Alfa-1-antitripszin hiány jelentõsége gyermekkori májbetegségekben és más immunpathomechanizmusú. PhD értekezés. Dr. Szõnyi László

Alfa-1-antitripszin hiány jelentõsége gyermekkori májbetegségekben és más immunpathomechanizmusú kórképekben PhD értekezés Dr. Szõnyi László Készült a Semmelweis Egyetem Doktori Iskola A krónikus betegségek gyermekkori prevenciója címû program keretében A Semmelweis Egyetem I. Sz. Gyermekklinikáján Témavezetõ: Programvezetõ: dr. Arató András Prof. Tulassay Tivadar Szigorlati bizottság tagjai: Elnök: Prof. Szalay Ferenc Tagok: Prof. Schaff Zsuzsanna Dr. B. Kovács Judit Hivatalos bírálók: Dr. Abonyi Margit PhD. I.sz. Belgyógyászati Klinika Dr. Szabó Teréz PhD. Heim Pál Kórház Budapest 2005

2 Tartalomjegyzék 1. Tartalomjegyzék 2 2. Összefoglalás 6 3. Summary 7 4. Bevezetés 8 4. 1. Az AAT molekula szerkezete és funkciója. 8 4. 2. Az AAT hiány patomechanizmusa. 10 4. 2. 1. A tüdõbetegség patomechanizmusa AAT hiányban. 11 4. 2. 2. A májbetegség patomechanizmusa AAT hiányban. 12 4. 2. 3. AAT variánsok szerepe immunológiai betegségek patomechanizmusában.13 4. 3. Az AAT hiány klinikai jelentõsége. 14 5. Az alfa 1 antitripszin (AAT) fenotípus hazai epidemiológiai vizsgálata. Az AAT fenotípus májbetegségben, mucoviscidosisban és IgA-nephropathiában. 15 5. 1. Célkitûzések 18 5. 1. 1. Az AAT fenotípus elõfordulásának magyarországi, egészséges populációra vonatkozó referencia értékének megállapítása. 18 5. 1. 2. Csecsemõ és gyermekkori krónikus májbetegekben az AAT fenotípus elõfordulásának vizsgálata. 18 5. 1. 3. Az AAT fenotípus szerepének vizsgálata mucoviscidosishoz társuló májbetegségben. 19 5. 1. 4. Az AAT fenotípus szerepének vizsgálata IgA nephropathiaban. 19 5. 1. 5. Az AAT-fenotípus szerepe ritka kórképekben (esetismertetések). 19 5. 2. Betegek és módszerek 20 5. 2. 1. Betegek 20 5. 2. 1. 1. Egészséges, magyarországi populációban AAT fenotípus gyakoriságának megállapítása referencia érték céljából. 20 5. 2. 1. 2. AAT fenotípus gyakoriságának megállapítása céljából vizsgált csecsemõ és gyermekkori krónikus májbetegek. 20 5. 2. 1. 3. AAT fenotípus gyakoriságának megállapítása céljából vizsgált mucoviscidosisban szenvedõ betegek. 23 2

3 5. 2. 1. 4. AAT fenotípus gyakoriságának megállapítása céljából vizsgált IgA nephropathiaban szenvedõ betegek. 23 5. 2. 1. 5. Az AAT-fenotípus szerepe ritka kórképekben (esetismertetések). 24 5. 2. 1. 5. 1. Biliaris atresia következtében kialakult cirrhosis hepatis miatt indikált kadaver transzplantáció. 24 5. 2. 1. 5. 2. Májbetegséget okozó szénhidráthiányos glikoprotein szindróma. 24 5. 2. 1. 5. 3. Koraszülöttség, agyvérzés, májbetegség fatalis esete 25 5. 2. 2. Módszerek 25 5. 2. 2. 1. Az AAT szérumszint meghatározása 25 5. 2. 2. 2. Az AAT fenotípus meghatározása izoelektromos fókuszálással 26 5. 2. 2. 3. A PiS és PiZ allél meghatározása molekuláris genetikai módszerrel 28 5. 2. 2. 4. AAT kimutatás vesében immunhisztokémiai módszerrel 29 5. 3. Eredmények 29 5. 3. 1. Az AAT fenotípus gyakorisága egészséges magyarországi populációban 29 5. 3. 2. Az AAT fenotípus gyakorisága magyarországi csecsemõ és gyermekkori krónikus májbetegekben. 30 5. 3. 3. Az AAT fenotípus gyakorisága magyarországi, mucoviscidosisban szenvedõ betegekben. 36 5. 3. 4. Az AAT fenotípus gyakorisága magyarországi, IgA nephropathiaban szenvedõ betegekben. 38 5. 3. 5. Különleges AAT fenotípusok különbözõ kórképekben 40 5. 3. 5. 1. AAT fenotípus megváltozása biliaris atresia következtében kialakult cirrhosis hepatis miatt indikált kadaver májátültetés után. 40 5. 3. 5. 2. Atípusos AAT fenotípussal járó szénhidráthiányos glikoprotein szindróma. 41 5. 3. 5. 3. Újszülöttkori, fatalis, sokszervi elégtelenséget okozó ritka AAT variáns. 42 5. 4. Megbeszélés 43 5. 4. 1. Az AAT fenotípus hazai gyakorisága megfelel az európai megoszlásnak 43 5. 4. 2. Az AAT variánsai fontos szerepet játszanak a magyarországi csecsemõ és gyermekkori krónikus májbetegekben 45 3

4 5. 4. 3. Az AAT fenotípus nem befolyásolja a mucoviscidosisban szenvedõ betegekben kialakuló májbetegséget. 48 5. 4. 4. Az AAT variánsai bizonyos hatással lehetnek az IgA nephropathiaban szenvedõ betegek kórlefolyására. 49 5. 4. 5. A ritka AAT fenotípusok különleges kórképeket okozhatnak 51 5. 4. 5. 1. A májátültetés megváltoztatja a recipiens AAT fenotípusát 51 5. 4. 5. 2. A szénhidráthiányos glikoprotein szindróma atípusos AAT elektroforetikus képet okozhat. 52 5. 4. 5. 3. Újszülöttkori, fatalis, sokszervi elégtelenség hátterében állhat ritka AAT variáns. 52 6. Köszönetnyilvánítás 55 7. Rövidítések jegyzéke 56 8. Ábrák és táblázatok jegyzéke 57 9. Közlemények 59 9. 1. Saját közlemények jegyzéke 59 9. 1. 1. Értekezéshez kapcsolódó saját közlemények. 59 9. 1. 2. Értekezéshez nem kjapcsolódó saját közlemények 59 9. 2. Felhasznált szakirodalom. 66 4

5 2. Összefoglalás Kutatómunkám során a gyermekkori májbetegséget okozó öröklõdõ betegséggel, az alfa-1-antitripszin (AAT) hiánnyal foglalkoztam. Az AAT molekula variánsainak elõfordulási gyakoriságát vizsgáltam egészséges populációban, májbeteg és mucoviscidosisban szenvedõ gyermekekben. Munkám kapcsán kitértem egy felnõttkori immun-patomechanizmusú betegség, az IgA nephropathia és az AAT hiány összefüggésére is. Magyarországon elsõként nagy elemszámú, a magyarországi népességet jól reprezentáló mintán igazoltuk, hogy a PiM allél gyakorisága 97,21%, a PiZ allélé 0,95% míg a PiS allélé 1,65%. Ennek alapján Magyarországon a súlyos máj- vagy tüdõbetegséget okozó PiZZ homozigóta állapot várható elõfordulása 1:10526, míg a PiSS homozigótáé 1:6060. Megállapítottuk, hogy az AAT hiány Magyarországon is gyakori gyermekkori májbetegséget okozó öröklõdõ anyagcsere-betegség. A vizsgált PiZZ homozigóta betegek klinikai jellemzõi megfelelnek a nemzetközi irodalomban közölteknek. További vizsgálatunk eredménye arra utal, hogy az AAT fenotípus nincs lényeges hatással a mucovoscidosisban kialakuló májbetegségre. IgA nephropathiaban az AAT fenotípus változása nem fokozza a kockázatot, de hatással lehet a betegség kimenetelére és a vesebetegséghez társuló esetleges egyéb kórképekre. Három beteg esetének ismertetésével felhívom a figyelmet a májbetegséget okozó PiZ allél májátültetéssel történõ átvitelére (1), arra, hogy atípusos AAT elektroforézis képet szénhidráthiányos glikoprotein szindróma is okozhat (2), valamint arra, hogy az AAT molekula egyik ritka variánsa újszülöttkori agyvérzésben és májbetegségben is elõfordulhat. 5

6 3. Summary The alpha-1-antitrypsin deficiency is associated with premature development of pulmonary emphysema and in some cases chronic liver disease. The frequency of PiM allele, PiZ and PiS alleles are 97, 2%, 0, 95% and 1, 65% respectively. Therefore, the hypothetical prevalence of PiZZ and PiSS homozygous alleles are 1:10526 and 1:6060, respectively. We estimated the prevalence of mutant allelic forms in children with chronic liver disease and their relation with clinical signs. The results showed that the alpha-1-antitrypsin deficiency is a common inherited disease in Hungary. Its clinical picture is similar to that described in the literature. A correct diagnosis requires knowledge of the serum level and the phenotype of AAT, especially in the event of neonatal cholestasis and an elevated transferase activity. We determined the AAT phenotype in cystic fibrosis patients with different types of hepatobiliary involvement and establish whether the phenotype has any influence on the severity of the liver disease in CF. The mutant alleles have no effect on the development of the liver disease in CF patients. AAT phenotype is not associated with the risk of primary IgA nephropathy (IgAN), but might have an impact on disease outcome as well as on the risk of secondary IgAN. The recipient s Pi phenotype can change after liver transplantation. We observed a very strange Pi MZS phenotype in a transplanted child. The alpha-1-antitrypsin is a glycoprotein, therefore in congenital disorder of glycosylation (CDG) the picture of the isoelectric focusing can change. This can be the first step to the proper diagnosis in CDG. Very rare Pi variant can cause typical AAT deficiency with fatal liver disease and haemorrhage cerebri in infancy. 6

