VACCINUM VARIOLAE VIVUM. Himlő vakcina (élő)

Átírás

1 Vaccinum rotaviri variolae vivum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur /2012:0164 VACCINUM VARIOLAE VIVUM Himlő vakcina (élő) DEFINÍCIÓ Az élő himlő vakcina tojásban (csirkeembrió membránjában), sejtkultúrában vagy élő állatok bőrén szaporított élő vaccinia vírusból előállított folyékony vagy fagyasztva szárított készítmény. Jelen cikkely előírásai azokra a vakcinákra vonatkoznak, melyek termelésére emberben bizonyítottan hatásos törzseket használnak, elsősorban olyanokat, amelyeket a himlő eradikációja során alkalmaztak, például a Lister törzset (időnként Lister/Eltree törzsként jelölve) és a New York City Board of Health (NYCBOH) törzset. A cikkely előírásai nem alkalmazhatóak a nem replikatív törzsekre, mint például a módosított Ankara vírus (MVA). ELŐÁLLÍTÁS ÁLTALÁNOS ELŐÍRÁSOK Igazolni kell, hogy az előállítás módszere emberre nézve állandóan megfelelő immunizálóképességű és biztonságos himlő vakcinát eredményez. Az alkalmazott törzsnek emberben típusos vaccinia-vírus okozta bőrelváltozást kell mutatnia. A vakcina előállítása oltócsíra-rendszeren alapszik. Az előállítási módszert validálni kell annak igazolására, hogy a termék, amennyiben vizsgálnánk, megfelelne az embergyógyászati immunszérumokra és vakcinákra előírt abnormális toxicitási vizsgálat (2.6.9) követelményeinek. A himlő vakcina Nemzetközi Referenciakészítmény alkalmas arra, hogy a vírustitrálás során referenciakészítményként használják. A VÍRUS SZAPORÍTÁSÁRA SZOLGÁLÓ KÖZEG A bőrön termelt vakcinák előállítására alkalmas állatok. Amennyiben a vakcinát állati bőrön állítják elő, a felhasznált állat az illetékes hatóság által jóváhagyott fajhoz tartozó, megfelelő egészségi állapotban lévő, zártan vagy fokozott megfigyelés alatti tenyészetben tartott, korábban kísérleti célokra fel nem használt állat legyen. Csak a vaccinia vírus bőrbe történő fertőzésére fogékony állat használható a vakcina előállítására. Az állatok jól felépített, megfelelően szellőztetett állatszállásokban, egymástól a lehető legtávolabb lévő ketrecekben tartandók. Megfelelő óvintézkedéseket kell tenni a ketrecek közötti keresztfertőzés megelőzése érdekében. Nagytestű állatfaj esetében 1 állatnál több nem tartható egy rekeszben. Két kisállatnál több nem tartható egy ketrecben és a ketrectársak nem cserélhetők. Az állatok a vakcinát előállító országban, a felhasználás előtt legalább 6 hétig karanténban tartandók. Amennyiben a karantén ideje alatt az elhullási arány bármikor eléri az 5%-ot a csoportban, a teljes csoportból egyetlen állat sem használható vakcinatermelésre. A csoportokat folyamatosan elkülönítve, karanténban kell tartani, a karantén időszak lejárta után is, mindaddig, amíg az állatok felhasználásra nem kerülnek. Amint a csoport utolsó tagjai is felhasználásra kerültek, új csoport fogadása előtt a helyet alaposan tisztítani és fertőtleníteni kell. A beoltandó állatokat érzéstelenítés után gondosan meg kell vizsgálni. Amennyiben egy állat bármilyen kóros bőrelváltozást mutat, nem használható oltócsíra-tétel vagy vakcina előállítására, és hasonlóan nem

2 Vaccinum rotaviri variolae vivum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur használható a karanténcsoport bármely más tagja sem mindaddig, amíg egyértelműen nem igazolódik, hogy használatuk nem veszélyezteti a termék biztonságosságát. A megelőző és diagnosztikus eljárásokat, amelyeket fertőző betegségek kizárására alkalmaznak, az illetékes hatóság hagyja jóvá. Ezek az eljárások különböző országokban eltérőek lehetnek, függően az alkalmazott állatfajtól, és a betegségektől, amelyekre az adott állatfaj fogékony az adott vakcinatermelő országban. Figyelemmel kell lenni továbbá a betegség szóródásának veszélyére más országokba, ahová a vakcinát esetleg szállítják. Különös figyelmet kell fordítani mindenkor a száj- és