó készítményt sejttenyészetekre oltva titráljuk. Minden meghatározás validálásához megfelelő vektor-referenciastandarddal is titrálást végzünk. A meghatározás nem értékelhető, ha: a vektorkoncentráció logaritmusának konfidencia intervalluma (P = 0,95) nagyobb, mint az illetékes hatóság által engedélyezett érték; a referenciastandard fertőző vektor titere az ellenőrző grafikon által meghatározott határértékeken kívül esik. A vektorrészecskék koncentrációjának és a fertőző vektor titerének aránya: az illető készítményre jóváhagyott határértékeken belül. A beillesztett géntermék kifejeződése. Amennyiben lehetséges, a beillesztett géntermék(ek) kifejeződését, az illető készítményt sejttenyészetekre oltva, előre meghatározott számú párhuzamos mérést végezve, megfelelő immunkémiai (2.7.1) vagy biokémiai meghatározásokkal, vagy áramlási citometriával (2.7.24) meg kell határozni. Biológiai aktivitás. Indokolt és engedélyezett esetek kivételével, a biológiai aktivitást megfelelő in vitro vagy in vivo vizsgálattal kell meghatározni. FELIRAT A feliratnak tartalmaznia kell: a hatóanyagtartalmat; az ajánlott humán adagot, vektorrészecske-koncentrációban kifejezve; fagyasztva szárított készítmények esetében: az oldáshoz használandó folyadék nevét vagy összetételét, valamint térfogatát; azt az időtartamot, amelyen belül a feloldott készítményt fel kell használni. EMBERI FELHASZNÁLÁSRA SZÁNT HIMLŐVÍRUS VEKTOROK DEFINÍCIÓ Az emberi felhasználásra szánt himlővírus vektorok fagyasztva szárított vagy folyékony rekombináns himlővírus-készítmények, amelyeket genetikailag azért módosítottak, hogy velük in vivo vagy ex vivo emberi sejtekbe genetikai anyagot juttassanak be. ELŐÁLLÍTÁS A VEKTOR FELÉPÍTÉSE 14

15 A himlővírus vektor tervezésének általános gyakorlata jelenleg a következő: a gén DNS-t egy himlővíruspromóter után illesztik be, az expressziós kazettát pedig vagy egy, a vírus replikációjához szükségtelen gén helyére, vagy pedig két vírusgén, két nyitott leolvasási keret közé építik be a himlővírus genomjába. A vektor felépítése során eddig alkalmazott stratégiák többségében az expressziós kazettát először a vírus DNS-fragmentumnak a bakteriális plazmidban klónozott célhelyére illesztik be. Ezután a plazmidot beviszik az in vitro tenyésztett gazdasejtbe, amelyet egyidejűleg a szülői himlővírussal fertőznek. A DNSrekombináció a fertőzött sejtben, a vírusgenom és a plazmidban levő vírusszekvenciák közötti homológ szekvenciákban olyan módon megy végbe, hogy a genetikai inzertet a vírusgenom célterületére átviszi. A beillesztett DNS pozíciójának helyességét restrikciós enzim térképezéssel, NAT-tal (2.6.21) és szekvenálással ellenőrzik. Egymás utáni plakk-klónozó lépéseket végeznek, hogy a rekombináns himlővírust kinyerjék a szülői és a rekombináns himlővírus keverékéből. A rekombináns himlővírusnak a háttér szülői vírustól történő megkülönböztetésére vagy elkülönítésére sokféle módszert (például idegen marker géneket, DNS-hibridizációt, immunológiai meghatározást, a vírus fenotípusának változását) használnak. Amennyiben átmenetileg idegen marker géneket alkalmaztak, ezeket a rekombináns himlővírus késztermékből megfelelő módszerekkel el kell távolítani. A himlővírus vektor felépítésére alkalmazott alternatív stratégia az expressziós kazettának a kiválasztott