7 4. Bevezetés Az alfa-1-antitripszin hiány az európai ember (kaukázusi) betegsége, mely gyermekkorban májbetegséget, felnõttkorban tüdõbetegséget okozhat, valamint szerepe lehet különbözõ immunológiai kórképek kialakulásában. Régészeti kutatás szerint az elsõ - post mortem diagnosztizált - beteg, aki feltételezhetõen AAT hiány miatt halt meg, 800 évvel ezelõtt élt Alaszkában (56). A mûvészettörténet alakjai közül Frederic Chopin korai, 39 éves korában bekövetkezett halálában fontos szerepet játszhatott az AAT hiány (62, 63). A diagnózis a klinikai tünetek (visszatérõ, súlyos léguti betegség, gastrointetinalis vérzés, sárgaság) és a családi anamnézis alapján merült fel. Emília nevû húga 14 éves korban, gastrointestinalis vérzés következtében halt meg. Genetikai vizsgálatra nem volt lehetsõség. A leggyakrabban betegséget okozó Z mutáció feltételezhetõen 33 generációval elõttünk ha egy generációt 25 évnek tekintünk, akkor 800 850 évvel ezelõtt alakult ki Skandinávia déli részén. A másik, enyhébb megbetegedést okozó S mutáció kialakulási helye az Ibériai félsziget nyugati részén a mai Portugália területén lehetett mintegy 300 450 generációval ezelõtt. A kórkép pulmonológiai vonatkozásait elõször Laurell és Erikson 1963-ban írta le (65). Felismerték az alacsony szérum AAT szint és az emfizéma kialakulása közötti összefüggést. Néhány évvel késõbb egy cirrhosisban szenvedõ testvérpár vizsgálata során igazolták az AAT hiány szerepét a májbetegség kialakulásában. Azóta kiderült, hogy az AAT hiány a leggyakoribb, gyermekkorban súlyos májbetegséget okozó öröklõdõ kórkép. A molekuláris biológia utóbbi évtizedekben bekövetkezõ fejlõdése a csecsemõ és gyermekkori májbetegségek egyre nagyobb részében teszik lehetõvé a leíró diagnózis oki diagnózissá változtatását. Ennek köszönhetõ a kórképek pontosabb kórismézése, a patomechanizmus jobb megismerése és esetenként a hatékony kezelés kifejlesztése. Munkám során a csecsemõ- és gyermekkori májbetegségek közül az AAT hiány korszerû diagnosztikájával foglalkoztam. Értekezésem ezen a területen végzett kutatómunkánk eredményeit összegzi. Az elsõ részben az AAT hiány hazai elõfordulásával kapcsolatos eredményeimet mutatom be. Munkám során meghatároztam a magyarországi referenciaértékeket egészséges populációban. 7

8 Továbbiakban jelentõs számú krónikus májbeteg gyermek AAT fenotípusát határoztuk meg. Összehasonlítottuk a mindkét kóros mutációt hordozó (homozigóta) betegek májbetegségét a csak az egyik mutációt hordozókéval (heterozigóta), hogy választ kapjunk arra a kérdésre, hogy komorbid tényezõ-e a mutáció hordozása májbetegségben. Mucoviscidosisban szenvedõ betegeknél elemeztem az AAT hiány és a májbetegség közötti kapcsolatot. Felnõttekben külön vizsgáltam az AAT hiány jelentõségét egy immunmediált felnõttkori betegség, az IgA nephropathia kialakulásában. Három esettanulmány segítségével bemutatom, hogy a májátültetéssel májbetegséget okozó mutánst vihetünk be a recipiens szervezetébe, hogy az AAT isoelektromos fókuszálása segítséget nyújthat egy újonnan felismert kórképcsoport a szénhidráthiányos glikoprotein szindróma diagnózisában valamint hogy egy nagyon ritka proteáz inhibitor (Pi) mutáns újszülöttkori agyvérzést és májbetegséget okozhat. 4. 1. Az AAT molekula szerkezete és funkciója. Az AAT molekula 52 kd molekulasúlyú, döntõen a májban, lényegesen kisebb mennyiségben a tüdõ és a bél epitheliális sejtjeiben és a macrophagokban szintetizálódó glikoprotein (21, 73, 79). A fehérje részt 394 aminosav alkotja. A molekula 12%-a szénhidrát, mely galaktózból, mannózból, sziálsavból és N-acetil-glukózaminból áll és 3 komplex oldallánccal kapcsolódik a fehérjéhez. Kristályszerkezeti vizsgálatok szerint a molekula három lemezbõl és egy mobilis reaktív hurokból áll, melynek egy peptid része a proteináz pszeudoszubsztrátját képezi. A kritikus helyen methionin és serin található, melyek a kötõhely a proteinase számára. Az AAT a pancreas tripszin hatástalanításáról kapta a nevét. Az AAT gén a 14q32.1 kromoszóma lokuszon helyezkedik el a SERPIN (SERine Protease INhibitor) szupergenben, melynek része a korticosteroidot kötõ globulin (CBG), az AAT - szerû pszeudogén (PIL), a protein C inhibitor és az alfa-1- antichymotripsin (AACT) génje. Az AAT gen 12,2 kb nagyságú hét exonból és hat intronból áll. Az AAT molekula reaktív szakaszának (Met358 - -Ser359) kódját az V. exon tartalmazza. Öröklõdés menete kodomináns: mindkét allél egymástól függetlenül 8

9 fejti ki hatását. Ezen közel 100 mutációt azonosítottak, melyek egy része a molekula funkcióját is befolyásolja. Humán szérum elektroforézis vizsgálata során az AAT az alfa-1-globulin csíkban jelenik meg és 90%-át alkotja ennek a fehérje frakciónak. AAT hiány esetén alig látszik az alfa-1-globulin csík. A mutációkat a proteáz inhibitor Pi rendszerbe sorolták be. A különbözõ variánsokat az ABC betûivel nevezték el az elektroforézis alkalmával észlelt sebességük alapján. A leggyakoribb, a populáció 86-99 %-ában fellehetõ M fenotípus, melynek 4 altípusa ismert. A Pi MM és sok Pi variáns normális szérum AAT szinttel jár. Az izoleketromo fókuszálás során leglassabban vándorló variáns a Z jelet kapta. A Pi Z mutációt (Glu342Lys) és a Pi S mutációt (Glu264Val) hordozók szérum AAT szintje alacsony, mely összefügg az AAT tüdõkárosító hatásával. A normális szérum AAT szint 60%-a mérhetõ a PiSS és mintegy 15-%-a a PiZZ mutációt hordozóknál. Az AAT hiány klinikai képe Pi ZZ homozigóta fentotípushoz társul, de leírtak eltérést Pi MZ és Pi SZ heterozygóták esetében is. Számos biológiai folyamat biztonságos mûködéséhez szoros ellenõrzõ rendszer szükséges. Különösen igaz ez a proteáz antiproteáz folyamatokra. Egészséges állapotra a proteinázok és antiproteinázok egyensúlya a jellemzõ. A proteázok fölénybe kerülése esetén, súlyos szövetkárosodás keletkezik. A proteázok közé tartozik a tripszin, chymotripszin, plazmin, kallikrein és az elasztáz, mely a neutrofil granulociták granulumaiban található és hatását extracelluláris proteinázként fejti ki. Legfontosabb célpontja az elasztin, de egyéb fehérjéket is megtámad, melyek az alvadásban vagy a komplement rendszerben játszanak fontos szerepet. Az utóbbi évek kutatási eredményei szerint a proteáz inhibitorok nagy családjából a legfontosabb extra és intracellularis folyamatokban a szerin proteáz inhibitorok vesznek részt. Ebbe a családba tartozik az AAT, mely a tüdõ kötõszövetet védi a granulocytákból felszabaduló elasztáztól; az antitrombin, mely a véralvadás során keletkezõ proteáz, a C1 inhibitor, mely a komplement aktivációban; és a plazmin inhibitor, mely a fibrinolizist szabályozásában vesz részt. Az AAT legfontosabb feladata az elpusztuló neutrofil granulocytákból felszabaduló elasztáz hatástalanítása. Az AAT molekula reaktív centrumához kapcsolódik a proteináz és ezt követõen az AAT molekulában olyan formai változás következik be, melynek során az adott proteáz irreversibilisen inaktiválódik. Lomas szemléletes hasonlata szerint a lezajló alakváltozás 9

10 egy egérfogó mûködéséhez hasonlít (67). A mobilis aktív rész (pszeudoszubsztrát) megfogja (dokkolja) a proteinázt, majd az egyik lemez ráhajlik a molekulára. A molekula reaktív része methioninból és szerinbõl áll. A dokkolt AAT és proteináz molekula a megfelelõ receptorhoz kötõdik a májban és kikerül a keringésbõl. Az egérfogóhoz hasonló módszerrel a proteinázok nagy biztonsággal eltávolíthatók a szervezetbõl. Ez a finom mozgás sérül, ha a mobilis régióban szerkezeti eltérés következik be (19). A variáns AAT molekulák esetében ez az eset. Az utóbbi években egyre nagyobb érdeklõdés kíséri a különleges AAT variánsokat. Olaszországi epidemiológiai vizsgálatok azt mutatták, hogy ezek aránya a nem-pim mutánsok között elérheti akár a 22%-ot is. Úgy látszik, hogy a különleges mutánsok aránya magasabb azokban a régiókban, ahol a PiZ variáns aránya alacsony (68). 4. 2. Az AAT hiány patomechanizmusa. Az AAT hiány az európai ember betegsége, csecsemõ és gyermekkorban májbetegséget, fiatal felnõttkorban tüdõbetegséget okoz. Egyes immunológiai betegségekben kisebb arányban, de igazolható a mutáns AAT patognomikus szerepe. A patomechanizmus mindhárom esetben különbözõ. Az AAT hiányt egy gén mutációja okozza, de a kórkép fenotípusa több gén hatására utal (29). Ezeknek a genetikai hatásoknak vizsgálata segítségünkre lehet a kórképek patomechanizmusának jobb megértéséhez. 10

11 4. 2. 1. táblázat. Kóros szerkezetû AAT molekulával összefüggõ szindrómák 1. Alacsony szérum AAT szint. 1. 1. 60 %-ban tüdõemphysema, krónikus bronchitis alakul ki. 2. A kóros molekula raktározódása a hepatocytában. 2. 1. Az érintettek 89%-a nem lesz beteg. 2. 2. Neonatalis cholestasis 11%-ban alakul ki. 1.2.1. Csecsemõkorban cirrhosis 2%-ban. 1.2.2. Krónikus hepatitis 9%-ban 1.2.2.1. Cirrhosis 1.2.2.2. Hepatocellularis carcinoma. 3. Kóros változások következhetnek be immunológiai folyamatokban. 3. 1. Vasculitis 3. 2. Panniculitis 3. 3. Uveitis 3. 4. Egyéb immunmediálta kórképek 3.3. 4. 2. 1. A tüdõbetegség patomechanizmusa AAT hiányban. Egy molekula AAT egy proteázt (Pl: elasztázt) köt meg és a hatástalanított proteáz így eliminálódik. Amennyiben a felszabaduló elasztáz gátlása nem történik meg, a tüdõszövetben található fehérjék bontását kezdi meg. AAT hiány esetén a kóros AAT molekula nem vagy csak részben kerüli ki a hepatocytákból, ennek következtében a szérumban és a tüdõszövetekben az AAT szint alacsony lesz és nem lesz elegendõ a felszabaduló elasztáz megkötésére. A cigarettafüst közvetlen károsító hatása tovább rontja a Z mutáns inhibitor képességét. Végezetül a tüdõben is számolni kell a mutáns 11