körömfájás, brucellózis, Q-láz, tuberkulózis és dermatomycosis kockázatára, valamint szükséges lehet a pusztuláris dermatitisz, lépfene, keleti marhavész, hemorrágiás szeptikémia, Rift-völgyi láz és egyéb fertőzések lehetőségét is figyelembe venni. Előkeltetett tojások. A termelésre használt előkeltetett tojásoknak meghatározott kórokozóktól mentes (SPF) állományokból (5.2.2) kell származniuk. Humán diploid sejtek, folyamatos sejtvonalak. A humán diploid sejtek és folyamatos sejtvonalak feleljenek meg a sejtszubsztrátumokra vonatkozó követelményeknek (5.2.3). Primer csirkeembrió sejtek. A primer csirkeembrió sejteknek meghatározott kórokozóktól mentes (SPF) állományokból (5.2.2) kell származniuk. Primer nyúlvesesejtek. Csak az illetékes hatóság által jóváhagyott zárt tenyészetben tartott, egészséges nyulakból származó sejtek használhatók. Igazolni kell a lehetőleg 2 4 hetes állatok meghatározott kórokozóktól vagy azok elleni ellenanyagoktól való mentességét. Amennyiben új állatokat helyeznek a tenyészetbe, azokat legalább 2 hónapig karanténban kell tartani, és igazolni kell meghatározott kórokozóktól való mentességüket. Olyan állatok veséje használható fel, amelyeket korábban nem használtak kísérleti célokra, különösen fertőző kórokozókkal történő vizsgálatokban. A tenyészetet rendszeresen vizsgálni kell emberre is veszélyes állati kórokozó vírusok és más kórokozók markereinek jelenlétére. A tenyészet kialakításának idején minden állatot meg kell vizsgálni a lehetséges vírusszennyezők elleni ellenanyagoktól való mentesség igazolására, azon vírusszennyezők esetében, amelyek emberi fertőzést okozhatnak vagy humán eredetű sejtekben in vitro replikáció történhet. A retrovírusok kimutatására egy érzékeny polimeráz láncreakción (PCR) alapuló reverz transzkriptáz vizsgálatot kell végezni, de használható nukleinsav-amplifikációs vizsgálat (2.6.21) is. A tenyészet kialakítása után, azt rendszeresen vizsgálni kell az állatok legalább 5%-át kitevő reprezentatív csoport bevonásával, amelyektől meghatározott időpontokban (pl. havonta) vért vesznek. A tenyészetet szűrik továbbá kórokozó mikroorganizmusok jelenlétére, beleértve a mikobaktériumokat, gombákat és mikoplazmákat. A szűrési programot úgy kell megtervezni, hogy valamennyi állat vizsgálata megtörténjen egy adott időszakon belül. Amennyiben egy állat elhullik, vizsgálatot kell végezni az elhullás okának megállapítására. Ha kimutatható a tenyészetben az elhullást okozó kórokozó jelenléte, a himlő vakcina termelése nem folytatható. A vese kivételével egyidőben az állatokat meg kell vizsgálni rendellenességek előfordulására vonatkozóan. Az állatok semmiféle rendellenesség észlelése esetén sem használhatók fel vakcina előállítására. Az egyszeri vírusaratás előállítására szolgáló állatcsoportból származó kontrolltenyészetnek azonosíthatónak kell maradnia valamennyi vizsgálat, különösen az idegen kórokozókra vonatkozó vizsgálatok lezártáig. VÍRUS OLTÓCSÍRA-TÉTELEK Az oltócsíra-törzstétel előállítására szolgáló vaccinia vírus izolátumot történeti feljegyzések alapján azonosítani kell. A feljegyzések tartalmazzák a törzs eredetére és jellemzésére alkalmazott vizsgálatokra vonatkozó adatokat. Az oltócsíra-szaporítótételből származó vírusnak az oltócsíra-törzstétel előállítására használt törzzsel megegyező jellemzőket kell mutatnia. Az eredeti izolátumból az egyszeri aratás korlátozott

