Bevezetés az áramlási citometriába

HTML
DOWNLOAD

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Bevezetés az áramlási citometriába"

Enikő Lukácsné
9 évvel ezelőtt
Látták:

1 Balicza-Himer Leonóra Bevezetés az áramlási citometriába

2 Az áramlási citometria alapjai Folyadékáramban lévő önálló részecskék gyors multiparaméteres mérése Bizonyos molekulák észlelése nagyszámú molekula sokaságban, fluoreszcens festékkel jelölt specifikus antitest segítségével

Bizonyos molekulák észlelése nagyszámú molekula

3 Az áramlási citométer működési elve Sejtszuszpenzió áramoltatása nyomáskülönbség hatására zárt keringési rendszerben, köpenyfolyadék segítségével FACS: Fluorescence Activated Cell Sorter FACS Aria FACS Calibur

rendszerben, köpenyfolyadék segítségével FACS:

4 Hidrodinamikai fókuszálás Hidrodinamikai fókuszálás egy kis keresztmetszetű kapilláris fejbe, ebben egy kis térfogat (egy sejt) megvilágítása lézerrel Nagy sebesség (akár sejt/perc) központi tér köpeny folyadék minta köpeny folyadék hidrodinamikai fókuszálás fluoreszcencia jel a festett sejtekről egysejtes áramlás lézer fényforrás fényszórás jelek minden sejtről

5 A jel feldolgozása, sokszorozása A sejtről érkező fényszórás és fluoreszcencia jelek detektálása A sejtenként beérkező adatok digitalizálása és feldolgozása számítógépen áramlási rendszer (köpenyfolyadék) optikai rendszer adatgyűjtés adatfeldolgozás adat analízis fényforrás (lézer) FLUORESZCENCIA JELEK detektorok, jelsokszorozók (+ analóg-digitális konverter) Sejtek megvilágítása Jelek generálása FÉNYSZÓRÁS JELEK

(köpenyfolyadék) optikai rendszer adatgyűjtés adatfeldolgozás adat analízis fényforrás (lézer)

6 Az áramlási citométer felépítése áramlási kamra mintavevő kamra lézerek detektorok szeméttartály

7 Az áramlási citométer felépítése

8 Az áramlási citometria előnyei sejtenkénti multiparaméteres analízis (akár 8-12 féle tulajdonság/sejt) nagy sebesség (akár sejt / perc) populáció / heterogenitás / korrelációanalízis lehetősége sejtszortírozás (tetszőleges tulajdonság alapján) lehetősége Az áramlási citométerrel begyűjthető optikai jelek Minden sejtről: fényszórás jelek Előre irányuló fényszórás (FSC) Oldalirányú fényszórás (SSC) A jelölődött sejtekről: fluoreszcencia többféle hullámhossztartományban

000 sejt / perc) populáció / heterogenitás / korrelációanalízis lehetősége sejtszortírozás (tetszőleges tulajdonság

9 Fényszórás jelek feldolgozása Előre irányuló fényszórás Forward scatter (FSC) sejtméret, sejtalak Oldalirányú fényszórás Side scatter (SSC) sejt intracelluláris fénytörése granuláltság

10 SSC granuláltság A fényszórás jelek feldolgozása 2D dot plot, vérminta granulocita monocita FSC méret, alak vörösvérsejt limfocita

kibocsátásáért felelős molekula, vagy annak egy része Stokes-törvény: Az emittált foton

11 A fluoreszcencia fogalma Egy anyag gerjesztés hatására bekövetkező fénykibocsátása energiaveszteség gerjesztés (excitáció) fénykibocsátás (emisszió) Fluorofór: a fény kibocsátásáért felelős molekula, vagy annak egy része Stokes-törvény: Az emittált foton energiája mindig kisebb, hullámhossza pedig nagyobb, mint a gerjesztő fotoné gerjesztő fény kibocsátott fény

