Fluoreszcencia polarizáció, anizotrópia FRAP

Átírás

1 Fluoreszcencia polarizáció, anizotrópia FRAP

2 Emlékeztető: fluoreszcencia spektrumok Definíció! a. Emissziós spektrum b. Gerjesztési spektrum (ld. abszorpciós sp.)

3 Stokes-féle eltolódási törvény Az emissziós spektrum maximuma eltolódik a nagyobb hullámhosszak irányába (energiaveszteség!).

4 Térjünk vissza a foszforeszcenciára A foto-lumineszcencia egy típusa. Időtartam (élettartam): ~ s (~ms - s) Triplett - szingulett átmenettel jár Spinátfordulás tiltott átmenet!

5 Jablonski diagram; hol lesz az emissziós spektruma? Gerjesztett-állapot Vibrációs relaxáció (10-12 s) S 1 S 1 T 1 : rendszerek közötti átmenet ( s) T 1 gerjesztés (10-15 s) S 0 S 1 T 1 S 0 ( s ) h S 0 Alap-állapot vibrációs szintek

6 Foszforeszcencia

7 Fluoreszcens folyamatok időtartama átmenet elnevezés sebességi állandó jele időtartam (s) S (0) S (1) (S n ) gerjesztés S (n) S (1) belső átalakulás k (ic) S (1) S (1) vibrációs relaxáció k (vibr.) S (1) S (0) fluoreszcencia k (f) S (1) T (1) S (1) S (0) rendszerek közötti átmenet sugárzásmentes átmenet k (intersys.crossing) k (q) T (1) S (0) foszforeszcencia k (p) T (1) S (0) sugárzásmentes átmenet k (qp)

8 Hogyan mérünk fluoreszcenciát? ( steady-state eset) fényforrás hullámh. választás minta hullámh. választás detektor Nem lineáris elrendezés!!!

9 SPEKTROFLUOROMÉTER SEMATIKUS RAJZA F M S 90 o M D Nem lineáris elrendezés!!!

10 A fluoreszcencia alkalmazásának előnyei - jó detektálhatóság: kis koncentrációban is jól mérhető - a fluoreszcencia érzékeny a környezetre

11 A fluoreszcencia alapvető paraméterei Fluoreszcencia spektrum Intenzitás Kvantumhatásfok Élettartam Polarizáció

12 Kvantumhatásfok (Q) Milyen hatásfokkal fordítódik az elnyelt energia fénykibocsátásra. Q emittált fotonok száma abszorbeált fotonok száma

13 A fluoreszcencia alapvető paraméterei Fluoreszcencia spektrum Intenzitás Kvantumhatásfok Élettartam Polarizáció

14 Fluoreszcencia élettartam ( ) A gerjesztett állapot élettartama: Időtartam, mely alatt a gerjesztett molekulák száma e-ad részére csökken. 1.2 F F ( kt k nr ) t F0e 0 F e t F e t

15 Fluoreszcencia élettartam mérése frekvencia-függő mérés ( frequency domain measurement ) idő-függő mérés ( time domain measurement )

16 A fluoreszcencia alapvető paraméterei Fluoreszcencia spektrum Intenzitás Kvantumhatásfok Élettartam Polarizáció

17 Polarizált fény, polarizáció Megjelenés fotózáskor! Miért van ilyen hatása?

18 Elektromágneses hullámok

19 Polarizáció fogalma Az elektromágneses sugárzás elektromos (és mágneses) térerősségének vektora meghatározott görbe mentén mozog (térbeli irányultság!). Ha a görbe egyenes: lineáris v. sík polarizáció Ha a görbe kör: cirkuláris polarizáció (Ha a görbe elipszis: elliptikus polarizáció) A polarizálatlan fényben a polarizációs síkok keverednek. A polarizált fényben a polarizációs síkok összhangban vannak (azonosak).

20 A polarizált fény

21 Síkban polarizált fény

22 A polarizátor Definíció: A polarizátor egy olyan eszköz mely képes a polarizálatlan elektromágneses sugárzást (fény) olyan sugárzássá alakítani, melyben csak egyféle polarizációs sík van jelen.

23 Polarizátor működésének elve

24 Hol találkoztunk már polarizátorral?

25 Korábbi ismereteink: pl. optikai aktivitás Optikai aktivitás: poláros fény síkját elforgatják Fényforrás t lc Polarizátor Mintatartó királis molekulák nem kell gerjeszteni! Analizátor Megfigyelő Polariméter

26 Polarizáció, intenzitások Intenzitás egy adott irányban: polarizátor 2 max cos Párhuzamos állás: Θ = 0, I = I max Merőleges állás: Θ = 90, I = 0

27 Az abszorpciós vektor fogalma z A M A = abszorpciós vektor E y gerjesztés x abszorpciós vektor: megszabja a foton abszorpciójának valószínűségét.