3 Vaccinum rotaviri variolae vivum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur számú átoltással készülhet, az átoltások számát az illetékes hatóság hagyja jóvá. A vakcinát az oltócsíraszaporítótételtől számított lehető legkevesebb átoltással kell előállítani. Mivel a sejttenyészet előállítása és a klón szelekció (pl. plakk tisztítás) megváltozott vírustulajdonságokat eredményezhet, az oltócsíra-törzstételt a lehető legteljesebb mértékben jellemezni kell, például a biztonságossági profil és a törzs biológiai jellemzőinek a kiindulási izolátummal történő összehasonlítása révén. A jellemzésnek az alábbiakat kell tartalmaznia: antigénanalízis, specifikus antiszérumok és/vagy monoklonális antitestek alkalmazásával; biológiai vizsgálatok, például fertőzőképességi titer meghatározása, chorioallantois membrán (CAM) vizsgálat, in vitro és in vivo növekedési jellemzők vizsgálata arra alkalmas állatmodellen; genetikai elemzés, például restrikciós térkép/southern blotting, PCR analízis és részleges szekvenciaértékelés; fenotípusos és genetikai stabilitás a közegben történő átoltás során; neurovirulencia és immunogenitás vizsgálata. A jellemzésre alkalmazott vizsgálatokat minden egyes oltócsíra-szaporítótétel, valamint az első oltócsíraszaporítótételből készített 3 gyártási tétel esetében el kell végezni a vakcinatörzs genetikai stabilitásának igazolására. Csak az a vírus oltócsíra-tétel használható vírusszaporításra, amely megfelel az alábbi követelményeknek. Azonosítás. Minden egyes oltócsíra-tételben azonosítani kell a vaccinia vírust, specifikus antitestek és molekuláris vizsgálatok alkalmazásával. Megfelelő vizsgálatokkal ki kell zárni a variola vírus és egyéb orthopox vírusok jelenlétét. Víruskoncentráció. A víruskoncentrációt CAM hatóérték-meghatározással vagy alkalmas validált in vitro vizsgálattal (plakk vizsgálat vagy CCID 50 hatóérték-meghatározás) határozzuk meg. A víruskoncentráció alapján kell megállapítani a neurovirulencia vizsgálatokban használt vírusmennyiséget. Idegen kórokozók (2.6.16). Amennyiben az oltócsíra-tételt előkeltetett tyúktojásban, humán diploid sejteken vagy folyamatos sejtvonalon szaporítják, a szaporítótétel feleljen meg a vírusvakcinák oltócsíratételeinek előállítására vonatkozó követelményeknek. Az előkeltetett tyúktojásban és primer sejtkultúrákon szaporított oltócsíra-tételek feleljenek meg továbbá az alábbiakban leírt követelményeknek is. Amennyiben az előírt vizsgálat nem végezhető el, mivel az oltócsíra-tételben lévő vírus teljes neutralizációja nem lehetséges, az oltócsíra-tétel az idegen vírusok vizsgálata előtt olyan koncentrációra hígítható, amely megegyezik azzal a hígítással, amelyet a vakcinatermelésben inokulumként alkalmaznak. Kiegészítő specifikus vizsgálatok elvégzése is lehetséges idegen vírusok kimutatására validált nukleinsav-amplifikációs eljárásokkal (2.6.21) vagy immunkémiai módszerekkel (2.7.1). Amennyiben mikoplazmák kimutatására az indikátorsejt-tenyésztéses módszer (2.6.7) nem végezhető el, helyette nukleinsav-amplifikációs eljárást kell végezni. Az előkeltetett tyúktojásokban vagy sejtkultúrákon történő termelésre használt oltócsíra-tételeket az eredeti oltócsíra továbboltásával kell vizsgálni a lehetséges idegen kórokozók jelenlétére. Amennyiben az eredeti oltócsíra teljes átoltási története valószínűleg nem deríthető ki, és lehetséges, hogy egynél több fajt használtak az előállításhoz, ennek a kiegészítő vizsgálatnak legalább a számításba jöhető fontos idegen kórokozókra ki kell terjednie. Az állati bőrön termelt oltócsíra-törzstételek és oltócsíra-szaporítótételek mikrobiológiai szennyezettségének korlátozása a körülmények, a személyzet és a termelésre használt állatok igen gondos, minden részletre kiterjedő ellenőrzését és az oltócsíra-tételek specifikus vizsgálatát is megkívánja. Mindazonáltal nehézségek adódhatnak az állati bőrön előállított oltócsíra-tételek idegen kórokozóktól való teljes mentességének biztosításában, így megfontolandó olyan termelési eljárások alkalmazása, amelyek az ilyen kórokozókat teljesen vagy részben eltávolítják. Az ilyen gyártási tételek feleljenek meg az alábbiakban jelzett követelményeknek. A meghatározott humán kórokozóktól való mentességet további vizsgálatokkal, pl. baktérium- és gombatenyésztéssel, vírustenyésztéssel, virális kórokozók nukleinsav-amplifikációs vizsgálatával (2.6.21) kell megerősíteni.