12 Fluoreszcencia a sejtanalitikában Hoechst DAPI fluoreszcein (FITC) Alexa 488 fikoeritrin (PE) Alexa 568 allofikocianin (APC) propidium-jodid Alexa 647 rodamin Áramlási citofluorimetria Fluoreszcens mikroszkópos technikák Fehérje és DNS technikák

(APC) propidium-jodid Alexa 647 rodamin Áramlási

13 A fluoreszcencia jelentősége nagy érzékenység (~pmol/l) veszélytelen a hasonló érzékenységű radioaktív detektálási módszerekkel szemben detektálás: akár több millió sötét molekulához képest néhány fluoreszcens molekula kvantitatívan is detektálható (intenzitás) A fluoreszcens festékekkel szemben támasztott követelmények Olyan hullámhosszon emittáljanak, ahol kicsi az autofluoreszcencia Az emissziós spektrumuk a lehető legkisebb mértékben fedjenek át (kompenzáció) Jól detektálható, erős fluoreszcenciát eredményezzenek (érzékenység) Alacsony legyen az aspecifikus kötődés mértéke Legyenek olcsók A fehérjék (antitestek) jelölése egyszerű protokollal legyen megvalósítható Ne módosítsák jelentősen a jelölt molekula tulajdonságait

az autofluoreszcencia Az emissziós spektrumuk a lehető legkisebb mértékben fedjenek át (kompenzáció) Jól detektálható, erős fluoreszcenciát eredményezzenek (érzékenység) Alacsony

14 A fluoreszcens fényjelek elkülönítése

15 Az áramlási citométerekben leggyakrabban alkalmazott lézerek, festékek

16 Színátfedés, színkompenzáció %-os elektronikus jelerősség korrekció

17 Az adatok értékelése Hisztogram fluoreszcencia intenzitás -sejtszám Dot plot FSC-SSC

18 A fluoreszcens jel intenzitása Összefüggés van a jelintenzitás (detektor feszültség), a fluoreszcencia intenzitás és a fluoreszcens molekulák száma közt: A fényesebb sejtek nagyobb feszültség impulzust hoznak létre

intenzitás és a fluoreszcens molekulák száma közt: A

19 Qdot technológia: kimutatás Qdot-biokonjugátummal direkt jelölés Qdottal kapcsolt antitesttel A célfehérjék detektálása Quantum dot (Qdot) nanokristály technológia Qdot nanokristály: a fluoreszcenciához hasonló, de más fizikai hátterű fénykibocsátásra alkalmas félvezető anyag a Qdot mérete szabja meg a kibocsátott fény hullámhosszát Qdot nanokristály szerkezete Előnyök: a fluoreszcens technikát használó molekuláris biológiai módszerek bármelyikében használható nincsenek átfedő spektrumok egyetlen gerjesztő fényforrás elegendő hosszú életidejű jel és stabilitás: hosszú távú vizsgálatok időbeli nyomonkövetésére alkalmas

kibocsátott fény hullámhosszát Qdot nanokristály szerkezete Előnyök: a fluoreszcens technikát használó molekuláris biológiai módszerek bármelyikében

20 Felhasználási területek sejtek, receptorok aránya / mennyisége / eloszlása (sejtfelszíni vagy intracelluláris molekulák) fehérjék (strukturális fehérjék, antigének, enzimaktivitás) ionok, szabadgyökök, sejtpigmentek mérése kromoszómák (DNS könyvtárak) DNS, RNS tartalom (sejtciklus, sejtosztódás, proliferáció) életképesség vizsgálat (apoptózis, nekrózis) Kinetikus mérések (sejtaktiváció időbeli nyomonkövetése) membrán fluiditás vizsgálat, Ph, membrán potenciálok funkcionális vizsgálatok sejtszortírozás

könyvtárak) DNS, RNS tartalom (sejtciklus, sejtosztódás, proliferáció) életképesség vizsgálat (apoptózis, nekrózis) Kinetikus

