Kiselőadás! Hoga sámolja ki eg foto eergiáját és impulusát? Fluorescecia polariáció, aiotrópia FRAP Mile függvé serit csökke a fé iteitása optikailag homogé köegbe? Mi a absorpció defiíciója? Mi a külöbség fluorescecia és fosforescecia köött? Mia külöbség a gerjestési és a absoprciós spektrum köött? Mi a kvatumhatásfok?..4. Elektromágeses hullámok Polariált fé, polariáció Polariáció fogalma A elektromágeses sugárás elektromos (és mágeses) térerősségéek vektora meghatároott görbe meté moog (térbeli iráultság!). Polariáció Lieáris polariáció: adott pot regéséek orietációja eg egeesbe esik Cirkuláris polariáció: adott pot regéséek iráa egeletese körbejár Ha a görbe egees: lieáris v. sík polariáció Ha a görbe kör: cirkuláris polariáció Megjeleés fotóáskor! (Ha a görbe elipsis: elliptikus polariáció) A polariálatla fébe a polariációs síkok keveredek. Miért va ile hatása? A polariált fébe a polariációs síkok össhagba vaak (aoosak).
Polariált fé Síkba polariált fé A polariátor Polariátor elve Defiíció: A polariátor eg ola eskö mel képes a polariálatla elektromágeses sugárást (fé) ola sugárássá alakítai, melbe csak egféle polariációs sík va jele. I I cos ma Θ Korábbi ismereteik: pl. optikai aktivitás Optikai aktivitás: poláros fé sikját elforgatják Hol találkotuk már polariátorral? Féforrás lc t α α λ Polariátor Mitatartó Aaliátor királis molekulák em kell gerjestei! Megfigelő Polariméter
Polariáció, iteitások Teljes vissaverődés Iteitás eg adott irába: ΙΙ cos ma Θ Polariátor Párhuamos állás: Θ, I I ma Merőleges állás: Θ 9, I Mila Zikova: Mita (ví) Tárgleme (üveg) Teljes belső vissaverődés mikroskópia (TIRF) A fé absorpciója Fotoselekció M A absorpciós vektor θ A Nics absorpció (θ 9 o ) E gerjestés Maimális absorpció (θ o ) θ A Absorpció ~ cos θ A (ma) absorpciós vektor: megsabja a foto absorpciójáak valósíűségét. A fotoselekció eredmée Fluorescecia emissió M E emissiós vektor M E ~ Iteitás E r gerjestés E I X I Z θ E I Y Detektor I Z I V I sum I Z + I X + I Y I I H I sum I V + I H + I H I Y I H I sum I Z + I H emissiós vektor: megsabja a foto emissiójáak valósíűségét. 3
Fluorescecia polariáció Fluorescecia polariáció p (I VV -GI VH ) / (I VV + GI VH ) dimeió élküli G I HV / I HH em függ a fluorofór kocetrációjától a fluorofór rotációs diffúiós mogása befolásolja em additív!!! értéke -tól -ig váltohat Emissiós aiotrópia Emissiós aiotrópia r (I VV -GI VH ) / (I VV + GI VH ) dimeió élküli G I HV / I HH em függ a fluorofór kocetrációjától a fluorofór rotációs diffúiós mogása befolásolja additív!!! értéke -tól -ig váltohat Fluorescecia emissió A aiotrópia jeletése és alkalmaásai Polariált fé I Z θ E τ I Z θ E I Y I Y I X I X Résbe polariált fé Rotációs diffúió 4
Határérték aiotrópia (r ) Fracis Perri - 96 A teljes modulatla, fagott fluorofór aiotrópiája. 3cos β r 5 β: a absorpciós és emissiós vektor által beárt sög. β r.4 45. 54.7 9 -. Absorpciós vektor β Emissiós vektor ROTÁCIÓS DIFFÚZIÓ flurescecia depolariáció Perri egelet: határérték aiotrópia r r r τ + + 6Dτ Θ Rotációs korrelációs idő ηv Θ RT diffúiós álladó Perri egelet A aiotrópia időfüggése r r r τ + + 6Dτ Θ r ~ r /τ Θ /D r I(t) I ep -t/τ r( t) r ai ep( t / θ ) t Mire emléketet a időfüggés? Alkalmaások Serkeeti tulajdoságok visgálata Fehérje deaturáció omokövetése Protei-ligad kölcsöhatás visgálata Serkeet visgálata a köreeti paraméterek (ph, iook) váltoásáak függvéébe Példa alkalmaásra Diamikus tulajdoságok visgálata Membráho kötött fluorofórok aiotrópiája iformálhat a membrá belsejébe lévő viskoitásról Fehérjékhe kötött fluorofórok aiotrópiája iformálhat a fehérjemátri fleibilitásáról 5