12 molekula fokozott polimerizációs készségével. A patológiás eltéréseket a kiesõ vagy csökkent AAT funkció okozza. A PiZZ egyénekben fiatal felnõttkori emfizéma alakul ki az esetek 60%-ában. A pulmonalis érintettség dohányzók esetén 30, nem dohányzók esetén 50 éves kor után jelentkezik (68). 4. 2. 2. A májbetegség patomechanizmusa AAT hiányban. A májbetegség patomechanizmusa kevésbé ismert. Az utóbbi évtized kutatási eredménye szerint a májkárosodás kialakulásának feltétele olyan kóros szerkezetû AAT molekula, amely spontán polimerizációra hajlamos (68). A PiZ mutáció egy aminosav cseréje következtében minimális, de hatásában rendkívül lényeges változás. A változás lényege, hogy a molekula stabilitása megváltozik és hajlamos lesz intracellularis polimerizációra. A PiZ mutáción kívül további két variáns esetében számoltak be alacsony plazma koncentráció mellett májban kialakuló AAT felhalmozódásró. Az egyik az AAT Siiyama (Ser53Phen), mely a leggyakoribb AAT hiányt okozó mutáns Japánban (91). A másik variáns az M malton (phenilalanin deletiója az 52-es helyen), mely a leggyakoribb AAT-hiányt okozó mutáns Szardíniában (90). Mindkét esetben az alakváltozás következtében a PiZ mutációhoz hasonlóan - a molekula polimerizációra vált hajlamossá. Lényegesen enyhébb mértékben, de polimerizációra való hajlamot írtak le a PiS és PiI (Arg39Cys) variánsok esetében is. Ezekben az esetekben a klinikai kép is lassabban alakul ki és enyhe formában jelentkezik. A fenti hipotézist támasztja alá az is, hogy PiOO mutáció esetén amikor AAT molekula egyáltalán nem szintetizálódik a hepatocytákban - nem alakul ki májbetegség. A kóros szerkezetû, polimer molekula az endoplazmás retikulumban (ER) reked és így fejti ki károsító hatását. A molekula 3 dimenziós formáját az ER-ban nyeri el. A normális szerkezetû molekula az intersticiális folyadékba diffundál, míg a kóros szerkezetû a hepatocytákban marad. A kórkép tehát raktározási betegségnek is tartható (17). Az aggregáció az esetek egy részében kóros folyamatot indít el a májban. Sejtkultúrában vizsgálták a raktározás rövid és hosszú távú következményeit. Az eredmények azt mutatták, hogy a raktározás megváltoztatja az ER szerkezetét. Különbözõ tényezõk a megváltozott ER-ban autophag reakciót válthatnak ki. Ilyen 12

13 tényezõ lehet a stress (éhezés), a differenciálódással együtt járó átalakulás (remodeling) vagy az öregedés. Transzgenikus egerekben expresszáltak emberi AAT PiZ fenotípusú gént. A májban hepatocyta necrosis, neutrofil sejtek felszaporodásával járó microabscessusok alakultak ki, melyet regeneratív aktivitás követett. Hat hetes korban dysplasticus jelek jelentek meg. Egy éves korban adenoma, majd 2 és 3 éves kor között hepatocellularis carcinoma alakult ki. További vizsgálatok szerint a raktározó ER két különbözõ jelzési utat használ. Az egyik során a nem megfelelõ szerkezetû molekula jelez a chaperon szabályozás felé. A másik út egy transzkripciós faktor aktiválása következtében alakul ki. Számos veleszületett anyagcsere-betegségben a kóros fehérje az ER-ban raktározódik. Ezek egy részében a raktározó sejt a hepatocyta és mégsem járnak ezek a betegségek hepatocyta necrosissal (68, 72). Az instabil molekula reakciókészségét környezeti tényezõk jelentõsen befolyásolják. Láz, aktív fázis reakció gyorsíthatja és elnyújthatja a polimerizáció folyamatát. Talán ez lehet az egyik oka, hogy a PiZZ hordozók esetében miért annyira heterogén a májbetegség klinikai megjelenése. 4. 2. 3. Immunológiai betegségek patomechanizmusa AAT hiányban. Az AAT akut fázis fehérje és ezért részt vesz a fertõzés vagy gyulladás következtében kialakult szövetkárosodás kijavításában. Itt is a molekula szerkezeti eltérése játszhat döntõ szerepet a kóros folyamat kialakulásában. Az akut fázis reakcióban résztvevõ fehérjék fokozott szintézise IL-6 hatására jön létre. Az AAT moduláló hatást fejt ki a gyulladásos válaszra, mely moduláló hatás magában foglalja mind a humorális, mind a cellularis faktorokat, érinti a sejtaktivációt és megváltoztatja a szekretált cytokinek funkcióját. A cytokinek prominens szerepet játszanak az AAT szintézisének szabályozásában (9, 11, 12). Az AAT gátolja a limfociták cytotoxikus reakcióját: az antitest dependens sejt mediált cytotoxicitást és a természetes ölõ cytoxicitást. Több immunmediált betegségben leírták különbözõ, a vad alléltõl eltérõ fenotípusok szerepét. Ezek közé a kórképek közé tartozik a panniculitis (95), a vasculitis (42, 46, 48), az allergia (9), az IgA nephropathia, az asthma, a rheumatoid arthritis (15, 55), a szisztémás lupus erythematodes és az uveitis anterior (13), psoriasis (6, 74). 13

14 A serpinek családjába tartozó antithrombin molekulában egy methionin arginin csere a molekula aktív centrumában olyan mûködésbeli változást hoz létre, mely rendkívül aktívan gátolja az alvadási folyamatban részt vevõ proteázokat. Emiatt életveszélyes haemorrhagiás betegség alakulhat ki. Az antithrombin másik mutációja a molekula érzékenységét fokozza és hõ hatására az antithrombin molekulák spontán kapcsolódnak egymással és inaktiválódnak. Lázas állapotban bekövetkezõ súlyos thrombosis lesz ennek a következménye. Lehetséges, hogy az AAT hiányban szenvedõ újszülöttekben kialakuló agyvérzés patomechanizmusa hasonló. Nem zárható ki, hogy hasonló mechanizmus játszik szerepet az AAT molekula más mutációja esetén is. Nem zárható ki az sem, hogy az AAT immunrendszerre történõ hatásában szerepe lehet annak, hogy az AAT-gén lokusza nagyon közel van a cortisol kötõ globulin lokuszához és utóbbi hatása fontosabb lehet a kórkép kialakulása szempontjából, mint a variáns AAT. 4. 3. Az AAT hiány klinikai jelentõsége Az epidemiológiai adatok arra utalnak, hogy az AAT hiányt okozó kóros mutációt hordozó emberek száma kb. 116 millió körül van; mintegy 1,1 millió lehet a súlyos, AAT hiánybetegségben szenvedõk száma. Az AAT hiány az egyik legsúlyosabb és legtöbb embert érintõ öröklõdõ megbetegedés. A kórkép aluldiagnosztizált és hiányosan ismert. Egy amerikai (300 PiZZ egyén) kérdõíves felmérése szerint a tünetek jelentkezése és a diagnózis felállítása között 7,1 év telt el. Közben minden beteget legalább 3 orvos vizsgált. A kérdezettek átlagos életkora 49 év volt (96). 14

15 5. Az AAT fenotípus hazai epidemiológiai vizsgálata. Az AAT fenotípus májbetegségben, mucoviscidosisban és IgA-nephropathiában. Kutatómunkám során az AAT hiány következõ kérdéseivel foglalkoztam:? Egy kórkép gyakoriságának ismerete egy adott populáción belül fontos, mert felhívja a figyelmet arra, hogy milyen gyakran várható a kórkép megjelenése. Különösen igaz ez olyan betegségekben, amelyeknek a klinikai spektruma széles, azaz azonos genetikai háttér rendkívül különbözõ fenotípussal jelentkezik. További nehézséget jelent, ha a klinikai tünetek idõvel változnak. Ilyen lehet, amikor a máj szöveti képe nem jellemzõ a betegségre az élet elsõ hónapjaiban, csak az elsõ életév vége felé. Fokozza a korai, pontos diagnózis iránti igényt az a körülmény, ha a késõbbi szervi érintettség megelõzhetõ. Az AAT hiány megfelel az elõbb leírt jellemzésnek: a kórkép gyakoriságának ismerete és a megelõzhetõ szervi érintettség serkenti a diagnosztikus aktivitást. Éppen ezért az utóbbi években egyre több országban készítenek AAT hiányban szenvedõ betegek adatait tartalmazó adatbázist. Figyelemre méltó adat, hogy az Egyesült Királyságban a betegek 76%-a tüdõmegbetegedés, 19%-a családvizsgálat és csupán 3%-a májbetegség kivizsgálása során került be a nemzeti AAT hiány regiszterbe (74). Magyarországon eddig nem állt rendelkezésre megbízható epidemiológiai adat sem.? Az ismeretlen aetiológiájú csecsemõkori májbetegségek aránya napjainkban is meghaladja a 30%-ot. Nehezíti a diagnosztikát, hogy a csecsemõkorban jelentkezõ májbetegségek klinikai tünetei a jelentõsen különbözõ kórokok ellenére azonosak lehetnek. Minden olyan diagnosztikus lépés, mely közel visz a pontos diagnózishoz, nagyon fontos, mert ha van megfelelõ kezelés, idõben el lehet kezdeni. Hatékony kezelés hiányában, biztos diagnózis esetén megóvja a beteget sok, vérigényes, esetleg kockázatos narkózist, fáradtságot igénylõ diagnosztikus beavatkozástól. Öröklõdõ kórképek esetén a pontos diagnózis alapvetõ segítség a családtervezés, genetikai tanácsadás szempontjából. Az AAT hiány gyermekkorban májbetegséget okozó hatásának spektruma Sveger svéd újszülöttek AAT szûrésének és utánvizsgálatának tapasztalatából ismerhetõ meg. 15