28 Fotoszelekció Nincs abszorpció ( = 90 o ) Maximális abszorpció ( = 0 o ) A Abszorpció ~ cos 2 A (max=1)

29 A fotoszelekció eredménye E

30 Mi történik a fotoszelekciót követően? E Mozgás: - transzláció; - rotáció. Minderre idő van!

31 Hogyan jellemezhető ez a rotációs mozgás?

32 Az emissziós vektor z M E = emissziós vektor I Z E gerjesztés E I X I Y y Detektor x emissziós vektor: megszabja a foton emissziójának valószínűségét.

33 Meg kell mondanunk, mekkorát csökken a z komponens! z I X I Z E I Y y I Z vs. I sum = I Z + I X + I Y x (A teljes intenzitáshoz tudjuk viszonyítani.)

34 SPEKTROFLUOROMÉTER SEMATIKUS RAJZA F M P S Vagy vertikálisan, vagy horizontálisan helyezzük el a polarizátorokat: I VV I VH 90 o P M I HV I HH D Polarizátorokat alkalmazunk!!!

35 Így a teljes intenzitás: z I sum = I Z + I X + I Y I X I Z E I Y y I sum = I VV + I VH + I VH I sum = I VV + 2I VH x

36 Fluoreszcencia polarizáció

37 Fluoreszcencia polarizáció p = (I VV - GI VH ) / (I VV + GI VH ) dimenzió nélküli G = I HV / I HH nem függ a fluorofór koncentrációjától a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja nem additív!!! értéke 0-tól 1-ig változhat (ld. következő dia).

38 p = (I VV - GI VH ) / (I VV + GI VH ) Ha = 0 lenne: I VV max., I VH = 0, tehát p = 1. Ha nagyon hosszú lenne: I VV = I VH, tehát p = 0. De nem additív!!!

39 Emissziós anizotrópia

40 Emissziós anizotrópia r = (I VV - GI VH ) / (I VV + 2GI VH ) dimenzió nélküli nem függ a fluorofór koncentrációjától G = I HV / I HH a fluorofór rotációs diffúziós mozgása befolyásolja additív!!! Emlékezzünk! I sum = I Z + I X + I Y I sum = I VV + I VH + I VH I sum = I VV + 2I VH

41 Az anizotrópia jelentése és alkalmazásai

42 Mint láttuk, rotációs mozgást ír le! z z Polarizált fény I Z E τ I Z E I Y y I Y y I X I X x x Részben polarizált fény Rotációs diffúzió

43 Az anizotrópia időfüggése I(t) = I 0 exp -t/ r r( t) r a exp( t / ) 0 i t Mire emlékeztet az időfüggés?

44 Alkalmazások Szerkezeti tulajdonságok vizsgálata Fehérje denaturáció nyomonkövetése Protein-ligand kölcsönhatás vizsgálata Szerkezet vizsgálata a környezeti paraméterek (ph, ionok) változásának függvényében Dinamikus tulajdonságok vizsgálata Membránhoz kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a membrán belsejében lévő viszkozitásról Fehérjékhez kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a fehérjemátrix flexibilitásáról

45 Példa alkalmazásra

46 Az aktin de novo polimerizációja Actin monomer Actin filament Depolymerisation Dimer Elongation Nucleation Trimer T. D. Pollard: Cell, 112, , 2003.

47 A forminok domén szerkezete GBD FH3 FH1 FH2 DAD Mammalian Diaphanous-related formins Formin homology (FH) domains: FH1, FH2, FH3 Rho-GTPase binding domain (GBD): Diaphanous Autoregulatory domén (DAD): Autoregulation

48 Kutatási kérdés Hogyan változik meg az aktin filamentumok szerkezete a forminok kötődésének hatására?

49 Alkalmazott módszerek Fehérjék (formin, miozin, aktin, tropomiozin) preparálása. Mérések fluoreszcencia anizotrópia lecsengés módszerével.

50 A mérések alapelve twisting bending monomer rotation segmental motion

51 Az anizotrópia időfüggésének mérése longer rotational correlation time (ns) shorter rotational correlation time (ns) [mdia1-fh2] ( M) A [mdia1-fh2] ( M) flexibility (arb. units) 3,0 T = 30 o C 2,5 2,0 1,5 1,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 [mdia1-fh2+linker] : [actin] A forminok megnövelték az aktin filamentumok flexibilitását.

52 Hogyan értelmezhetjük az eredményeket? flexibility (arb. units) Side - binding 3,0 T = 30 o C 2,5 2,0 1,5 End - binding 1,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 [mdia1-fh2+linker] : [actin]

53 További fogalmak, összefüggések

54 Határérték anizotrópia (r 0 ) A teljes mozdulatlan, fagyott fluorofór anizotrópiája. r cos 1 2 z Abszorpciós vektor Emissziós vektor : az abszorpciós és emissziós vektor által bezárt szög. y r x

55 Mitől függ az anizotrópia értéke? - A rotációs mozgás gyorsaságától; rotációs diffúzió; - A rendelkezésre álló időtől; fluoreszcencia élettartam!

