Analitikai műszerek minősítése FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA MŰSZEREZETTSÉGE. Analitikai eredmény generálásának fázisai

Átírás

1 FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA MŰSZEREZETTSÉGE Krusper László Debreceni Egyetem 2 Analitikai eredmény generálásának fázisai Analitikai műszerek minősítése 3 DQ (Design Qualification) a műszer beszerzése előtt IQ (Installation Qualification) a műszer telepítése során OQ (Operation Qualification) a műszer telepítése során és rendszeres időközönként PQ (Performance Qualification) a műszer telepítése során és rendszeres időközönként Rendszeres időközönkénti karbantartás OQ (PQ). 1

2 A kezdetektől napjainkig 4 A kezdetektől napjainkig 5 A kezdetektől napjainkig 6 2

3 A kezdetektől napjainkig 7 Folyadék szállítás 8 Általános követelmény nagy nyomásesés ( bár) ellenében széles térfogatáramlási sebesség tartományban 0,01 10,0 ml/min) pulzálás mentesen (1% alatt) az előírt arányban elegyítve szállítsa a folyadékot. Kromatográfiás oldószerek 9 A nagynyomású szivattyú működését befolyásoló tényezők: az eluens nem tartalmazhat szilárd részeket működés közben nem keletkezhetnek szilárd részecskék az eluens nem tartalmazhat oldott gázokat az eluensnek kompatibilisnek kell lennie a nagynyomású szivattyú szerkezeti anyagaival 3

4 Kromatográfiás oldószerek 10 Gázmentesítés 11 Szükséges mert az oldott gázok a pumpafejben kiválva egyenetlen folyadékszállítást, pulzálást okoznak. 10 < pny < 500 bar nyomóág dugattyú ny sz légbuborék (O2) p sz < 1 bar szívóág légbuborék (O2) oldószer gõz buborék Gázmentesítés 12 4

5 Gázmentesítés 13 Megoldása alapvetően három módszer terjedt el: vákuummal történő oxigénmentesítés héliumgázzal történő oxigénkihajtás ultrahanggal történő oxigénmentesítés Gázmentesítés 14 On-line gázmentesítés alacsony nyomású tér Szűrés 15 5

6 Szűrés 16 Egy dugattyúfejes szivattyú 17 Két dugattyúfejes szivattyú 18 Párhuzamos kapcsolás 6

7 Két dugattyúfejes szivattyú 19 Soros kapcsolás Szelepek 20 A pulzálás csökkentése 21 Mechanikus úton Rugalmas falú eszköz Elektronikus úton A dugattyú mozgás vezérlése 7

8 Az oldószerek keverése 22 Az oldószerek keverése

9 25 Gradiens kromatográfia 26 Izokratikus elválasztás A kromatográfiás paraméterek időben nem változnak (a mozgófázis összetétele állandó) Gradiens elválasztás Időben növeljük a retenciót csökkentő hatást Oldószer összetétel változtatása estén Két oldószer Három oldószer Négy oldószer bináris tercier quaterner Izokratikus elúció 27 Folyamatos, állandó összetételű Az E mobil fázist folyamatosan adagolják Teljesen elvált zónák keletkeznek (A,B,C), közöttük tiszta (E) zónával Akkor alkalmazható, ha az elválasztandó vegyületek és állófázishoz való affinitásuk nem nagyon különbözik egymástól 9

10 Gradiens módszer alkalmazása 28 Egymástól jelentősen eltérő tulajdonságú anyagok elválasztása: nem teljesül a visszatartásra: k értéke lehetőleg 1 és 10 közé essen Oldószerkésés 29 Mikor éri el a kolonnát a megváltozott összetételű eluens Ellenőrzés 30 Áramlási sebesség Pulzálás Oldószerek aránya Gradiens késés 10

11 Injektorok 31 Feladat: A minta bejuttatása a kolonnára A folyadékáram megállítása nélkül, dugószerűen, pillanatszerűen Ismételhetően adott azonos térfogatban Keresztszennyeződés nélkül Manuális és automata injektálás LOOP típusú injektálás 32 Manuális és automata módban Parciális és teljes loop (hurok) feltöltés Through needle típusú injektálás 33 Csak automata módban 11