16 A vizsgált 200 000 újszülött között 120 esetben találtak alacsony AAT szintet. A betegek valamennyien PiZZ homozigoták voltak. Az élet elsõ 6 hónapjában a 120 csecsemõ 70%-nak volt laboratóriumi vizsgálattal igazolt, különbözõ mértékû májbetegsége (97), mely a normális érték felsõ határát meghaladó szérum transzferáz aktivitásban nyilvánult meg. A csecsemõk 8%-ban jelent meg icterus. A gyermekek 30%-ban májbetegség sem csecsemõkorban, sem késõbb nem jelentkezett. Késõbb, a PiZZ gyermekek 85%-ában már nem volt májbetegségre utaló eltérés és laboratóriumi értékeik normálisak voltak. Csecsemõkor után tehát a PiZZ homozigóták 10 15%-ában talált különbözõ súlyosságú májbetegséget. Cirrhosis, összes szövõdményeivel csupán 2-3%-ban alakult ki és a 18 éves korban történt utánvizsgálat szerint csak 3 gyermek halt meg 8 éves kora elõtt elhúzódó obstruktív sárgaság miatt (98, 99). Mindezek ellenére az AAT hiány okozta májzsugor az európai származású emberek körében a leggyakoribb, májátültetést indokoló veleszületett anyagcserebetegség. Az AAT PiZ heterozigóta hordozás májbetegséget okozó hatása a szakirodalomban nem eldöntött kérdés (5, 37, 89).? A mucoviscidosis az egyik leggyakoribb, halálos kimenetelû autoszomális recesszív öröklõdésû kórkép. A klinikai képre pulmonalis eltérés, hasnyálmirigy elégtelenség és változó mértékû máj és epeút elváltozás jellemzõ. A csökkent mennyiségû és kóros összetételû epe az intrahepaticus epeutakban epeútelzáródást, gyulladást, fibrosist majd biliaris cirrhosist okoz. Mucoviscidosisban a cirrhosis kialakulásának aránya 2 és 10% közötti (28, 68, 75). Az érintett gyermekek többségében a májbetegség az élet elsõ évtizedében splenomegaliával kezdõdik, mely portalis hypertensio talaján alakul ki. Nem ismertek azok a tényezõk, amelyek a hepatobiliaris elváltozás kialakulását elõsegítik (31, 88). A szakirodalomban korlátozott számú tanulmány található a mucoviscidosis és AAT hiány egy betegben történõ elõfordulásáról (43, 60, 70, 93). Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a két kórkép egy betegben történõ elõfordulásának gyakorisága nem haladja meg a normális populációban várható arányt. Néhány tanulmány az AAT mutáns allél hatását vizsgálta mucoviscidosisban szenvedõ betegek tüdõfolyamatára (50). Mahadeva 16

17 vizsgálatokkal igazolta, hogy a mucoviscidosis pulmonalis eltérését mutáns AAT jelenléte nem rontja, hanem kis mértékben javítja (71). A meglepõ eredmény mechanizmusa ismeretlen. Még kevesebb az olyan tanulmány, mely az AAT variáns hatását vizsgálta mucoviscidosisban szenvedõk májbetegségében.? Az IgA nephropathia a mesangioproliferativ glomerulonephritiszek közé tartozik. Minden életkorban jelentkezhet, de leggyakrabban az élet elsõ és második évtizedében diagnosztizálják. Az IgA nephropathia szövettani képére a mesangialis IgA depositio, a változó mértékû mesangialis sejtproliferáció és mesangialis matrix kiszélesedés jellemzõ. Az eddigi vizsgálatok szerint a betegség kialakulását az IgA szerkezetének megváltozása és termelésének szabályozási zavara okozza, melynek egyik jele a vérben az IgA immunkomplexek emelkedett szintje. A fokozott IgA termelést kiváltó antigen jellege egyelõre nem ismert. Több esettanulmány alapján felvetõdött az AAT mutációk szerepe az IgA nephropathia patomechanizmusában. Davis 1992-ben megjelent pathológiai tanulmányában 34 krónikus májbeteg veseszövetét vizsgálta. A betegek között 20 AAT hiányban szenvedett és többségükben széles klinikai spektrumú glomerularis eltérést igazolt. A vizsgálat eredménye felvetette a kóros összetételû fehérje, az AAT szerepét a vesebetegség kialakulásában (27). Figyelemre méltó Elzouki esetismertetése, melynek során a vesebetegség májátültetés után reversibilisnek bizonyult (38). Egy PiZZ fenotípusú nõbetegnek cirrhosisa alakult ki gyermekkorában. Felnõtt korában ehhez glomerulonephritis és nephrosis szindróma társult. Vesebiopsia membranoproliferatív glomerulonephritisnek felelt meg. Immunfluorescens vizsgálat PiZ alfa-1-antitripszint igazolt a glomerularis basement membrán subendotheliális régiójában. Transzplantációt követõen vesebetegsége gyógyult. A PiZ fehérje jelenléte felvetette ennek a fehérjének a pathológiai szerepét a vesebetegségben. Az IgA nephritis és AAT hiány közötti összefüggés sok vonatkozásban ismeretlen. Nincs adat a szérum AAT szint és IgA nephropáthia súlyossága közötti kapcsolatra. Ismeretlen továbbá, hogy az IgA nephritises 17

18 betegek AAT phenotípus megoszlása eltér-e a normális populációétól, illetve, hogy a fenotípus hogyan befolyásolja az IgA nephropathia progresszióját. 5. 1. Célkitûzések 5. 1. 1. Az AAT fenotípus magyarországi, egészséges populációra vonatkozó referenciaértékének megállapítása. Az AAT mutációk gyakoriságának értékelése egy betegség csoportban nem vizsgálható a variánsok gyakoriságának ismerete nélkül az adott normális populációban. Az AAT molekula különbözõ fenotípusai közül a leggyakoribb vad allél, a PiM (8, 16, 20, 36, 45, 51, 87, 92, 105). A mutációk döntõ többsége nem jár funkcionális eltéréssel. Európában az AAT allélok megoszlása egyenetlen és jellegzetes mintázatot mutat. Magyarországi, az AAT allélek gyakoriságát meghatározó, az egész országra kiterjedõ, az egészséges magyar lakosságot jól reprezentáló, nagy esetszámú felmérés még nem készült. A vizsgálat célja volt az AAT allél gyakoriság és az abból számított fenotípus gyakoriság meghatározása. 5. 1. 2. Csecsemõ és gyermekkori krónikus májbetegekben az AAT fenotípus elõfordulásának vizsgálata. Hazai kutatók évtizedekkel ezelõtt felhívták a figyelmet az AAT hiány és tüdõbetegségek összefüggésére (39, 40). Átfogó, nagy számú betegen történt vizsgálat csecsemõ és gyermekkori májbetegségek tekintetében Magyarországon nem történt. Munkámban arra kerestem választ: - Milyen arányban vannak jelen az AAT molekula M-tõl eltérõ variánsai a hazai májbeteg gyermekek körében? - A mutáns allél hordozása milyen típusú gyermekkori idült májbetegségekben lehet kóroki vagy társuló kóroki (komorbid) tényezõ? - Vannak-e specifikus tünetek a mutáns allélt hordozó májbeteg gyermekekben? 18

19 5. 1. 3. Az AAT fenotípus szerepének vizsgálata mucoviscidosishoz társuló májbetegségben. A fenotípusbeli különbözõség környezeti és/vagy genetikai tényezõ szerepét veti fel. Kevés tanulmány foglalkozott mutáns AAT jelenlét hatásával mucoviscidosisban kialakuló májkárosodással és annak mértékével. A vizsgálat célja volt: - Különbözõ mértékû májérintettségû mucoviscidosisban szenvedõ betegek AAT fenotípusának vizsgálata annak megállapítása céljából, hogy milyen szerepet játszik az AAT fenotípus a gyermekek májbetegségének kialakulásában és annak súlyosságában? - Van-e prognosztikai jelentõsége a beteg AAT fenotípusának májmegbetegedés vonatkozásában? 5. 1. 4. Az AAT fenotípus szerepének vizsgálata IgA nephropathiaban. Az IgA nephropathia viszonylag gyakori immunpatomechanizmusú kórkép. Az IgA nephropathia és AAT hiány közötti kapcsolat jellege ismeretlen. Nincs adat a szérum AAT szint és IgA nephropathia súlyossága közötti összefüggésre. Ismeretlen továbbá, hogy az IgA nephropathias betegek AAT fenotípus megoszlása eltér-e a normális populációétól? Vizsgálatunk célja volt: - Egy jól definiált nephropathia típusban szenvedõ betegpopulációban az AATvariánsok elõfordulási gyakoriságának megállapítása. 5. 1. 5. Az AAT fenotípus szerepe ritka kórképekben (esetismertetések) Az esetismertetések (PiMSZ fenotípus májátültetés után; AAT fenotípus kép szénhidráthiányos glikoprotein szindrómábanm; újszülöttkori agyvérzéssel, májbetegséggel, koraszülöttséggel járó ritka AAT variáns) az AAT hiány diagnosztikájának egy-egy érdekes aspektusát mutatják be. 19

20 5. 2. Betegek és módszerek 5. 2. 1. Betegek 5. 2. 1. 1. Egészséges, magyarországi populációban AAT fenotípus gyakoriságának megállapítása referencia érték céljából. A vizsgált minták 789 magyar állampolgártól származtak. Valamennyi esetben a meghatározás bírósági javaslatra, apaság eldöntése céljából készült. A vizsgálatból kizártuk a vérrokonoktól származó mintákat: egy ügy kapcsán több potenciális vérrokon közül csak egy személy adata került a vizsgálatba. Magyarországon az Igazságügyi Orvosszakértõi Intézet Származásmegállapítási Laboratóriuma az egyetlen, ilyen céllal, ilyen vizsgálatot végzõ laboratórium, ezért a vizsgált személyek az ország egész területérõl származtak. A fenotípus ismeretében számoltuk ki az allél frekvenciákat (100). 5. 2. 1. 2. AAT fenotípus gyakoriságának megállapítása céljából vizsgált csecsemõ és gyermekkori krónikus májbetegek. A vizsgálatba a Semmelweis Egyetem I. Sz. Gyermekklinikáján 1995. január 1. és 2001. december 31. között megjelent 238 idült májbeteg gyermeket vontuk be. A gyermekek életkora 1 nap és 19 év közötti volt az elsõ vizsgálat idején (101). A vizsgált betegek diagnózis szerinti megoszlását az 5. 2. 1. 2. 1. táblázat mutatja. 20