célterületbe beépített teljes hosszúságú vírusgenomja in vitro felépítésével kezdődik. Ezt követően a rekombináns genomot olyan gazdasejtbe építik be, amelyet egyidejűleg egy sokszorozódásra nem képes helper himlővírussal fertőznek meg. A helpervírus lehet ugyanolyan fajból származó himlővírus, amelynek osztódási képességét inaktiválták, vagy más himlővírus faj, amely a gazdasejtben nem szaporodik. A nem szaporodó himlővírus vektorok kialakítása specifikus gazdasejtvonalakon vagy természetüktől fogva permisszív primer sejteken, illetőleg olyan gazdasejtvonalakon alapul, amelyeket úgy módosítottak, hogy az alapvető himlővírus géneket kifejezzék. Ezeknek a sejteknek meg kell felelniük a gyógyszerek előállításával szemben támasztott általános követelményeknek (5.2.3), és nem tehetik lehetővé a replikációs vektorok képződését. A VEKTOR ELŐÁLLÍTÁSA Az előállítási eljárásnak bizonyítottan állandó minőségű vektort kell eredményeznie. Indokolt és engedélyezett esetek kivételével, a késztermékben levő vektor nem származhat az oltócsíra törzstételtől számított magasabb számú átoltásból, mint amelyet a klinikai kipróbálásra használt, ártalmatlanság és hatékonyság szempontjából megfelelőnek talált vektor előállítására használtak. A vektor genetikai és fenotípusos stabilitását a termelésben alkalmazott legnagyobb átoltásszámnál (vagy azon túlmenően) megfelelő módszerrel vizsgálni kell. A VEKTOR SZAPORÍTÁSÁRA HASZNÁLT SZUBSZTRÁTUM A vektort emberi diploid sejteken (5.2.3), folyamatos sejtvonalakon (5.2.3) vagy meghatározott korokozóktól mentes csirkeállományból származó csirkeembrió sejttenyészeteken (5.2.2) szaporítják, aszeptikus körülmények között. Amennyiben a vektort folyamatos sejtvonalon vagy emberi diploid sejteken szaporítják, sejtbankrendszert kell létrehozni. VEKTOR OLTÓCSÍRATÉTEL A vektor előállítása oltócsíratétel-rendszeren alapul. A felhasznált himlővírustörzs azonosítását, a törzsre vonatkozó, a vírus eredetére és a későbbi manipulációra (különös tekintettel a kivágott, vagy módosított szakaszokra) vonatkozó információkat is tartalmazó előzetes feljegyzések alapján kell elvégezni. A genetikai inzert(ek)et (beillesztés(ek)et) és a 15

16 szomszédos szabályozó régiókat, beleértve a nukleotid-szekvenciát is, részletesen le kell írni. Dokumentálni kell azt a módszert is, amellyel a beillesztett genetikai anyagot a vektorba bevitték. A vektor előállításához csak olyan oltócsíratétel használható, amely megfelel a következő követelményeknek. Azonosítás. A vektort az oltócsíra-törzstételben és valamennyi oltócsíra-szaporítótételben immunkémiai módszerekkel (2.7.1) vagy nukleinsav amplifikációs technikákkal (NAT) (2.6.21) kell azonosítani. Genetikai és fenotípus jellemzés. A következő vizsgálatokat kell elvégezni: A vektor genomjának teljes szekvenálását a termék egy gyártási tételének megfelelő átoltásszinten végezzük, és az analitikailag meghatározott szekvenciát összehasonlítjuk a vektor kialakításának adatain, valamint a rendelkezésre álló adatbázisokon alapuló elméleti szekvenciával. A vektor DNS-ének restrikciós hasításos analízisét az oltócsíra-törzstételen, minden egyes oltócsíraszaporítótételen és a termék egy gyártási tételén végezzük el. A vírus DNS-t kivonjuk, tisztítjuk, és megfelelő módon hasítjuk. A hasított fragmentumokat gélelektroforézissel