4 Vaccinum rotaviri variolae vivum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Neurovirulencia. Az oltócsíra-törzstételek és oltócsíra-szaporítótételek neurovirulenciáját megfelelő állati modell, pl. majom vagy egér alkalmazásával kell értékelni. Összehasonlításra a kiindulási izolátumot kell alkalmazni. Amennyiben az eredeti izolátum nem áll rendelkezésre erre a célra, ezzel egyenértékű anyagok használhatók. VÍRUSSZAPORÍTÁS ÉS ARATÁS ÉLŐ ÁLLATBAN TERMELT VAKCINA Beoltás előtt az állatokat le kell tisztítani, és gondosan takarított istállóban kell tartani a vaccinia anyag learatásáig. A beoltás előtti 5 napon át és az inkubációs periódusban az állatokat állatorvosi felügyelet alatt kell tartani. Az állatoknak megbetegedés bármilyen jelétől menteseknek kell maradniuk; az állatok végbélben mért testhőmérséklet-emelkedését naponta fel kell jegyezni. Amennyiben a hőmérséklet abnormális emelkedése vagy megbetegedésre utaló bármilyen jel figyelhető meg, a vakcina termelését az adott állatcsoportban fel kell függeszteni, amíg az ok nem tisztázódik. Az oltóvírust az állat olyan testtájára kell beadni, amely nincs kitéve vizelettel vagy ürülékkel való szennyeződésnek. A beoltásra használt felületeket le kell borotválni és le kell tisztítani úgy, hogy azok lehetőség szerint a sebészeti aszepszis feltételeit érjék el. Amennyiben a vírusra ártalmas antiszeptikus anyagot használtak a tisztítás során, azt az oltás előtt steril vízzel történő alapos öblítéssel kell eltávolítani. Az oltás idején az állat azon részét, amelyet nem használnak az oltás beadására, de annak közelében van, steril borítóval le kell fedni. A múltbeli gyakorlat szerint a nőstény állatok hasi felülete, míg a hím állatok oldalsó része alkalmas oltásra. A vaccinia anyag begyűjtése előtt mindennemű antibiotikum adást meg kell vonni, és az oltott területet meg kell tisztítani. A nem oltott felületet steril borítóval kell lefedni. Az aratás előtt az állatokat humánusan leöljük és elvéreztetjük, a vaccinia anyag vérrel való nagyfokú keveredésének megelőzésére. Az egyes állatoktól nyert vaccinia anyagot aszeptikus módon külön-külön kell gyűjteni. A vakcina termelésére használt minden egyes állatot fel kell boncolni. Amennyiben bármilyen, a vacciniától eltérő általános vagy szisztémás betegség jelei észlelhetők, az attól az állattól nyert vaccinia anyagot meg kell semmisíteni. Indokolt és engedélyezett esetektől eltekintve, amennyiben a betegség fertőzőnek minősíthető, a teljes állatcsoporttól nyert aratást meg kell semmisíteni. TOJÁSBAN TERMELT VAKCINA Az előkeltetett tyúktojásokkal folytatott minden egyes műveletet aszeptikus körülmények között kell végezni, olyan területen, ahol az előállítás ideje alatt más fertőző anyagokkal vagy sejtekkel nem dolgoznak. Az oltás és ellenőrzött hőmérsékleten történt inkubáció után történhet az aratás, kizárólag az élő, megfelelő csirkeembriók esetében. Az embriók korát a vírusaratás idején a tojásoknak az inkubátorba helyezésének kezdetétől kell számítani; az embriók nem lehetnek 12 napnál idősebbek. Homogenizálás és centrifugálással végzett tisztítás után az embriómassza kivonata az alábbiakban leírtak szerint vizsgálandó, majd 70 C-on vagy annál alacsonyabb hőmérsékleten tárolandó a további eljárásokig. Azok a vírusaratások, amelyek megfelelnek az előírt vizsgálatok követelményeinek, egyesíthetők. A termelési folyamat egyetlen szakaszában sem adható humán fehérje a vírusszuszpenzióhoz. Amennyiben az anyaghoz stabilizátort adnak, igazolni kell, hogy az nem rendelkezik az emberben antigén-sajátsággal vagy érzékenyítő tulajdonsággal. Csak az az egyszeri aratás használható fel letöltés előtti késztermék vakcina előállítására, amely megfelel az alábbi követelményeknek. Kontrolltojások. A kontrolltojások feleljenek meg az idegen kórokozókra vonatkozó vizsgálatok (2.6.16) követelményeinek. A vakcina termelésére használt gyártási tételből származó, oltatlan előkeltetett tyúktojások 2%-át (legalább 20 és legfeljebb 50 tojást) ugyanolyan körülmények között inkubáljuk, mint az oltott tojásokat. A vírusaratás idején az oltatlan tojásokat azonos módon kezeljük, mint az oltott tojásokat. Sterilitás (2.6.1). A készítmény feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményeinek, mindegyik táptalajra 10 ml mintát oltva. SEJTTENYÉSZETEKEN ELŐÁLLÍTOTT VAKCINA (PRIMER CSIRKEEMBRIÓ SEJTEK, PRIMER