21 5. 2. 1. 2. 1. táblázat. A vizsgált betegek diagnózis és alfa 1-antitripszin fenotípus szerinti megoszlása Diagnózis Esetszám Pi MM eset PiZ eset Egyéb variáns Csecsemõkori hepatitis 58 45 ZZ 8, MZ 3 MS1, MF1 szindróma Biliaris atresia 25 21 - MS 2, MD 2 Öröklõdõ kórképek 39 36 MZ 1 MF1, MD 1 Immunológiai májbetegségek 25 22 MZ 3 - Nem-alkoholos zsírmáj 21 21 - - Congenitalis májfibrosis 14 14 - - Tünetmentes transzferáz 30 26 ZZ 1, MZ 2 MC 1 aktivitás fokozódás Egyéb 26 22 - MB 1, MS 1, ME 1, CDG 1 Összesen 238 207 ZZ 9, MZ 9 MS 4, MC 1, MF 2, MD 3, MB 1, ME 1, CDG 1 - Csecsemõkori hepatitis szindróma (n: 58) csoportba soroltuk azokat az élet elsõ hónapjaiban jelentkezõ kórképeket, melyek direkt reakciót adó hyperbilirubinaemiával, emelkedett szérum AST- és ALT-értékkel jártak és extrahepaticus epeút-obstrukció vagy öröklõdõ kórkép az elvégzett vizsgálatokkal kizárható volt. - Biliaris atresiásnak (n: 25) tartottuk azokat a Kasai-mûtéten átesett betegeket, akiknél a betegség késõbbi zajlása során sem kellett a diagnózist módosítani. - A májbetegséggel járó öröklõdõ betegség csoportban (n:39) szereplõ betegek diagnózis szerinti megoszlását a 5. 2. 1. 2. 2. táblázat tartalmazza. Kilenc betegnek mucoviscidosisa és hétnek Alagille-szindrómája volt. - Az immunológiai májbetegségek (n: 25) közé soroltuk az autóimmun hepatitis és cholangitis sclerotisans eseteket. 21

22 - Huszonegy gyermek tartozott a nem-alkoholos zsírmáj csoportba. A diagnózist valamennyi esetben egyéb kóroki tényezõk kizárása után szövettani vizsgálattal állítottuk fel. - Az ismeretlen eredetû szérum transzferáz emelkedés (n=30) csoportba soroltuk azokat a betegeket, kinek ismeretlen eredetû, tartós (3 hónapon túl), a normál érték felsõ határát meghaladó, de annak kétszeresét el nem érõ AST és/vagy ALT értéke volt májbetegség klinikai tünetei nélkül. - Az egyéb kórképek közé tartozott a criptogen cirrhosis (n= 8), krónikus hepatitis B és C fertõzés (n= 8), a gyógyszer (n= 6) okozta májkárosodás és a prehepatikus és postsinusoidalis portalis hypertensio (n= 4). 5. 2. 1. 2. 2. táblázat Öröklõdõ kórképek diagnózis és alfa 1-antitripszin fenotípus szerinti megoszlása Diagnózis Esetszám Pi MM eset Pi Z eset Egyéb variáns Mucoviscidosis 9 7 MZ1 MF 1 Wilson-betegség 7 6 - MD 1 Alagille-szindróma 7 7 - - Glikogenosis 7 7 - - PFIC * 3 3 - - Hyperammonaemia 2 2 - - Niemann-Pick betegség 3 3 - - Tyrosinaemia I. típus 1 1 - - Összesen 39 36 1 2 * progresszív familiaris intrahepaticus cholestasis 22

23 5. 2. 1. 3. AAT fenotípus gyakoriságának megállapítása céljából vizsgált mucoviscidosisban szenvedõ betegek. A vizsgálatban 38, mucoviscidosisban szenvedõ gyermek, 13 leány és 25 fiú vett részt. A gyermekeket 3 csoportba osztottuk: I. csoport: súlyos májbeteg (n= 8), II. csoport: enyhe májbeteg (n= 9), III. csoport: májbetegség nélkül (n= 21). Súlyos májbetegnek tartottuk azokat a gyerekeket, akiknél hepatomegalia mellett portalis hypertensio jeleit (splenomegalia ismételt vizsgálattal) találtuk. A gyermekek közötti leány:fiú arány 3:5 volt. Ezeket a gyermekeket 1996. január 1. és 2001. december 31. között, májátültetés indikációjának megállapítása illetve transzplantációs listára helyezés miatt küldték az I. sz. Gyermekklinika Hepatológiai ambulanciájára. Enyhe májbeteg csoportba soroltuk a kóros laboratóriumi (AST, ALT, gammagt, ALP) eredményû és/vagy hasi ultrahang vizsgálattal kóros szerkezetû májat mutató betegeket, portalis hypertensio jele nélkül. A harmadik csoportba azokat soroltuk, akiknél laboratóriumi vizsgálattal, képalkotó eljárással és fizikális vizsgálattal májbetegségre utaló eltérés nem volt igazolható. A vizsgálat idején a gyermekek átlag életkora mindhárom csoportban 12 év volt (102). A mucoviscidosisban szenvedõ, nem májbeteg gyermekeket a Heim Pál Kórház vagy az I. Sz. Gyermekklinika gondozta. 5. 2. 1. 4. AAT fenotípus gyakoriságának megállapítása céljából vizsgált IgA nephropathiaban szenvedõ betegek. A vizsgálatba 100 IgA nephropathiaban szenvedõ beteget (30 nõ és 70 férfi, átlag életkoruk a diagnózis felállítása idején SD 32.4? 11.2 év) vontunk be, akiknek nem volt súlyos májbetegségük (103). A vérvétel idejében minden fertõzést és gyulladást kizártunk. Valamennyi beteget a Pécsi Orvostudományi Egyetem II. Belgyógyászati Klinikája gondozta. A diagnózis valamennyi esetben vesebiopszia immunhisztokémiai vizsgálatán alapult. Májbetegsége 15 betegnek volt (15%): vírus hepatitis (3), autoimmun hepatitis (1), Crigler-Najjar szindróma (1), májhaemangioma (4), máj cysta 23

24 (1), Gilbert betegség (3), zsírmáj (1) és ismeretlen eredetû cirrhosis (1). Egy betegnek sem volt alkoholos májbetegsége. További 15 betegnek secunder IgA nephropathiaja volt. Olyan betegségeik voltak, melyeket összefüggésbe hoztak már AAT hiánnyal, mint ankylotizáló spondylitis (1) gyulladásos bélbetegség (2), episcleritis (3), psoriasis (2), rheumatoid arthritis (2), sialadenitis (2), vasculitis (1), Henoch-Schönlein purpura (1) and emphysema (1). A diagnózis idején májkárosodász jelzõ vizsgálatok (AST, ALT, GGT, ALP) megtörténtek. Szérum kreatinin vizsgálat szintén történt a diagnózis felállítása idején és a továbbiakban rendszeresen, ellenõrzések alkalmával. A clearencet Cockcroft-Gault formulával. (23) számítottuk ki. Veseelégtelenséget (ESRF) akkor állapítottunk meg, ha a számított creatinin clearance 15 ml/min-nél alacsonyabb volt vagy vesepótló kezelésre volt szükség (22). 5. 2. 1. 5. Az AAT-fenotípus szerepe ritka kórképekben (esetismertetések). 5. 2. 1. 5. 1. Biliaris atresia következtében kialakult cirrhosis hepatis miatt indikált kadaver transzplantáció. N.M. fiú, egészséges magyar szülõk, idõre született, normális születési súlyú elsõ gyermeke. Születést követõ elsõ héten direkt hyperbilirubinaemia alakult ki. Az elvégzett vizsgálatok biliaris atresiát igazoltak. Hat hetes korában Kasai mûtét történt, mely nem biztosított megfelelõ epeelfolyást. A kórkép progressziója következtében cirrhosis hepatis alakult ki, mely májátültetést tett szükségessé. A szülõk nem voltak alkalmasak donornak ezért kadaver szegment transzplantációt végeztek Hamburgban a gyermek 5 hónapos korában. 5. 2. 1. 5. 2. Májbetegséget okozó szénhidráthiányos glikoprotein szindróma K. Zs. egészséges magyar szülõk 2. gyermeke, zavartalan terhességbõl, 42. gestatiós hétre, 3200 g-mal született. Egy napos korában központi idegrendszeri tünetek jelentkeztek (opistotonus, fixáló tekintet). A csecsemõ hathetes korától neurológiai gondozás alatt állt, négy hónapos kora óta fejlesztõ tornára jár. Ettõl az idõtõl ismert szérum transzferáz aktivitás fokozódása és hepatomegaliája. Az elvégzett májbiopszia 24

25 zsírmájat igazolt, mely felvetette öröklõdõ anyagcsere-betegség lehetõségét. AAT izoelektromos fókuszálással végzett elektroforézis kóros, de atípusos képet mutatott (26). 5. 2. 1. 5. 3. Koraszülöttség, agyvérzés, májbetegség fatalis esete K. A. fiú eseménytelen, I/I. terhesség 33. hetében született sectio caesareaval 4/7/8 Apgar értékkel, oligohydramnionnal, intrauterin dystrophiával (1490 g születési súllyal). Születést követõen thrombopenia, többszörös agyvérzés alakult ki. Gépi lélegeztetést igényelt 13 órás korától. Élete harmadik napján direkt hyperbilirubinaemia alakult ki. Szérum transzferáz értékei születést követõen igen magasak voltak, majd csökkenni kezdtek. Vérzékenysége miatt friss fagyasztott plazma pótlásra szorult. Koponya CT vizsgálat többszörös felületi és állományi vérzést igazolt. Kéthetes korában enteritis necrotisans majd Gram negatív sepsis alakult ki. Direkt hyperbilirubinaemiája változatlan maradt, idegrendszeri tünetei fokozódtak. Hat hetes korában meghalt. 5. 2. 2. Módszerek 5. 2. 2. 1. Az AAT szérum koncentrációjának meghatározása A szérum AAT koncentrációját az ORION DIAGNOSTICA, ESPOO, FINLAND által gyártott kitekkel, immunprecipitáción alapuló, nephelometrias módszerrel határozzuk meg. A vizsgálatokat a Semmelweis Egyetem I. Sz. Gyermekklinika Központi Laboratóriumában, illetve Kutatólaboratóriumban végeztük. A mérési tartomány 0,3-3,5 g/l közötti. A gyártó által megadott egészséges referenciaérték 1,1-2,3 g/l közötti ; az ennél alacsonyabb koncentráció kórosan alacsony értéket jelent és felveti az AAT hiány gyanúját. A szérum AAT koncentrációja az életkorral nem változik számottevõen. 25