12 Ellenőrzés 34 Injektált térfogat Injektált térfogat linearitása Keresztszennyeződés (Rendszer ellenőrzés) Detektorok 35 Detektorok jellemzése 36 Komponensek tulajdonságát észlelik UV- látható abszorbancia detektor (UV- VIS) Fluoreszcenciás detektor (FLD) Elektrokémiai detektor (ECD) Radiokémiai detektor (RD) Tömeg detektorok (MSD) Nitrogén detektor (NSD) Előnyök: specifikusság, érzékenység, szelektivitás Hátrányok: minden vegyület más (pl. más UVmax) 12

13 Detektorok jellemzése 37 Mozgó fázis tulajdonságát észlelik Törésmutató detektor (RID) Vezetőképesség detektor (CD) Fényszórásos detektor (LSD) Előnyök: sok komponensre csaknem univerzális Hátrányok: zaj, érzékenység Detektorok jellemzése 38 Dinamikus tartomány Lineáris tartomány Detektálás alsó határa Detektorzaj Detektorcella térfogat és geometriai kialakítás Időállandó A nyomásváltozás és az áramlási sebesség hatása a jel/zaj viszonyra. A hőmérséklet hatása a jel/zaj viszonyra Érzékenység Szelektivitás Detektorok jellemzése 39 13

14 Detektorok jellemzése 40 s=ac Lineáris tartomány s detektorjel a detektor érzékenység c minta koncentráció s=ac r r válasz index (response index) (0,98 1,02) detektor érzékenység a=ds/dc Detektorok jellemzése 41 Legkisebb kimutatható anyagmennyiség Detektorok jellemzése - zaj 42 Statikus Dinamikus Rövid távú Hosszú távú Drift 14

15 Detektorok 43 Detektor Linearitási tartomány Érzékenység (kedvező komp.) Kimutatási határ Grad. elúcióra alkalmas UV-VIS ,56 0,1 ng/ml 1 ng igen Fluoreszcens ng/ml 1 pg igen RI ng/ml 10 ng nem Elektrokémiai ng/ml 1 pg nem Vezetőképességi ng/ml 1 ng nem UV-VIS detektorok 44 Egycsatornás detektor UV-VIS detektorok 45 Diódasoros detektor 15

16 Diódasoros detektor A :00 Res=1.0 Absorbance/Nanometers Absorbance 12.5 Minutes Absorbance 0 A: 3D kép B: UV-VIS spektrum C: Kromatogram D: Izoabszorpciós vonalak 8 B Nanometers 15 5 D Minutes C Mi nutes UV-VIS detektorok 47 Detektor cellák Fluoreszcenciás detektorok 48 Érzékeny (1pg), szelektív Fluoreszcens anyagok Háttérfluoreszcencia, kioltási hatás Fluoreszcens származékok 16

17 Elektrokémiai detektorok 49 -Amperometriás detektálás: Állandó feszültség mellett mért áramerősség az idő függvényében regisztrálva. -Coulometriás detektálás: Olyan amperometriás detektálás, amely esetben az elektrokémiai reakció 100%-os (nagy elektródfelület). Elektródok anyagai: szénpaszta, nemesfémek, üveges szén. Érzékenysége eléri a fluoreszcens detektorokét (1pg). Törésmutató detektorok (RI) 50 Fényelhajlás elvén működő detektor Törésmutató detektorok (RI) 51 Teljes visszaverődés elvén működő detektor 17

18 Törésmutató detektorok (RI) 52 Fényinterferencia elvén működő detektor ELSD 53 Elpárologtatással egybekötött fényszórás elvén működik Evaporative lightscattering detector Charged Aerosol Detection (CAD) 54 18

19 Kapcsolt technikák 55 Kapcsolt technikák 56 UV-VIS detektor ellenőrzés 57 Lámpa energia Hullámhossz pontosság Linearitás 19