5 Vaccinum rotaviri variolae vivum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur NYÚLVESESEJTEK, HUMÁN DIPLOID SEJTEK VAGY FENNTARTOTTT SEJTVONALAK) A sejtbankkal és azt követően a sejttenyészettel folytatott minden egyes műveletet aszeptikus körülmények között kell végezni, olyan területen, ahol az előállítás ideje alatt más sejtekkel nem dolgoznak. A tápfolyadékban megfelelő állati (de nem emberi) szérum felhasználható, a vírusszaporítás során a sejtnövekedés fenntartására szolgáló végső tápfolyadék azonban nem tartalmazhat állati szérumot. A sejtszuszpenziók és tápoldatok készítéséhez használt szérum és tripszin idegen kórokozóktól igazoltan mentes legyen. A tápoldatok sav-bázis indikátort, például fenolvöröst, és megfelelő antibiotikumokat a legalacsonyabb hatékony koncentrációban tartalmazhatnak. A termelés folyamán előnyösebb antibiotikumot nem tartalmazó közeg alkalmazása. Az oltócsíra-szaporítótétel szövettenyészetre felvitelének napján a termelésre használt sejttenyészet legalább 5%-át vagy 1000 ml-t (amelyik kevesebb) nem fertőzött (kontroll) sejttenyészetként félre kell tenni. Amennyiben a vakcinát primer nyúlvese-sejttenyészeten termelik, az alábbiakban megadott speciális követelmények szerint kell eljárni a kontrollsejtek esetében. A termelő sejtkultúrának az oltócsíra-szaporítótétellel való beoltása után a beoltott sejteket megfelelő hőmérsékleten tartják, majd a vírustartalmú közeget megfelelő inkubációs idő után aratják. Csak az az egyszeri aratás használható egy monovalens egyesített aratás előállítására, amely megfelel az alábbi követelményeknek. Kontrollsejtek. A vírusaratás előállítására szolgáló termelő sejttenyészetből származó kontrollsejtek feleljenek meg az azonosságra és az idegen kórokozókra (2.6.16) vonatkozó vizsgálatok, illetve amennyiben az előállításhoz primer nyúlvese-sejtkultúrákat használnak, az alábbiakban felsorolt speciális vizsgálatok követelményeinek. A vizsgálat nem értékelhető, ha a megfigyelési szakasz végére a kontroll sejttenyészetek több, mint 20%-át meg kellett semmisíteni. Idegen kórokozók (2.6.16). Az egyszeri aratás feleljen meg az idegen kórokozókra vonatkozó vizsgálatok követelményeinek. A vaccinia vírus teljes neutralizációját magas vírustartalom mellett nehéz elérni, ebben az esetben specifikus vizsgálatok, például nukleinsav-amplifikáció (2.6.21) és immunkémiai vizsgálatok (2.7.1) helyettesíthetik a sejtkultúrában vagy tojásban végzett nemspecifikus vizsgálatokat. A biológiai reagensekkel, például a vaccinia neutralizáló ellenanyaggal való takarékosság céljából az idegen kórokozók vizsgálata az egyszeri aratás helyett a letöltés előtti késztermék vakcinán is elvégezhető. Primer csirkeembrió sejteken termelt vakcina. A kontrolltenyészetekből származó egyesített folyadékmintákat vizsgálni kell adenovírusok és avian retrovírusok, például madárleukózis vírus jelenlétére. Minden egyes neutralizált egyesített vírusaratásból továbbá a vakcina 100 emberi adagjának megfelelő vagy 10 ml (amelyik több) mennyiséget megtermékenyített tojás csoportokban allantois oltással, illetve ugyanilyen mintát egy másik tojáscsoportban szikzsákba történő oltással vizsgálunk. Mindkét esetben 0,5 ml beoltandó anyagot kell bevinni egy-egy tojásba. A vírustétel megfelel a vizsgálat követelményeinek, ha 3-7 nap múlva semmilyen, idegen kórokozó jelenlétére utaló tünet nem észlelhető. Primer nyúlvese-sejttenyészeten termelt vakcina. A vírus szaporítására, aratására és vizsgálatára az alábbi speciális követelmények vonatkoznak. Az oltócsíra-szaporítótétellel való beoltás napján a primer sejtszuszpenzió készítésére használt minden állatcsoport vesetenyészeteiből készült egyesített folyadékokból legalább ml-t el kell különíteni. Ezeket a folyadékokat primer vesesejttenyészetbe oltjuk olyan módon, hogy a folyadék ne híguljon 1:4 aránynál jobban. A tenyészeteket C-on inkubáljuk, és legalább 4 hétig megfigyelés alatt tartjuk. A megfigyelési időszak alatt, legkevesebb 2 héttel a megfigyelés kezdete után, legalább 1 folyadék átoltást készítünk valamennyi tenyészetből, melyeket 2 héten át megfigyelés alatt tartunk. A vizsgálat nem értékelhető, ha a tenyészetek több, mint 20%-át meg kellett semmisíteni. Amennyiben idegen kórokozó jelenléte igazolt, a teljes csoportból származó egyetlen sejttenyészet sem használható fel vakcinatermelésre. Kontroll sejttenyészetek. Az oltócsíra-szaporítótétellel történő beoltás napján készített tenyészetekből, minden állatcsoport vesesejt-szuszpenziójából a szuszpenzió 25%-át kontrollként félre kell tenni. A kontroll sejttenyészeteket legalább 2 hétig az oltott tenyészetekkel megegyező módon kell kezelni. A vizsgálat nem értékelő, ha a kontroll sejttenyészetek több, mint 20%-át valamely nem specifikus ok miatt meg kellett semmisíteni.