26 5. 2. 2. 2. Az AAT fenotípus meghatározása isoelektromos fókuszálással Az AAT fenotípust a Jeppson által leírt isoelektromos fókuszálással határoztuk meg a referenciaérték megállapításakor az Igazságügyi Orvosszakértõi Intézetben, egyéb esetekben pedig az I. Sz. Gyermekklinika Kutatólaboratóriumában történtek a mérések (30,54). A vizsgálat elve, hogy poliakrilamid gélen, megfelelõen kialakított ph gradiensen a proteinek vagy származékaik isolektromos pontjuk szerint szeparálhatók. A módszer kivitelezése a Pharmacia LKB által gyártott Phast System automatikus, programozható elektroforézis készüléken történt (49). A Pharmacia dehidrált poliakrilamid lemezeit Pharmalit (ph 4,2-4,9) adalékkal való rehidrálás után, nagy egyenfeszültséggel való elõkészítést követõen használtuk szeparációs közegként. Az elválasztás, a festés, a festéktelenítés programozható zárt rendszerben történt. A mintafeldolgozást, vizsgálatokat ugyanaz a személy végezte és értékelte. A minták, illetve a sávok azonosítása részben vizuális összehasonlítással történt heterozigóta kontrollok mellett. Kontrollként az Igazságügyi Orvosszakértõi Intézet Származásmegállapítási Laboratóriumából (Budapest) és Norvégiából (Department of Immunology and Transfusion Medicine, Ullevaal University Hospital, Oslo) kapott standard szérum szolgált. Az 5. 3. 2. 2. 1. ábrán a homozigóta vad allél PiMM, homozigóta PiZZ, heterozigóta PiMZ és PiMO alfa-1-antitripszin elektroforetikus képe látható. 26

27 5. 2. 2. 2. 1. ábra A homozigóta vad allél PiMM, homozigóta PiZZ, heterozigóta PiMZ és PiMO alfa-1-antitripszin elektroforetikus képe. A PiMM kép a legintezívebb, mert ebben a mintában a legnagyobb a szérum AAT koncentráció. MM ZZ MZ M0 27

28 5. 2. 2. 3. A PiS és PiZ allél meghatározása molekuláris genetikai módszerrel Az M, Z, S mutáció kimutatható molekuláis genetikiai módszerrel (1, 33, 69). Az elsõ lépés multiplex PCR reakcióval a Z és az S regió felszaporítása. Ezt követi a PCR termékek emésztése és restrikciós fragment analízise (TAQ I.). Egy csõben, izotóp és egyéb jelzõanyag nélkül a 3 fõ allél (M, S, Z) paralell és gyors kimutatható. 5. 2. 2. 3. 1. ábra AAT genotípus meghatározás. A vörös pontok és jelzések a TaqIemésztés elõtti, a sárga pontok a Taq1-emésztés utáni PCR terméket mutatják. 300 MZ MM MZ MZ MZ MM MS ZZ 200 100 176 157 121 100 Valamennyi PiZZ homozigóta és PiMZ heterozigóta gyermek esetében elvégeztük a mutáció igazolást. A vizsgálat elvégezhetõ szárított vérmintából is. 28

29 5. 2. 2. 4. AAT kimutatás vesében immunhisztokémiai módszerrel A vesében levõ AAT-t a mindennapi pathológiai gyakorlatban használatos immunhisztokémiai (Tako AT polyclonalis A012 antitest) módszerrel mutattuk ki, 12 AAT-variáns hordozó, illetve 12 MM fenotípusú IgA nefropátiás beteg vese szövettani mintájában. 5. 3. Eredmények 5. 3. 1. AAT fenotípus gyakorisága egészséges, magyarországi populációban A talált Pi allélok és azok gyakoriságát a 5. 3. 1. 1. táblázat tartalmazza. Az egyes fenotípusokat és azok gyakoriságát az 5. 3. 1. 2. táblázat mutatja be. 5. 3. 1. 1. táblázat A vizsgálat során igazolt AAT allélok száma és gyakorisága AAT allél Allélok száma Allélok gyakorisága (%) M 1534 97,21 Z 15 0,95 S 26 1,65 F 2 0,13 N 1 0,06 Összes 1578 100 29

30 5. 3. 1. 2. táblázat A vizsgálat során igazolt AAT fenotípusok száma és gyakorisága AAT fenotípus Fenotípusok száma Fenotípusok gyakorisága (%) MM 748 94,8 MZ 13 1,65 ZZ 0 0 MS 22 2,79 SZ 2 0,25 SS 1 0,13 MF 2 0,25 MN 1 0,13 Összes 789 100 Az allél-gyakoriságok alapján a PiZZ homozigóta elõfordulása 1:10526, azaz a jelenlegi kevesebb mint 100.000/éves születésszám mellett évente 9 PiZZ homozigóta születése várható. A PiSS homozigóta várható elõfordulása 1:6060, így évente 15 PiSS homozigóta születése várható. 5. 3. 2. AAT fenotípus gyakorisága magyarországi csecsemõ és gyermekkori krónikus májbetegekben A 238 vizsgált gyermekbõl 207 vad allél hordozó, 9 PiZZ homozigóta és 9 PiMZ heterozigóta volt. A 5. 4. 2. 2. táblázat az öröklõdõ kórképek diagnózis és AAT fenotípus szerinti megoszlását tünteti fel. A vizsgálatban súlyos májérintettségû mucoviscidosisban szenvedõ gyermekek szerepelnek. A kilenc gyermek közül hétnek jelentõs portalis hypertensiója volt. A hét Alagille-szindrómában szenvedõ gyermek közül kettõnél Kasai mûtét történt, de egyik esetben a genetikai vizsgálat, másik esetben a kórkép további alakulása egyértelmûen bizonyította az Alagille-szindrómát. A vizsgált betegek diagnózis és AAT variáns szerinti megoszlását a 5. 3. 2. 1. táblázat mutatja. 30

31 5. 3. 2. 1. táblázat A vizsgált betegek diagnózis és AAT fenotípus szerinti megoszlása Diagnózis Esetszám Pi MM PiZ száma Egyéb variáns száma Csecsemõkori hepatitis 58 45 ZZ 8, MZ 3 MS1, MF1. szindróma Biliaris atresia 25 21 - MS 2, MD 2 Öröklõdõ kórképek 39 36 MZ 1 MD 1, MF 1 Immunológiai 25 22 MZ 3 - májbetegségek Nem-alkoholos 21 21 - - steatohepatitis Congenitalis 14 14 - - májfibrosis Transzferáz emelkedés 30 26 ZZ 1, MZ 2 MC 1 Egyéb 26 22 MB 1, MS 1, LE 1, CDG 1 Összesen 238 207 ZZ 9, MZ 9 MS 4, MC 1, MF 2, MD 3, MB 1, LE 1, CDG 1 31

32 5. 3. 2. 2. táblázat Öröklõdõ kórképek diagnózis és AAT fenotípusa szerinti megoszlása Diagnózis Esetszám AAT PiMM fenotípus AAT variáns fenotípus Mucoviscidosis 9 7 MZ 1, MF 1, Wilson betegség 7 6 MD 1 Alagille-szindróma 7 7 Glikogenosis 7 7 PFIC 1 3 3 Hyperammonaemia 2 2 Niemann-Pick betegség 3 3 Tyrosinaemia I. 1 1 típus Összesen 39 36 MD 1, MZ 1, MF 1 1 Progresszív familiaris intrahepaticus cholestasis A májbeteg gyermekek és kontrollok AAT allél gyakoriságát a 5. 3. 2. 3. táblázat mutatja. Az M allél gyakorisága a betegpopulációban kisebb volt a kontrollhoz viszonyítva (91,77% vs. 97,21%, p<0,05), a Z allél gyakorisága viszont hatszorosa a kontrollénak (5,6% vs. 0,9%, p<0,05). Az S allél gyakorisága a betegcsoportban kisebb volt a kontrollértékhez viszonyítva (0,84% vs. 1,65%). A betegek között egy-egy esetben igazoltunk B, C, D, E és F mutáns allélt. Ezek a variánsok a kontrollcsoportban nem voltak jelen. A vizsgált betegek között egy esetben atípusos fentotípust találtunk. További vizsgálatok a glycosylatio veleszületett zavarát igazolták. A májbeteg gyermekek és az egészségesek AAT fenotípus gyakoriságát és szérumkoncentrációját az 5. 3. 2. 4. táblázat tartalmazza. A májbetegek között a PiMM fenotípus gyakorisága kisebb, a PiZZ és a PiMZ fenotípus gyakorisága nagyobb volt, mint a kontrollokban. A PiMS fenotípus aránya alacsonyabb (1,69% vs. 2,79%) volt a kontrollokhoz viszonyítva. A betegek között PiSZ és PiSS fenotípust nem találtunk. A különbözõ fenotípusoknál mért átlagos, minimális és maximális szérum AAT szinteket tekintve a legmagasabb átlagszint a PiMM, a legalacsonyabb a PiZZ homozigótáknál volt. 32

33 5. 3. 2. 3. táblázat. Májbeteg gyermekek és kontrollok AAT allél gyakorisága Allél Májbetegek Kontrollok Különbség allélgyakorisága (%) allélgyakorisága (%) M típus 91,77 97,21 p<0,05 Z típus 5,60 0,95 p<0,05 S típus 0,84 1,65 - F típus 0,42 0,13 - Egyéb 1,27 0,06 Összesen 100,00 100.00-5. 3. 2. 4. táblázat. A májbeteg gyermekek és az egészségesek AAT fenotípus gyakorisága és szérumkoncentrációja Fenotípusok Egészséges referenciaérték (%) Betegek fenotípus gyakorisága (%) szérum AAT medián (min-max) értéke g/l PiMM 94,80 87,34 1,5 (0,71-3,20) PiZZ - 3,80 0,35 (0,19-0,66) PiMZ 1,65 3,80 0,90 (0,25-1,50) PiMS 2,79 1,69 1,00 (0,80-1,50) PiZS 0,25 - - PiSS 0,13 - - PiMF 0,25 0,84 1,25 PiMN 0,13 - - PiMD - 1,27 1,4 PiMC - 0,42 1,77 PiLE - 0,42 1,84 PiMB - 0,42 0,9 Összesen 100.00 100.00 - Az 5. 3. 2. 5. táblázat az AAT variánsainak diagnózis szerinti megoszlását ismerteti. 33