21 Általános jelölési protokoll A biológiai minta feldolgozása, egysejtes állapotba hozása A sejtek lecentrifugálása (ált sejt / minta) Direkt jelölés: 1. Fluoreszcensen jelölt specifikus antitest hozzáadása 2. Vortex, inkubálás 3. Mosás(ok): Centrifugálással a felülúszó eltávolítása 4. A pellet felöntése pufferrel, vortex, mérés Indirekt jelölés: 1. Specifikus 1. antitest hozzáadása 2. Vortex, inkubálás 3. Mosás(ok): Centrifugálással a felülúszó eltávolítása antitesthez kötődő fluoreszcensen jelölt 2. antitest hozzáadása 5. Vortex, inkubálás 6. Mosás(ok): Centrifugálással a felülúszó eltávolítása 7. A pellet felöntése pufferrel, vortex, mérés Opcionális: A vörösvérsejtek lízise Intracelluláris jelölés: fixálás / permeabilizálás

22 Sejtfelszíni markerek Sejtpopulációk Százalékos megoszlás Dot plot FSC-SSC Kvadráns dot-plot APC-PE Hisztogram fluoreszcencia intenzitás -sejtszám

23 Intracelluláris markerek, sejtaktiváció Negatív 5,1% RMF: 6, minta 28,3% RMF: 7, minta 48,9% RMF: 8,944 pozitív 95,3% RMF: 12,536

24 Propidium-jodid (PI) Sejtszám Életképesség vizsgálatok PI fluoreszcencia intenzitás AnnexinV-FITC

25 Sejtszám Sejtszám Sejtszám Sejtciklus, proliferáció vizsgálatok PI fluoreszcencia CFSE fluoreszcencia CFSE fluoreszcencia

26 Kinetikai vizsgálatok Intracellulaláris Ca 2+ (Fluo3, Fura-Red) Mitokondriális Ca 2+ (Rhod2) Nitrogén-oxid termelés (DAFFM) Szuperoxid termelés (DHE) Plazmamembrán potenciál (DiBAC4(5) Mitokondrium membrán potenciál (TMRM, JC-1)

27 Sejt szortolás Tetszőleges tulajdonság alapján a sejtek egyenkénti kiválogatása Több különböző jelöléssel akár több (2-4) sejtpopulációt is szétválogathatunk További vizsgálatokhoz (WB, PCR) használhatóak a kiszortolt sejtek Létezik steril sortolás is Elektromos feszültség hatására a sejtek egyenként, a lapátok mentén a megfelelő gyűjtőcsőbe folynak Tisztaság: > 95% Kiszortolt sejtek száma: 300 sejt/sec Visszanyert sejtek: > 50%

28 Az áramlási citometria használhatósága Egyedülálló molekuláris biológiai módszer Egy heterogén populációból sejtenkénti multiparaméteres analizis Nem csak az egyes sejtek többféle sejtfelszini és intracelluláris fehérje expresszióját, nukleinsavtartalmát, és még számos más paraméterét határozhatjuk meg, de aktuális aktivációs állapotukat is nyomon követhetjük az időben Az egyes sejtek fehérjeexpressziójának mértéke is összehasonlithatóvá válik Élő sejteket vizsgálhatunk, melyeket egy kívánt paraméterre kisortolva azok akár további vizsgálatokra is alkalmasak lehetnek A jelölő antitestek más módszerekhez is használhatóak, gyors jelölési procedúra Azonnal kvantitativan értékelhető eredményeket kapunk Számos más, csak szűk területen alkalmazható molekuláris biológiai módszer kiváltására alkalmas lehet

Hasonló dokumentumok

Antigén-ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló analitikai módszerek. Áramlási citofluorimetria (FACS) Konfokális lézerpásztázó mikroszkópia (CLSM)

Antigén-ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló analitikai módszerek Áramlási citofluorimetria (FACS) Konfokális lézerpásztázó mikroszkópia (CLSM) 2016.03.22. Sándor Noémi noemi.sandor@ttk.elte.hu Ismétlés