6 Vaccinum rotaviri variolae vivum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Vizsgálat hemadszorbeáló vírusokra. Az aratás idején vagy a termelő sejttenyészeteknek a vírus oltócsíra-szaporítótétellel való beoltását követő 4 napon belül a kontroll sejttenyészetek 4%-ából álló minta vizsgálandó hemadszorbeáló vírusok jelenlétére, tengerimalac vörösvérsejtek hozzáadásával. Vizsgálat egyéb idegen kórokozókra. Az aratás idején vagy a termelő tenyészetnek a vírus oltócsíraszaporítótétellel való beoltását követő 7 napon belül a kontroll tenyészetek minden egyes csoportjából vett legalább 20 ml kevert mintát vizsgálunk egyéb idegen kórokozók jelenlétére. A neutralizált egyszeri aratás vizsgálata primer nyúlvese sejttenyészetekben. Minden neutralizált egyszeri aratást vizsgálni kell primer vesesejtkultúrákon, melyeket a termelésre használt állatoktól eltérő állatcsoportból állítanak elő. EGYESÍTETT ARATÁS Csak az az egyesített aratás használható fel kész gyártási tétel előállítására, amely megfelel az alábbi követelményeknek, illetve a termékre elfogadott határértékeknek. Azonosság. A vaccinia vírust az egyesített aratásban szerológiai módszerekkel kell azonosítani, melyek molekuláris módszerekkel kiegészíthetők. Molekuláris vizsgálatok is alkalmasak lehetnek a célra, például a restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus vagy a részleges szekvenálás, különösen a terminális DNSszekvenciák vizsgálata, amely a vaccinia törzsek közötti legnagyobb változatosságot mutatja. Víruskoncentráció. Az egyesített aratás vaccinia vírus koncentrációját tyúktojás CAM vizsgálattal vagy sejttenyészetben meg kell határozni. A titrálás validálására ugyanazon rendszerben, párhuzamosan egy referenciakészítményt is vizsgálni kell. A víruskoncentráció szolgál alapul az egerekben végzett neurovirulencia vizsgálatban használt vírus mennyiségének meghatározásához. A vírus jellemzőinek állandósága. Az egyesített aratásban vagy a letöltés előtti késztermék vakcinában lévő vaccinia vírust olyan módszerekkel kell vizsgálni, amelyekkel megállapítható, hogy a vaccinia vírus fenotípusos és genetikai jellemzői nem változtak az előállítási folyamat során a vírus szaporodása alatt. Ezekben a vizsgálatokban az oltócsíra-törzstételt vagy az azzal egyenértékű készítményt kell összehasonlító mintaként használni. Az összehasonlító mintát és az alkalmazott vizsgálatokat az illetékes hatóság hagyja jóvá. Neurovirulencia. Az egyesített aratás neurovirulenciáját egy összehasonlító eredeti (vagy annak megfelelő) oltócsírával összehasonlítva kell értékelni; a vizsgálathoz szopós egereket az egyesített aratással intracerebrálisan oltunk. Az elfogadható és a nem elfogadható gyártási tételek közötti különbségek értékelésére egyéb vizsgálatok is alkalmasak lehetnek. Maradék DNS. A folyamatos sejtvonalakon szaporított vírusok esetében vizsgálni kell az egyesített aratás maradék DNS-tartalmát. Az előállítási eljárással igazolni kell, hogy a sejteredetű DNS mennyisége emberi adagonként kevesebb, mint 10 ng. Bakteriális és gombaszennyezettség. Az állati bőrön termelt vakcinák kivételével, a letöltés előtti késztermék vakcina feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményeinek, mindegyik közegre 10 ml mintát oltva. Mikoplazmák (2.6.7). Az állati bőrön termelt vakcinák kivételével, a letöltés előtti késztermék vakcina feleljen meg a vizsgálat követelményeinek, 10 ml mintát vizsgálva. LETÖLTÉS ELŐTTI KÉSZTERMÉK VAKCINA A felszabadításhoz szükséges legkisebb víruskoncentráció értékét a stabilitási adatok ismeretében úgy kell megállapítani, hogy a feliraton feltüntetett legkisebb érték bizonyítottan jelen legyen a készítmény lejárati idejéig. ÉLŐ ÁLLATBAN TERMELT VAKCINA

7 Vaccinum rotaviri variolae vivum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Az egyesített aratást centrifugáljuk. Amennyiben a vakcinát folyadék formában használják fel, az idegen kórokozók mennyiségének csökkentésére szolgáló eljárás glicerin vagy egyéb alkalmas, antimikrobás anyagot is tartalmazó hígítófolyadék hozzáadásából, majd átmenetileg egy bizonyos hőmérsékleten való tartásból állhat. Amennyiben a vakcina szárított formában kerül felhasználásra, az eljárás alkalmas antimikrobás anyag hozzáadásából állhat. Az élő állatokon termelt vakcinákra a következő speciális követelmények vonatkoznak. Csak az a letöltés előtti késztermék vakcina használható fel kész gyártási tétel előállítására, amely megfelel az alábbi