34 5. 3. 2. 5. táblázat. Az AAT variánsok diagnózis szerinti megoszlása AAT CsHSz 1 Emelkedett Öröklõdõ BA 3 Immunol. 2 Egyéb Összesen fenotípus transzferáz kórkép PiZZ 8 1 - - - - 9 PiMZ 3 2 1-3 - 9 PiMS 1 - - 2-1 4 PiMD - - 1 2 - - 3 PiMF 1-1 - - - 2 Pi MC - 1 - - - - 1 Pi LE - - - - - 1 1 Pi MB - - - - - 1 1 CDG - - - - - 1 1 Összesen 13 4 3 4 3 4 31 1 csecsemõkori hepatitis szindróma, 2 immunológiai betegségek, mint autoimmun hepatitis és cholangitis sclerotizáns, 3 biliaris atresia. A vizsgált betegek között 9 volt PiZZ homozigóta (3,8%), míg a kontroll csoportban egy sem. A homozigóták közül 1 lány volt és 8 fiú. A kilenc gyermek nyolc családból származott, a gyermekek kórtörténetébõl az alábbiakat emeljük ki:? Két csecsemõnél a klinikai kép nagyon hasonlított biliaris atresiára, de az intraoperatív cholangiográfia átjárható, szûk, extrahepaticus epeutakat igazolt, ezért Kasai mûtétre nem került sor. Egyikük 5 hónapos korban cirrhosis hepatis szövõdményeiben meghalt. A másik, a vizsgálat idején 6 éves gyermeknek cirrhosisa alakult ki, portalis hypertensio jeleivel.? A további hat PiZZ homozigóta gyermek állapota csecsemõkorban rendezõdött és krónikus májbetegség nem alakult ki. Ide tartozott az egyetlen, PiZZ fenotípusú leány is, akinek enyhe tünetekkel járó csecsemõkori hepatitis szindrómája volt.? Egy hároméves fiúnál a diagnózist az emelkedett szérum AST és ALT aktivitásának kivizsgálása során állítottuk fel. A gyermeknek krónikus 34

35 májbetegségre utaló tünetei nem voltak. Szérumtranszferáz értékei idõnként meghaladták a normálérték felsõ határát. A PiZZ homozigóta gyermekek közül a klinikai tünetek alapján 8 a csecsemõkori hepatitis szindróma csoportba, míg egy az emelkedett transzferáz csoportba tartozott. A kilenc gyermek közül egy meghalt, egynek cirrhosisa alakult ki, hétnek nincs krónikus májbetegségre utaló klinikai tünete. Részletes kivizsgálással egyéb, májbetegséget okozó kórokot nem találtunk, ezért ezeknek a gyermekeknek a diagnózisa AAT hiány volt. A 9 homozigóta gyermek születési éve különbözõ volt. A PiMZ heterozigóta állapot elõfordulási gyakorisága a kontroll populációban 1,6% volt, míg a májbeteg gyermekek között 5,6 % (szignifikáns eltérés). A kilenc PiMZ heterozigóta gyermek négy betegségcsoportba volt sorolható: három esetben CsHSz, három esetben immunológiai mechanizmusú májbetegség, két esetben emelkedett transferáz klinikai tünetek nélkül és egy esetben mucoviscidosis. A kilenc gyermek kórtörténetõbõl kiemelést érdemel:? Három csecsemõ csecsemõkori hepatitis szindrómában szenvedett (egy lány, két fiú). Közülük kettõ (mindkettõ fiú), meghalt csecsemõkorában. Az egyiknél neonatalis haemochromatosis volt igazolható, a másik csecsemõ haláloka ismeretlen maradt. A harmadik csecsemõ icterusa egyéves korára oldódott, laboratóriumi értékei normalizálódtak, tünet és panaszmentessé vált és maradt.? Három gyermeknél immunpatomechanizmusú betegséget igazoltunk: kettõnél I. típusú autoimmun hepatitist, egynél cholangitis sclerotisanst colitis ulcerosaval. Annak ellenére, hogy az autoimmun hepatitis megjelenése lányokban gyakoribb, mindkét PiMZ betegünk fiú.? Két lány esetében a PiMZ heterozigóta állapot a szérumtranszferáz ismeretlen eredetû emelkedése okának kivizsgálása során derült ki. A lányoknak egyéb, májbetegségre utaló laboratóriumi eredménye vagy fizikális eltérése nem volt.? Egy gyermeknek mucoviscidosisa volt, enyhe májérintettséggel. Portalis hypertensióra vagy májparenchyma károsodásra utaló jelek nem voltak. Összességében a 9 PiMZ fenotípusú gyermek közül kettõ meghalt, kettõ tünetmentesen gyógyult, ötnél a heterozigóta állapot ismert aetiológiájú kórképhez társult. 35

36 Az S allél gyakorisága kisebb volt a kontroll populációban talált gyakorisághoz viszonyítva (0,84% v. 1,65%): csak 4 PiMS heterozigóta volt. A négy beteg közül kettõnek volt biliaris atresiája. Mindkét beteg sikeres Kasai mûtét után tünet és panaszmentes lett és maradt. Egy gyermeknek csecsemõkori hepatitis szindrómája volt, laboratóriumi leletei egyéves korára normalizálódtak és májbetegségre utaló fizikális eltérés nem volt igazolható. A 4. gyermek alapbetegsége krónikus hepatitis B fertõzés volt. Összességében a 4 PiMS fenotípusú gyermek közül valamennyi él. Három esetben a heterozigóta állapot ismert aetiológiájú kórképhez társult (biliaris atresia 2, hepatitis B 1), egy esetben az ok ismeretlen maradt. A vizsgált májbetegek közül további nyolcnak 5 különbözõ (PiMF, PiMD, PiMB, PiMC, PiLE), ritka variánst tartalmazó fenotípust találtunk. A nyolc gyermek közül kettõ biliaris atresia (PiMD), egy Wilson-kór (PiMD), egy csecsemõkori hepatitis szindróma (PiMF), egy mucoviscidosis (PiMF), egy tünetmentes transzferáz emelkedés (PiMC), egy agyvérzés és májbetegség (PiLE), egy gyógyszer toxicitás malignus tumorban szenvedõ gyermeknél (PiMB). Atípusos, egyértelmûen nem azonosítható elektroforézis képet egy esetben láttunk. A további vizsgálatok a glycolysatio zavarát igazolták. A glycosylatio zavara következtében kóros szénhidrát oldallánc alakul ki, ezért ezeknek a kóros molekuláknak az elektroforetikus képe eltérhet a variáns AAT molekulák képétõl. 5. 3. 3. AAT fenotípus gyakorisága magyarországi, mucoviscidosisban szenvedõ betegekben. A 5. 3. 3. 1. táblázat a vizsgált betegek AAT fenotípusát mutatja. A vizsgált 38 beteg közül 35 PiMM, 1 PiMZ és 2 PiMF fenotípusú volt. A betegek között PiZZ fenotípust és PiS allélt hordozót nem találtunk. Az 5. 4. 3. 2. táblázat a mucoviscidosisban szenvedõ betegek és a kontroll populáció Pi allél gyakoriságát mutatja. A PiMM és PiMZ fenotípus gyakorisága megfelel a kontroll populáció gyakoriságának. A PiF allél a mucoviscidosisban szenvedõk között gyakoribb volt. 36

37 5. 3. 3. 1. táblázat. A mucoviscidosisban szenvedõ betegek májérintettségének mértéke és AAT fenotípusa AAT Súlyos májbeteg Enyhe májbeteg Májbetegség nélkül Összesen fenotípus PiMM 7 8 20 35 PiMZ - 1-1 PiMF 1-1 2 Összesen 8 9 21 38 5. 3. 3. 2. táblázat. A mucoviscidosisban szenvedõ betegek és a kontroll populáció Pi allél gyakorisága AAT variáns Kontroll Mucoviscidosis M 0,97212 0,9595 Z 0,00950 0,0135 S 0,01648 - F 0,00127 0,0270 Variáns 0,00063 - A nyolc súlyos májbeteg közül egy PiMF és hét PiMM fenotípusú volt. A súlyos májbetegségû csoportba tartozó nyolc gyermek közül hat halt meg a vizsgálat befejezése idejéig. Az egyetlen mutációt (PiMF) hordozó beteg 15 éves korában halt meg. A halál közvetlen oka tüdõgyulladás volt. Három gyermek halálát gastrointestinalis vérzés okozta. Egy gyermek pumonális és egy további gyermek központi idegrendszeri gyulladás miatt exitált. A súlyos májbetegek között egy testvérpár volt. Az idõsebb fiútestvér központi idegrendszeri gyulladásban meghalt. Húga májbetegsége kompenzált. A hat gyermek közül összesen három volt májátültetési várólistán. A súlyos májbeteg csoportból két gyermek él, az egyik májátültetési várólistán, a másik általános állapota kielégítõ, gastrointestinalis vérzése még nem jelentkezett. A kilenc enyhe májbeteg közül 1 PiMZ és 8 PiMM fenotípusú volt. Az enyhe májbetegségû gyermekek között a PiMZ fenotípusú gyermek a vizsgálat idején 12 éves 37

38 volt és a normál érték felsõ határát alig meghaladó szérum transzferáz emelkedésen kívül egyéb májbetegségre utaló eltérés nem volt igazolható. A 21 májbetegség nélküli mucoviscidosisban szenvedõ gyermek közül egy PiMF és húsz PiMM fenotípusú volt. Az MF fenotípusú gyermeknek májbetegségre utaló jele nem volt és 15 éves korában exitált légúti fertõzés miatt. 5. 3. 4. AAT fenotípus gyakorisága magyarországi, IgA nephropathiaban szenvedõ betegekben. A száz beteg Pi megoszlását az 5. 3. 4. 1. táblázat ismerteti, összehasonlítva a kontrollok értékeivel. Normális, PiMM fenotípust igazoltunk 88 beteg esetében. PiMZ heterozigóta 5, PiMS heterozigóta 3, PiML ketto és egy-egy PiMF és PiME fenotípus volt kimutatható. Az eredmények azt mutatják, hogy az M allél frekvenciája alacsonyabb, míg a Z allél frekvenciája magasabb a nephritises betegek között a normális populáció megoszlásához viszonyítva. PiZZ homozygotát nem találtunk a vizsgálat során A nagyon ritka allélek elofordulása gyakoribb a nephritises betegek között, mint az egészséges populációban. Az AAT szérum szintje a PiZ heterozygóták csoportjában alacsonyabb volt. Az értékek szórása kicsi. 5. 3. 4. 1. táblázat. IgA nephropathias betegek és kontrollok AAT allél gyakorisága. IgA nephropathiaban szenvedõ betegek (n=100) Egészséges kontrollok (n=789) MM 88.0% 94.8% MZ 5.0% 1.6% ZZ - - MS 3.0% 2.8% SZ - 0.25% SS - 0.12% MF 1.0% 0.25% MN - 0.13% ML 2.0% - ME 1.0% - 38