56 Francis Perrin ROTÁCIÓS DIFFÚZIÓ flureszcencia depolarizáció Perrin egyenlet: határérték anizotrópia r r 0 r D diffúziós állandó Rotációs korrelációs idő V RT

57 Perrin egyenlet r r r 0 6D r ~ r 0 1/ 1/D

58 FRAP

59 FRAP ( Fluorescence Recovery After Photobleaching ) cél: membrán-fehérjék laterális diffúziójának (DL) vizsgálata Fehérjék szelektív jelölése fluorofórral Fényforrás: lézer Mikroszkóp a fluoreszcencia detektálására Photobleaching = fotohalványodás (kifehéredés)

60 A Photobleaching fogalma fluorofór irreverzibilis fotokémiai destrukciója gerjesztő fény tönkreteszi a fluoreszcens molekulát elkerülése: anti-photobleaching oldat (pl. glükóz oxidáz kataláz merkaptoetanol) expoziciós idő csökkentése pulzusszerű gerjesztés alacsonyabb intenzitású gerjesztő fény ellenállóbb fluorofor (pl. Alexa) használata: háttér eliminálása autoquenching FLIP, FRAP

61 Relativ fluoreszcencia (%) Módszer 1. Fluoreszcens minta 2. Meghatározott terület kiégetése (pl. lézerrel) Photobleach Lippincott-Schwartz, Fluoreszcencia helyreállás 4. Egyensúly beállta (általában: y < x) I 0 I0 2 x y 0 t 1/2 Idő

62 Alkalmazás Membránkomponensek laterális diffúziója Monomer turnover / beépülés Fehérje motilitás Diffúziós konstans meghatározás D 2 4t 1/2

63 Összefoglalás

64 A polarizátorok típusai Definíció: A polarizátor egy olyan eszköz mely képes a polarizálatlan elektromágneses sugárzást (fény) olyan sugárzássá alakítani, melyben csak egyféle polarizációs sík van jelen. Típusai: Prizmás (Nicol; Glan-Thomson; Glan- Taylor) Film-polarizátor (kinyújtott polimer háló nagy tűrőképesség lézerekben gyakran előfordul)

65 A polarizátorok működése

66 Snellius Descart törvény 1 n 1 sin sin 1 2 n2 n 1 c c n 2

67 Refrakció és teljes visszaverődés v 2 levegő Snellius-Descartes törvény β α v 1 n 2 n 1 sin sin v v 1 2 n 21 víz v 2 levegő n 2 Teljes visszaverődés sin h n 21 α h v 1 n 1 víz

68 Teljes visszaverődés sin sin 1 2 n n 2 1 sin sin 90 1 sin 1 1 n n n n n 1 arcsin n n 1 n 2 1 arcsin arcsin !?!

69 1. komponens 68 CaCO sin 2 sin n 2 1 n 1 n levegő = n Nicol1 =1.658 n Nicol2 =1.486 n Kanada-balzsam =1.555

70 2. komponens 68 CaCO sin 2 sin n 2 1 n 1 n levegő = n Nicol1 =1.658 n Nicol2 =1.486 n Kanada-balzsam =1.555

71 Nicol-prizma Kettős törés!! Határszög!! ordinárius sugár 68 extra ordinárius sugár CaCO 3 CaCO 3 Kanada-balzsam William Nicol ( ) Skót fizikus, geológus, a Nicol prizma megalkotója (1828).

72 Glan-Thomson prizma extra ordinárius sugár ordinárius sugár kötőanyag

73 Glan-Taylor prizma extra ordinárius sugár ordinárius sugár levegő

74 Összefoglalás -Polarizált fény; -Fotoszelekció; -Fluoreszcencia polarizáció és anizotrópia; -FRAP Segédanyagok:

75 A mérőrendszer további komponensei

76 Fényforrások: lámpák, lézerek

77 Optikai szűrők Felüláteresztő szűrők Aluláteresztő szűrők

78 Optikai szűrők Sáv szűrők

79 Monokromátorok, polarizátorok, küvetták, detektorok

80 A reakció sémája

81 A fluoreszcencia koncentráció-függése Lineáris függést várnánk, de! A belső-szűrő hatás (inner-filter effect) jelentkezik.

82 Fluoreszcens festékek: natív vagy intrinsic fluorofórok (definíció) Triptofán, tirozin, fenilalanin Előnyük: Nem kell módosítani a fehérjét.

83 Fluoreszcens festékek: külső vagy extrinsic fluorofórok - e.g., denzil, fluoreszcein, rodamin, kumarin, lantanidak

84 A fehérjék fluoreszcens jelölése - a jelölők minősége és elhelyezkedése tervezhető. - a fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez kapcsoljuk. - így a fehérje módosulhat, aktivitását tesztelni kell.

85 Teljes visszaverődés Mila Zinkova: Minta (víz) Tárgylemez (üveg) Teljes belső visszaverődés mikroszkópia (TIRF)