De ovo polmerisatio of acti A formiok domé serkeete Acti moomer Acti filamet GBD FH3 FH FH DAD Depolmerisatio Mammalia Diaphaous-related formis Dimer Elogatio Formi homolog (FH) domais: FH, FH, FH3 Rho-GTPase bidig domai (GBD): Autoregulatio Diaphaous Autoregulator domé (DAD): Nucleatio Trimer T. D. Pollard: Cell,, 453-465, 3. Kutatási kérdés Alkalmaott módserekm Hoga váltoik meg a akti filametumok serkeete a formiok kötődéséek hatására? Fehérj rjék (formi, mioim ioi,, akti, a tropomioi ioi) prepar parálása. Mérések fluorescecia aiotrópia lecsegés módserével. A mérések alapelve Aisotrópia lecsegés mérése bedig moomer rotatio twistig segmetal motio loger rotatioal correlatio time (s) 8 6 4 shorter rotatioal correlatio time (s) 5 4 3 3 4 5 [mdia-fh] (μm) A 3 4 5 [mdia-fh] (μm) half agle (degree) 3 5 5 C 3 4 5 [mdia-fh] (μm) A formiok megövelték a akti filametumok fleibilitását. 6
Hoga értelmehetjük a eredméeket? FRAP ( Fluorescece Recover After Photobleachig ) Side - bidig Ed - bidig fleibilit (arb. uits) 3, T 3 o C,5,,5,,,,4,6,8, [mdia-fh+liker] : [acti] cél: membrá-fehérjék laterális diffúiójáak (DL) visgálata Fehérjék selektív jelölése fluorofórral Féforrás: léer Mikroskóp a fluorescecia detektálására Photobleachig fotohalváodás (kifehéredés) A Photobleachig fogalma Módser fluorofór irreveribilis fotokémiai destrukciója gerjestő fé tökretesi a fluoresces molekulát elkerülése:. Fluoresces mita ati-photobleachig oldat (pl. glükó oidá katalá merkaptoetaol) epoiciós idő csökketése. Meghatároott terület kiégetése (pl. léerrel) Photobleach Lippicott-Schwart, 3 pulusserű gerjestés alacsoabb iteitású gerjestő fé elleállóbb fluorofor (pl. Alea) hasálata: háttér elimiálása 3. Fluorescecia helreállás 4. Egesúl beállta (általába: < ) Relativ fluorescecia (%) I I autoquechig FLIP, FRAP www.microscopu.com t / Idő Alkalmaás Példák (moik) Membrákompoesek laterális diffúiója Moomer turover / beépülés Fehérje motilitás Diffúiós kostas meghatároás ω D 4t / 7
A polariátorok típusai Defiíció: A polariátor eg ola eskö mel képes a polariálatla elektromágeses sugárást (fé) ola sugárássá alakítai, melbe csak egféle polariációs sík va jele. Típusai: Primás (Nicol; Gla-Thomso; Gla- Talor) Film-polariátor (kiújtott polimer háló ag tűrőképesség léerekbe gakra előfordul) A polariátorok működése Sellius Descart törvé si Θ si Θ c c Θ Θ v v β Refrakció és teljes vissaverődés α v levegő ví levegő Sellius-Descartes törvé siα si v β v Teljes vissaverődés siα h α h v ví Teljes vissaverődés si Θ si Θ. kompoes si Θ o si 9 si Θ Θ Θ 68 CaCO 3 76.94 9 3.6 9 Θ arc si 9 Θ arcsi.55.658 o Θ 69. Θ arcsi.55.486 Θ!?! si Θ si Θ levegő.8 Nicol.658 Nicol.486 Kaada-balsam.555 8
. kompoes Nicol-prima Kettős törés!! Határsög!! ordiárius sugár 68 CaCO 3 75.4 9 9 4.6.37 67.63 67.63 75.4 68 etra ordiárius sugár CaCO 3 9 CaCO 3 si Θ si Θ levegő.8 Nicol.658 Nicol.486 Kaada-balsam.555 Kaada-balsam William Nicol (768 85) Skót fiikus, geológus, a Nicol prima megalkotója (88). Gla-Thomso prima Gla-Talor prima etra ordiárius sugár etra ordiárius sugár ordiárius sugár kötőaag ordiárius sugár levegő Össefoglalás -Polariált fé; -Fotoselekció; -Fluorescecia polariáció és aiotrópia; -FRAP Segédaagok: http://www.ivitroge.com/site/us/e/home/refereces/molecular-probes-the-hadbook http://micro.maget.fsu.edu/primer/techiques/ide.html http://chemistr.rutgers.edu http://calvio.polito.it http://www.microscopu.com/articles/fluorescece 9