39 A normális PiMM fenotípustól eltérõ 12 beteg közül négynek volt májbetegsége. Ketten PiZ, míg egy.-egy beteg ML és ME heterozigóta volt. A PiMM és a PiM heterozigóta betegek klinikai jellemzõit az 5. 4. 4. 2. táblázat tartalmazza. Míg az M, Z, S és F allél gyakorisága megfelel az egészséges magyar populáció gyakoriságának, L és E allél nem volt a kontroll populációban (100). A PiM allélre heterozigóta betegek között szignifikánsan gyakoribb volt a szekunder IgA nephropathia, mint a primer IgA nephropathia ((5/15 vs. 7/85; p<0,02). A PiMM betegek szérum AAT koncentrációja normális volt. A heterozigóta betegek szérum AAT koncentrációja alacsonyabb volt a homozigotákéhoz viszonyítva (1.17?0.46 vs. 1.44?0.34 g/l, p<0.05). Az 5 PiMZ heterozigóta közül 4-nek, a 3 PiMS beteg közül kettõnek a normális értéknél alacsonyabb volt a szérum ATT koncentrációja. 5. 3. 4. 2. táblázat. IgA nephropathiában szenvedõ betegek klinikai jellemzõi különbözõ AAT fenotípus alapján. PiMM homozigóta PiM allélre heterozigóta betegek betegek Betegek száma 88 12 Átlag életkor a diagnózis idején [min max] 30.7 [14-58] 32.8 [16-56] Primer IgA Secunder IgA 78 10 7 5* nephropathia nephropathia Átlagos követési idõ (hónap) 142.8 [1-431] 144.6 [2-284] átlag [min max] Veseelégtelenség (n) 6 3 Májbetegség (n) 11 4 Szérum AAT(g/L) (átlag?sd) 1.44?0.34 1.17?0.46 ** * p=0.02 a primer és secunder IgA nephropathiaban szenvedõ betegek között, **p<0.05 és + p=0.07 homozigóta és heterozigóta betegek között. 39

40 Az IgA nephropathia diagnózisának felállítása idején a homozigóta és heterozigóta betegek máj és vesefunkciója között nem volt különbség. Az átlagos 150 hónapos megfigyelési idõ alatt a 12 heterozigóta közül 3-nak, a 88 homozigóta közül 6-nak alakult ki veseelégtelensége (p=0,07). A három beteg fenotípusa a MF, ML és MZ volt. Immunhisztokémiai módszerrel AAT-t igazoltunk a 12 heterozigóta közül két esetben, míg a homozigoták közül véletlenül kiválasztott 12 beteg közül egyben. 5. 3. 5. Különleges AAT fenotípusok különbözõ kórképekben 5. 3. 5. 1. AAT fenotípus megváltozása biliaris atresia következtében kialakult cirrhosis hepatis miatt indikált kadaver májátültetés után. N.M. biliaris atresia miatt Kasai mûtéten esett át. A mûtét sikertelensége miatt cirrhosis alakult ki és májátültetésre volt szükség. A gyermek mûtét elõtti AAT fenotípusa PiMS volt. A mûtétet követõen az elektroforetikus képen az MS mellett megjelent egy Z csík is. Ilyen elektroforetikus kép csak májátültetés után jelenhet meg abban az esetben, ha a donor és recipiens legalább három különbözõ Pi allélt hordoz. A beteg májátültetés utáni szérum AAT koncentrációja 0,96 g/l volt. A transzplantációt követõ 7. évben a gyermek korának megfelelõen fejlõdik. Nincs májbetegségre utaló jel. 40

41 5. 3. 5. 1. 1. ábra N.M. AAT elektroforetikus vizsgálat eredménye májátültetés elõtt és után. Feltételezett donor AAT Kontroll AAT Transzplantáció utáni AAT Recipiens AAT (mûtét elõtt) M MSZ MZ MS 5. 3. 5. 2. Atípusos AAT fenotípussal járó szénhidráthiányos glikoprotein szindróma Atípusos AAT elektroforetikus kép volt igazolható. Nem volt beilleszthetõ egyik eddig ismert variánshoz sem. A beteg szérum AAT szintje 1,09 g/l volt. A 5. 3. 5. 2. 1. ábra az atípusos AAT elektorforetikus képét és mellette a kontroll mintákat mutatja. Jól látszik, hogy a CDG minta legalsó csíkja a Z csík alatt helyezkedik el. 41

42 5. 3. 5. 2. 1. ábra Az atípusos AAT elektorforetikus képe. MM MM MM*CDG MZ MM 5. 3. 5. 3. Újszülöttkori, fatalis, sokszervi elégtelenséget okozó ritka AAT variáns. A klinikai kép alapján (agyvérzés, direkt hyperbilirubinaemia, halmozott rizikótényezõ) felmerült AAT hiány alapos gyanúja. A beteg szérum AAT szintje normális (1,84 g/l) volt, fenotípusa PiLE volt. A vizsgálatot elvégezte Norvég referencia központ is, és azonos eredményt kapott. 42

43 5. 4. Megbeszélés 5. 4. 1. Az AAT fenotípus hazai gyakorisága megfelel a heterogen európai megoszlásnak A legtöbb magyar felmérés célja az AAT szintek egészséges referencia-értékének meghatározása volt: fenotípusra csupán a mért értékek alapján következtettek. Kiss 364 egészséges ember közül 2,8%-ban talált PiMZ heterozigóta állapotnak megfelelõ 60% alatti AAT-szintet (57). Baranyai 184 köldökzsinórvér vizsgálatakor nem talált PiZZ fenotípusra utaló nagyon alacsony szérum AAT szintet, viszont a minták 7%-ban mért PiMZ-re utaló alacsony AAT szintet (3). Az Orvosi Hetilapban megjelent reflexiójában Endre - külföldi lapok alapján - még magasabb elõfordulási arányt feltételezett: egy tömegszûrés szükségességének kérdése is felvetõdött (41). Az AAT szintek alapján becsült PiZ allél-gyakoriság többszöröse az általunk talált 0,9%-nak. Az eltérés oka feltehetõen az, hogy az AAT szint intraindividuálisan is ingadozik, ezért az aktuális szint csupán tájékoztató jellegû és a fenotípusra pontatlanul lehet következtetni. Hazánkban nagy esetszámú Pi fenotípus-vizsgálat egy ötéves magyar-német akadémiai együttmûködés keretében történt. Felmérésükbe 10 magyar etnikum 12 populációjából 1333 embert vontak be. Egy esetben találtak PiZZ fenotípust. A PiMZ gyakorisága 3,7% volt. A PiM allél gyakoriságát 97,9%-nak, a Z allél-ét 0,6%-nak, míg az S allél-ét 1,4 %-nak találták (7, 24, 25). A PiZ és S allél gyakorisága alig különbözött a két vizsgálatban, míg a Z allél gyakorisága saját vizsgálatunkban magasabb (0,95 %) volt. Ez a felmérés azonban számos hiányossággal rendelkezett: szelektált populációkkal dolgozott, melyek állítólag jól definiálható etnikumok voltak a magyar történelem ismerete alapján azonban a szerzõk is rámutatnak, hogy a Kárpátmedencében a genetikailag egységes etnikumok (pl. a jászok és a kunok) elkülönítése erõsen megkérdõjelezhetõ. Munkánkban Magyarországon elsõként olyan nagy esetszámú mintán vizsgáltuk az AAT allél frekvenciát, ami jól reprezentálja a magyar népességet. Mivel az Igazságügyi Orvosszakértõi Intézet Származásmegállapítási Laboratóriuma országos központ és az országban egyedülálló módon végzik az AAT-fenotípus meghatározást apasági vizsgálat részeként, a vizsgált egyének az ország minden részérõl származtak: 43

44 foglalkozásuk, lakóhelyük és etnikumuk jól reprezentálja a hazai viszonyokat. Eredményeink tehát a magyar AAT-allél-fenotípusok elõfordulási gyakoriságát jól tükrözik. Nemzetközi összehasonlítás tekintetében saját értékeink jól illeszkednek a Hutchinson által leírt trendekhez. A Z allél gyakorisága Európában északról dél felé, az S allélé az Ibériai félszigettõl kelet felé csökken (53). Ennek oka feltételezhetõen a mutációk kialakulásának helye. A 0,95%-os Z allél-gyakoriság alapján Magyarország Európában a PiZ allél frekvencia tekintetében a középsõ (0,5-1,5%-os PiZ gyakoriság) az 1,65%-os PiS allél frekvencia tekintetében az alsó (1,0-2,0%-os PiS allél frekvencia) sávban helyezkedik el. A szomszédos országok PiZ és PiS allél frekvenciája különbözik a magyarországi értékektõl, attól függõen, hogy melyik égtáj felé fekszik (34). Ausztriában (Tirol) mind a PiS (2,25%), mind a PiZ (1,38%) allél frekvenciája magasabb (10). Köldökzsinórvérbõl 741 lengyel újszülött vizsgálatával a PiS allél frekvencia 0,94%, a PiZ 0,67%-nak bizonyult, melyek alacsonyabbak vizsgálatunk értékeinél (61). A moszkvai arányok PiS (0,62 %), PiZ (0,48%) tekintetében jelentõsen alacsonyabbak a magyarországi értékeknél (94). 44

45 5. 4. 1. 1. ábra A Pi allélok európai megoszlása (53). A ábra A PiS allél európai megoszlása. PiS allél magyarországi gyakorisága: 0,016 B ábra A PiZ allél európai megoszlása. PiZ allél magyarországi gyakorisága: 0,0095 Eredményeinket összefoglalva megállapítottuk: nagyszámú, az ország egész területét lefedõ vizsgálatunk azt mutatta, hogy az AAT hiány legsúlyosabb formáját elõidézõ PiZ allél elõfordulási gyakorisága hazánkban 0,95%, míg a kisebb fokú funkcionális eltéréseket okozó PiS allélé 1,65%. Ezek az eredmények hiánypótlóak. Európai viszonylatban a PiZ allél elõfordulási gyakorisága átlagos, a PiS allélé pedig alacsony. 5. 4. 2. AAT fenotípus variánsai fontos szerepet játszanak a magyarországi csecsemõ és gyermekkori krónikus májbetegekben A hazai szakirodalomban számos, az AAT klinikai jelentõségével kapcsolatos közlemény jelent meg (3, 41, 58, 59). Ilyen nagy esetszámú (238), krónikus 45