vagy kapilláris elektroforézissel elválasztjuk, és az észlelt restrikciós mintázatot a vektor kialakításának adatain alapuló elméleti restrikciós mintázattal hasonlítjuk össze. A beillesztett genetikai anyag (genetikai inzert) termékének (termékeinek) expressziójára és biológiai aktivitására vonatkozóan megfelelő számú izolált szubklónt vizsgálunk, a termék gyártási tételéhez hasonló átoltásszinten. Az alacsonyabb szintű kifejeződést vagy biológiai aktivitást mutató szubklónok esetében további jellemzésre van szükség. A gazdasejtek tartományát a vektor replikációs tulajdonságait meghatározva és a szülői vírussal összehasonlítva igazoljuk, a termék egy gyártási tételének megfelelő átoltásszinten. A fertőző vektor titere. A fertőző vektor titerét az oltócsíra-törzstételben és valamennyi oltócsíraszaporítótételben meg kell határozni. Idegen kórokozók (2.6.16). Az oltócsíra-törzstétel és valamennyi oltócsíra-szaporítótétel feleljen meg az idegen kórokozók kimutatására előírt vizsgálat követelményeinek, kivéve, ha a citopátiás törzseket nem lehet semlegesíteni és a vektor zavarja a vizsgálatot. Ha a vizsgálatot nem lehet elvégezni, más megfelelően validált vizsgálatot kell alkalmazni. SZAPORÍTÁS ÉS ARATÁS A sejtbankkal, illetőleg az ebből származó sejttenyészetekkel végzett műveleteket aszeptikus körülmények között, olyan megfelelően izolált helyen kell végezni, ahol egyidejűleg nem dolgoznak más sejtekkel vagy más vektorokkal. A sejtszuszpenziók készítése során használt minden állati vagy emberi eredetű anyagnak, valamint a sejttenyésztő tápfolyadékoknak minősítettnek kell lenniük. A sejttenyésztő tápfolyadék tartalmazhat sav-bázis indikátort, például fenolvöröst, és megfelelő antibiotikumokat a legalacsonyabb hatékony koncentrációban, de előnyösebb, ha az előállítás során antibiotikummentes szubsztrátumot használnak. Indokolt és engedélyezett esetek kivételével, az előállítás semmilyen szakaszában sem használható penicillin vagy sztreptomicin. Az előállítás során használt sejttenyészetek egy részét nem fertőzött sejttenyészetként (kontroll sejtek) félre kell tenni. Tisztított aratás készítésére minden olyan aratás felhasználható, amely megfelel a következő követelményeknek. Azonosítás. A vektort immunkémiai módszerekkel (2.7.1) vagy NAT alkalmazásával (2.6.21) kell azonosítani. A fertőző vektor titere. A fertőző vektor titerét az egyszeri aratásokban meg kell határozni. 16

17 Idegen kórokozók (2.6.16). Az egyszeri aratás feleljen meg az idegen kórokozók kimutatására előírt vizsgálat követelményeinek, kivéve, ha a citopátiás törzseket nem lehet semlegesíteni, és a vektor zavarja a vizsgálatot. Ha a vizsgálatot nem lehet elvégezni, más megfelelően validált vizsgálatot kell alkalmazni. Kontroll sejtek. Ha az előállításra humán diploid sejteket vagy folyamatos sejtvonalat használnak, a kontroll sejtek feleljenek meg az azonosításra előírt vizsgálatok követelményeinek (5.2.3). A kontroll sejtek feleljenek meg az idegen kórokozók kimutatására előírt vizsgálat (2.6.16) követelményeinek is. TISZTÍTOTT ARATÁS A tisztítási eljárást aszeptikus körülmények között kell végezni. A tisztítási eljárás előtt az egyszeri aratésok egyesíthetők. Az aratást először megtisztítják a sejtektől, azután adott esetben megfelelő validált módszerekkel tisztítják. A