követelményeknek. Teljes baktériumszám: milliliterenként legfeljebb 50, csak az állati bőrön termelt vakcinák esetében, a letöltés előtti késztermék vakcina megfelelő mennyiségéből lemezen számlálással meghatározva. Escherichia coli. A letöltés előtti késztermék vakcina 1:100 arányú hígításának legalább 1 ml-ét az E. coli-t egyéb baktériumoktól megkülönböztető közeget tartalmazó lemezekre oltunk. A lemezeket 48 órán át C-on inkubáljuk. Amennyiben a letöltés előtti késztemék vakcinában E. coli mutatható ki, a letöltés előtti késztermék vakcinát meg kell semmisíteni, illetve az illetékes hatóság döntése alapján kell eljárni. Hemolitikus streptococcusok, koaguláz-pozitív staphylococcusok vagy egyéb olyan kórokozó mikroorganizmusok, amelyek esetében ismert, hogy vakcináció útján veszélyesek az emberre. Legalább 1 ml, 1:100 hígítású letöltés előtti késztermék vakcinát véres agarra oltunk. A lemezeket 48 órán át C-on inkubáljuk. Amennyiben kimutathatók a fent említett mikroorganizmusok, a letöltés előtti késztermék vakcinát meg kell semmisíteni. Bacillus anthracis. Minden egyes telepet meg kell vizsgálni, amely a lemezek bármelyikén alaktanilag a B. anthracis-ra emlékeztet. Amennyiben a telepen lévő szervezetek nem mozgékonyak, a B. anthracis tenyészet jellegére vonatkozó további vizsgálatok végzendők, beleértve az alkalmas állatokon végzett megbetegítő képesség vizsgálatot. Amennyiben B. anthracis jelenléte igazolt, a letöltés előtti késztermék vakcinát és minden egyéb, vele kapcsolatban lévő tételt meg kell semmisíteni. Kiegészítő validált molekuláris vizsgálatok végezhetők. Clostridium tetani és más kórokozó spórás anaerob mikroorganizmusok. A letöltés előtti késztermék vakcina legalább 10 ml-es mennyiségét 10 csőbe, melyek legalább 10 ml, az anaerob mikroorganizmusok növekedésére alkalmas közeget tartalmaznak, azonos térfogatban szétosztjuk. A csöveket 1 órán át 65 C-on, a nem spórás alakok mennyiségének csökkentésére, majd legalább 1 hétig anaerob körülmények között, C-on tartjuk. Minden egyes csőből vagy lemezről, amelyen növekedés figyelhető meg, megfelelő közegre átoltást végzünk lemezöntéssel; a lemezek anaerob körülmények között, azonos hőmérsékleten tartandók. Minden anaerob telepet vizsgálni és azonosítani kell. Amennyiben C. tetani vagy egyéb kórokozó spórás anaerob mikroorganizmusok jelenléte igazolt, a letöltés előtti késztermék vakcinát meg kell semmisíteni. TOJÁSBAN TERMELT VAKCINA Az egyesített aratások derítendők, majd tovább tisztíthatók. SZÖVETKULTÚRÁN TERMELT VAKCINA (PRIMER CSIRKEEMBRIÓ-FIBROBLASZTOK, HUMAN DIPLOID SEJTEK VAGY FOLYAMATOS SEJTVONALAK) Az egyesített aratások a sejtek eltávolításával derítendők, majd tovább tisztíthatók. KÉSZ GYÁRTÁSI TÉTEL Csak az a kész gyártási tétel szabadítható fel, amely megfelel a felszabadításhoz szükséges minimális vírusmennyiségre és az előírt hőstabilitásra vonatkozó, illetve az alábbiakban, az Azonosítás, Vizsgálatok és Hatóérték-meghatározás pontokban megadott követelményeknek. Amennyiben a mikrobiológiai tartósítószerre, a fehérjetartalomra, a szarvasmarha szérumalbuminra és az ovalbuminra

8 Vaccinum rotaviri variolae vivum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur vonatkozó vizsgálatok a letöltés előtti késztermék vakcina vizsgálata során megfelelő eredménnyel zárultak, a vizsgálatok a kész gyártási tétel esetében elhagyhatók. Hőstabilitás. A folyékony állapotú készítmények esetében legalább 3, kész gyártási tételt tartalmazó tartályt meghatározott ideig magasabb hőmérsékleten tartunk, olyan körülmények között, amelyek az adott termék esetében megfelelőek, az illetékes hatóság jóváhagyásával. A víruskoncentráció meghatározása a melegen tartott és a tárolási utasítás szerint előírt hőmérsékleten tartott vakcina-minták párhuzamos vizsgálatával, a Hatóértékmeghatározás pontban leírtak szerint történik. A melegített tartályokban lévő minták víruskoncentrációja a megadott melegen tartási időszakban nem csökkenhet a jóváhagyottnál nagyobb mértékben. A vizsgálat körülményeit és a követelményeket az illetékes hatóság hagyja jóvá. A fagyasztva szárított készítmények esetén a kész gyártási tételből származó legalább 3 tartályt száraz állapotban 37±1 C-on 28 napig tartunk. A víruskoncentráció meghatározását a melegített vakcinával, és az előírt hőmérsékleten tárolt vakcinával párhuzamosan kell végezni. A melegített vakcina víruskoncentrációja legfeljebb 1,0 log egységgel lehet alacsonyabb, mint a nem melegített vakcináé. AZONOSÍTÁS A vaccinia vírust megfelelő módszerrel azonosítani kell. VIZSGÁLATOK Mikrobiológiai tartósítószer. Ha a készítmény tartalmaz mikrobiológiai tartósítószert, annak mennyiségét megfelelő kémiai módszerrel meg kell határozni. A mikrobiológiai tartósítószer mennyisége nem lehet kevesebb, mint a hatásosnak bizonyult legkisebb mennyiség, ugyanakkor nem lehet több a feliraton feltüntetett érték 115%-ánál. Fenol (2.5.15): legfeljebb 0,5%, amennyiben az előállítás során fenolt alkalmaznak. Fehérjetartalom. Minden egyes letöltött gyártási tétel fehérjetartalmát meg kell határozni, amennyiben a letöltés előtti késztermék vakcinában nem történt meg a fehérjetartalom meghatározása. Az érték az illetékes hatóság által jóváhagyott határértékek között legyen. Szarvasmarha szérumalbumin: legfeljebb 50 ng egy emberi adagban, megfelelő immunkémiai módszerrel (2.7.1) meghatározva, amennyiben szarvasmarha szérumalbumint használnak a sejttenyészetek előállítása és fenntartása során. Ovalbumin. Az előkeltetett tyúktojásokban előállított vakcinák esetében az ovalbumintartalom az illetékes hatóság által jóváhagyott határértékek között kell legyen. Maradék nedvesség. A fagyasztva szárított vakcinák egyes gyártási tételeiben a maradék nedvességtartalom az illetékes hatóság által jóváhagyott határértékek között legyen. Baktériumszám. A bőrön előállított vakcinák esetében a vakcinát megfelelő mikroszkópos és tenyésztési eljárásokkal kell vizsgálni emberre patogén mikroorganizmusok, különös tekintettel hemolitikus streptococcusok, staphylococcusok, kórokozó spórás mikroorganizmusok, elsősorban B. anthracis és E. coli jelenlétére. A vakcina ezektől a szennyezőktől mentes legyen. A nem patogén baktériumok teljes száma nem haladhatja meg az 50-et, a vakcina 1 ml-ében. Sterilitás (2.6.1). A bőrön termelt vakcinák kivételével, a vakcina feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményének. Bakteriális endotoxinok (2.6.14). A vakcina feleljen meg az illetékes hatóság által jóváhagyott követelményeknek.

9 Vaccinum rotaviri variolae vivum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur HATÓÉRTÉK-MEGHATÁROZÁS A vírustartalom meghatározásához a vakcina legalább 3 üvegcséjének tartalmát titráljuk, szükség esetén reszuszpendálás után. Az egyes meghatározások validálására a megfelelő referenciakészítmény egy üvegcséjének tartalmával 3 párhuzamos titrálást végzünk. A referenciakészítmény vírustartalmát egy kontrollgrafikon segítségével monitorozzák, és a készítmény titerét a történeti feljegyzések alapján állapítják meg minden egyes laboratórium esetében. A vakcina egyes üvegcséinek vírustartalmát, a referenciakészítmény párhuzamos titrálásai során kapott vírustartalom-értékeket, illetve az átlagos vírustartalmat a szokásos statisztikai módszerek (például 5.3) segítségével számítjuk. Az átlagos vírustartalom a 3 üvegcse esetében nem lehet kisebb 8,0 log 10 pock-képző egységnél vagy annak hitelesített plakk-képző egység megfelelőjénél, illetve 50%-os sejtkultúra-fertőző adagnál milliliterenként, kivéve amennyiben klinikai vizsgálatokkal igazolt az ennél alacsonyabb hatóértékű vakcina alkalmazhatósága. A meghatározás nem értékelhető, amennyiben: a referenciakészítmény 3 párhuzamos meghatározásból számított becsült vírustartalmának konfidenciaintervalluma (P=0,95) nagyobb, mint ±0,5 log fertőző egység érték; a referenciakészítmény vírustartalma 0,5 log fertőző egység értéknél jobban eltér a feltüntetett értéknél. A meghatározást meg kell ismételni, amennyiben a vakcina értékelhető meghatározásokból, a szokásos statisztikai módszerekkel (például 5.3) számított átlagos vírustartalmának konfidencia-intervalluma (P=0,95) nagyobb, mint ±0,5 log fertőző egység érték. A vakcina átlagos vírustartalmának konfidenciaintervalluma (P=0,95) nem lehet nagyobb, mint ±0,5 log fertőző egység érték. Indokolt és engedélyezett esetekben más hatóérték-meghatározási módszer is alkalmazható, ilyenkor előfordulhat, hogy eltérő validitási és elfogadhatósági kritériumokat kell alkalmazni. Amennyiben azonban a fenti vizsgálatot végeznék el a vakcinán, ebben az esetben is meg kell felelnie a vizsgálat követelményeinek. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni: a vakcina vírustörzs jelölését; a milliliterenkénti legkisebb vírustartalmat; a vakcina előállítására használt közeget; a stabilizátor, tartósítószer vagy a vakcinában és/vagy az oldószerben jelenlévő egyéb adalékanyagok természetét és mennyiségét.