letöltés előtti késztermék előállítására olyan tisztított aratás használható fel, amely megfelel a következő vizsgálatok követelményeinek. Azonosítás. A vektort immunkémiai módszerekkel (2.7.1) vagy NAT (2.6.21) alkalmazásával kell azonosítani. A genom épsége. A vektor genomjának épségét megfelelő módszerekkel, például restrikciós hasításos analízissel kell igazolni. A fertőző vektor titere. A tisztított aratásban meg kell határozni a fertőző vektor titerét. A fertőző vektor titere és a teljes fehérjekoncentráció aránya. A teljes fehérjekoncentrációt megfelelő módszerrel (2.5.33) való meghatározását követően a fertőző vektor titerének a teljes fehérjekoncentrációra vonatkoztatott arányát ki kell számítani. Maradék gazdasejt-eredetű fehérje. Amennyiben az eljárást a gazdasejt-eredetű fehérje eltávolítására nem validálták, a maradék koncentrációját megfelelő immunkémiai módszerrel (2.7.1) meg kell határozni. Maradék gazdasejt-eredetű DNS. Amennyiben az eljárást a gazdasejt-eredetű DNS eltávolítására nem validálták, a maradék koncentrációját megfelelő módszerrel meg kell határozni. Érzékenysége és specificitása miatt a kvantitatív PCR alkalmazása ajánlott, de más alkalmas technikák is használhatók. Reagensmaradványok. Amennyiben a tisztítási eljárás során reagenseket használtak, a tisztított aratáson ezekre az anyagokra vonatkozóan vizsgálatokat kell végezni, kivéve, ha az eljárást a reagensek eltávolítására validálták. Maradék antibiotikum. Amennyiben az előállítási eljárás során antibiotikumot használtak, a maradék koncentrációját mikrobiológiai értékméréssel (2.7.2-ből adaptálva) vagy egyéb megfelelő módszerekkel (például folyadékkromatográfiás eljárással) meg kell határozni, kivéve, ha az eljárást az antibiotikumok eltávolítására validálták. LETÖLTÉS ELŐTTI KÉSZTERMÉK A letöltés előtti késztermék előállítása során több tisztított aratás egyesíthető. A letöltés előtti késztermékhez stabilizátor vagy más segédanyagok adhatók. A végső gyártási tétel előállítására csak olyan letöltés előtti késztermék használható fel, amely megfelel a következő vizsgálat követelményének. Sterilitás (2.6.1). A készítmény feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményeinek. VÉGSŐ GYÁRTÁSI TÉTEL Csak olyan végső gyártási tételt lehet felszabadítani, amely az alábbiakban az Azonosítás, Vizsgálatok és Meghatározás pontok minden egyes követelményének megfelel. 17

18 Amennyiben a késztermék a szarvasmarha szérumalbumin vizsgálatra vonatkozóan (amennyiben a vektor gyártásához szarvasmarha szérumalbumint használtak) megfelelő eredménnyel zárult, ez a vizsgálat a végső gyártási tétel esetében elhagyható. AZONOSÍTÁS A vektort immunkémiai módszerekkel (2.7.1) vagy NAT (2.6.21) alkalmazásával azonosítjuk. VIZSGÁLATOK Ozmolalitás(2.2.35): az illető készítményre jóváhagyott határértékeken belül. ph (2.2.3): az illető készítményre jóváhagyott határértékeken belül. Kivehető térfogat (2.9.17): feleljen meg a kivehető térfogat vizsgálati követelményeinek. Maradék nedvesség (2.5.12): az adott fagyasztva szárított készítményre jóváhagyott határértékeken belül. Szarvasmarha szérumalbumin: megfelelő immunkémiai módszerrel (2.7.1) meghatározva nem haladhatja meg az illető készítményre jóváhagyott határértéket, ha az előállítás során szarvasmarha szérumot használtak. Sterilitás (2.6.1). A készítmény feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményeinek. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): az illető készítményre jóváhagyott határérték alatt. Hőstabilitás. A vektor végső gyártási tételéből származó mintákat olyan hőmérsékleten, és annyi ideig kell tartani, amelyet az illető készítményre adaptáltak és engedélyeztek. Melegítés után a fertőző vektorok teljes koncentrációját az alábbiakban leírt Meghatározás szerint kell meghatározni egy nem melegített mintával párhuzamosan. A nem melegített és a melegítés után nyert teljes vektorkoncentráció becsült különbsége az illető készítményre jóváhagyott határértéken belül legyen. MEGHATÁROZÁS A fertőző vektor titere. A vizsgálandó készítményből legalább 3 ampullát titrálunk, sejttenyészetekre oltva. Validálás céljából minden meghatározáshoz egy-egy ampulla megfelelő vektor referenciastandardot is titrálunk. A vizsgálandó készítmény vektor-titere nem lehet kisebb, mint a feliraton megadott legalacsonyabb mennyiség. A meghatározás nem érvényes, ha: a vektorkoncentráció logaritmusának konfidencia intervalluma (P = 0,95) nagyobb, mint az illetékes hatóság által engedélyezett érték; a fertőző vektor titere a referenciastandardban az ellenőrző grafikon által meghatározott határértéken kívül esik. A beillesztett géntermék kifejeződése. Ahol ez lehetséges, a beillesztett géntermék(ek) kifejeződését, az illető készítményt sejttenyészetekre előre meghatározott számú párhuzamosban ráoltva, megfelelő immunkémiai (2.7.1) vagy biokémiai meghatározásokkal vagy áramlási citometriával (2.7.24) kell meghatározni. 18

19 Biológiai aktivitás. Indokolt és engedélyezett esetek kivételével, a biológiai aktivitást megfelelő in vitro vagy in vivo vizsgálattal meg kell határozni. FELIRAT A feliratnak tartalmaznia kell: a humán adag minimális vektor titerét; az ajánlott humán adagot; fagyasztva szárított készítmények esetében: az oldószer nevét vagy összetételét, valamint térfogatát; azt az időtartamot, amelyen belül a feloldott készítményt fel kell használni. EMBERI FELHASZNÁLÁSRA SZÁNT RETROVÍRUS EDETŰ VEKTOROK DEFINÍCIÓ Az emberi felhasználásra szánt retrovírus eredetű vektorok folyékony vagy fagyasztva szárított, genetikai módosítás által szaporodásképtelenné tett rekombináns retrovírus-, lentivírus- vagy spumavíruskészítmények, amelyeket azért módosítottak genetikailag, hogy velük in vivo vagy ex vivo emberi sejtekbe genetikai anyagot jutassanak be. Ez a fejezet a nem szaporodó vektorokra vonatkozik. ELŐÁLLÍTÁS A VEKTOR FELÉPÍTÉSE A típusos vektor a következőket tartalmazza: a szülői vírusból azt a minimális mennyiségű strukturális génállományt, amely a vektor készítéséhez bizonyítottan nélkülözhetetlen génelemeket tartalmazza; genetikai inzert kifejezéséhez szükséges szabályozó genetikai alkotórészeket (például ismétlődő DNSszekvenciákat (LTR-ek)); a genetikai inzertet. A vektor felépítését olyan módon kell megtervezni, hogy az a szaporodásra képes vírusok képződését megakadályozza. A VEKTOR ELŐÁLLÍTÁSA Az előállítási eljárásnak bizonyítottan állandó minőségű vektort kell eredményeznie. Indokolt és engedélyezett esetek kivételével, a csomagoló (packaging) és termelő (producer) sejtek a törzssejtbanktól (MCB) számítva nem eshetnek át több sejtosztódáson, mint a klinikai kipróbálás során ártalmatlanság és hatékonyság szempontjából megfelelőnek talált vektor. A legalább a termelésben alkalmazott legnagyobb számú sejtosztódáson átesett csomagoló vagy termelő sejtek genetikai és fenotípusos stabilitását erre alkalmas módszerekkel vizsgálják. 19

20 A vektorok előállítása folyamatosan fenntartott sejtvonalakon, sejtbankrendszer felhasználásával (5.2.3) történik. Az előállítás céljára stabilan vagy átmenetileg fertőzött sejteket lehet felhasználni. DEFINÍCIÓK Csomagoló (packaging) sejtek: az üres vektor rész előállításához szükséges vírus gént (gag, pol, env) tartalmazó plazmiddal stabilan fertőzött törzssejtvonal. Termelő (producer) sejtek: a vektor előállításához szükséges vírus gént és az expressziós kazettát tartalmazó sejtek. A stabil előállító rendszerekben a termelő sejteket a csomagoló sejtvonalnak a vonatkozó szekvenciát tartalmazó plazmiddal történő stabil transzfekciójával állítják elő. Az átmeneti előállítási rendszerekben a termelő sejteket a gyártással egyidejűleg hozzák létre, úgy, hogy a törzssejtvonalat a vírus génekkel és a transzgént kifejező plazmiddal együttesen fertőzik, vagy a csomagoló sejtvonalat a vonatkozó szekvenciát tartalmazó transzfer plazmiddal átmenetileg fertőzik. AZ ELŐÁLLÍTÁSI ELJÁRÁS KÖZTITERMÉKEI Csomagoló sejtek A kópiák száma. A genomikus DNS-t ismert mennyiségű sejtből izolálják és tisztítják, és a gag, pol, valamint env gének kópiáinak számát megfelelő módszerrel, például kvantitatív PCR (2.6.21) alkalmazásával határozzák meg. A vírus gének szekvenciájának épsége. A beillesztett vírus gén és a hozzátartozó szabályozó részek teljes nukleotid szekvenálását el kell végezni. Genetikai stabilitás. A genetikai stabilitást igazolni kell, olyan termelő sejteken, amelyek a termelésben alkalmazott maximális (vagy annál is nagyobb) számú sejtosztódáson estek át. Plazmidok A vektor előállításához plazmid köztitermékek felhasználása szükséges. Az előállítás során minden egyes felhasznált plazmid DNS-re teljes körű, az azonosítást, az eredetet, az izolálásra felhasznált módszereket és a nukleotidszekvenciát is tartalmazó leírást kell adni. Az ilyen plazmidok összetevőinek eredetét és funkcióit, mint például a replikáció eredetét, a vírus-, illetőleg eukarióta promótereket és a szelekciós markereket kódoló géneket dokumentálni kell. A plazmid köztitermékek előállítása baktérium sejtbankrendszeren alapul. Az MCB feleljen meg az Emberi felhasználásra szánt plazmidvektorok előállítására használt baktériumsejtek részben előírt követelményeknek. A plazmidokat megfelelő technikával kell tisztítani. Csak olyan plazmidtétel használható a vektor előállítására, amely megfelel a következő követelményeknek. Azonosítás. A plazmidokat restrikciós hasításos analízissel, szekvenálással vagy NAT (2.6.21) alkalmazásával azonosítani kell. A genom épsége. A plazmid genomjának épségét megfelelő módszerekkel, például a vírus gének, a genetikai inzert és az ezeket szabályozó elemek restrikciós hasításos analízisével igazolni kell. Plazmid DNS. A következő kimutatási módszerek példaként szolgálnak. 500 ng/ml-nél nagyobb DNS-koncentrációkat 260 nm-en végzett abszorbancia méréssel lehet meghatározni. Az 50 µg/ml töménységű kétszálú DNS-oldat abszorbanciája 1 (fajlagos abszorpciós koefficiens: 200). 20