Méretkizárásos kromatográfia szintetikus- és biopolimereknél. készítette: Bozsik Júlia Szepcsik Balázs

Átírás

1 Méretkizárásos kromatográfia szintetikus- és biopolimereknél készítette: Bozsik Júlia Szepcsik Balázs

2 Szintetikus polimerek Állófázisok Általános szabályok pórusátmérő ~ vizsgált molekula mérete lgm V r legyen lineáris nagy fajlagos pórustérfogat minimális anyagátadási ellenállás gömb alakú töltet, szűk méreteloszlás inert mechanikailag stabil, kémiailag ellenálló, hőálló

3 Szintetikus polimerek Állófázisok Leggyakoribb típusok: gél alapú állófázis szervetlen alapú állófázis szerves polimer alapú állófázis

4 Szintetikus polimerek - Állófázisok Gél alapú állófázis: xerogélek a polimerláncokat szolvatáló oldószerekben (erősen poláris szerves o.sz., illetve vízben és vizes pufferben is lehet használni őket) nagy mértékben megduzzadnak az oldószer eltávolítása után a duzzadt állapotban létező xerogél-hálózat összeesik, így száraz állapotban nem tartalmaz pórusokat szemcseátmérő: µm (duzzadt állapotban) adszorpciós aktivitása nincs gömb alakú töltet-részecskék pkrit < 1 MPa kémiai- és hőstabilitása kicsi

5 Szintetikus polimerek - Állófázisok Szervetlen állófázisok: ide tartozik a szilikagél és a makropórusos üveg (MPG) mint állófázis kémiailag ellenállók, és magas hőmérsékleten is használhatók, nagy nyomásállóság jellemzi őket jó pórusméret-eloszlás érhető el dp = 5 10 µm szilikagél esetén gömbszimmetrikus, makropórusos üvegnél szabálytalan a szemcsealak jól nedvesíthető töltetek a pórusméret nem változik meg az oldószerváltáskor adszorpciós aktivitás kiküszöbölésére módosítani kell a felületét (MPG esetén lúgos kezelés) MPG esetén nagyfokú szabályosság figyelhető meg a pórusszerkezetben MPG állófázisok szemcseméret-eloszlása szűkebb a szilikagélénél pkrit > 100 MPa

6 Szintetikus polimerek - Állófázisok Szerves polimer alapú állófázisok: az egyik legfontosabb a sztirol-divinilbenzol kopolimer mint állófázis a styragelek jó nedvesíthetőséget és részleges duzzadást mutatnak kloroformban, metilén-kloridban, THF-ben, toluolban, benzolban. Jól használhatók többek között a következő anyagok vizsgálatában: nemionos felületaktív anyagok, polibutadién, poliizobutilén, poliizoprén, poliakrilát, gyanták, poliamidok, poliészterek, poliuretánok, gumik, neoprén, polisztirol, PVC. dp = µm gömbszimmetrikus szemcsék a nem módosított felületű szemcséknek esetleg lehet adszorpciós aktivitása pkrit ~ 20 MPa

7 Szintetikus polimerek Mozgófázis Legfontosabb mozgófázisok: THF DMF DMSO toluol kloroform

8 Szintetikus polimerek Mozgófázis A polimerek elválasztásában a THF univerzálisnak tekinthető oldószer, de néhány anyagot nem old: ABS, poliamid, poliakrilnitril, polietilén-oxid, PE, PP, szilikonok, poliizoprén, polikloroprén. Az első négy DMF-ben, az utolsó három toluolban vizsgálható.

9 Szintetikus polimerek - Detektorok A leggyakoribb detektorok: refraktométer (RI) infravörös (IR) fényszórás elvén működő (LALLS) viszkoziméter (VD)

10 Viszkozimetriás detektor A: rozsdamentes acél bemenet B: kapillár-viszkoziméter C: nyomáscella külső nyomólemeze D: nyomólemez tartógyűrűje E: Swagelock-összekötő F: nyomáscella-kamra G: nyomás-jelátalakító H: termosztát J: termosztát O-gyűrű tömítés

11 Vizes méretkizárásos kromatográfia Alkalmazási terület Elsősorban a bioanalitikában alkalmazzák: például fehérjék eltérő tömegű komponenseinek meghatározására, peptid keverékek, poli- és oligoszacharidok elválasztására, DNS fragmensek és nukleinsavak vizsgálatára. Olyan szintetikus polimerek jellemzésére is használható, melyek vízben oldódnak, például poli(vinil-amin), poli(etilén-oxid), polietilénimin. Vizes méretkizárásos kromatográfia - Állófázisok Gélképzésre alkalmas természetes polimerek: keményítő, agar, dextrán, cellulóz ezeknek alapból kicsi mechanikai stabilitásuk, ezért gyártásukkor keresztkötő molekulákat alkalmaznak (pl. epiklórhidrin, divinilszulfon, 2,3-dibrómpropanol) Porózus üveg: előállítás: erős sav segítségével kioldják az üveg bórvegyületekben gazdag fázisát. Módosított szilikagélek szintetikus polimerek: akrilát alapúak, poli(vinil-alkohol) gél, polisztirol és poliakrilamid alapúak

12 Vizes méretkizárásos kromatográfia - Mozgófázisok Az eluensrendszer megválasztásakor két fontos szempontot kell figyelembe venni: A mozgófázisnak meg kell akadályoznia a biopolimer és az állófázis között lehetséges ionos vagy hidrofób kölcsönhatás létrejöttét. Vizes SEC-kel vizsgált makromolekulák főleg a fehérjék szerkezete jelentős mértékben változhat az eluens minőségének köszönhetően, ugyanis az oldószer polaritása, a hozzáadott só koncentrációja, az ionerősség, módosító szer (detergens) jelenléte és a ph nagyban befolyásolja a molekulák konformációját. Ezért a vizes alapú mozgófázisok mindig tartalmaznak puffert. Ez legtöbbször TRIS - trisz(hidroximetil)aminometán vagy különböző foszfátok. A ph állandó értéken való tartásával stabilizáljuk a fehérjék szerkezetét. A pufferek ionerősségét 0,1-0,5 M értékre kell beállítani; ezzel kiküszöböljük a fehérje adszorpcióját az állófázison. Módosító szerre a hidrofób kölcsönhatás eliminálása céljából van szükség. Erre példa a nem denaturáló nátrium-deoxikolát és a denaturáló nátriumdodecilszulfát (SDS) vagy a guanidin-hidroklorid.

13 Vizes méretkizárásos kromatográfiában használt detektorok Elterjedten alkalmazzák a SEC-LALLS (LowAngleLaserLightScattering = kis szögű lézer fényszórás detektor) technikát, s újabban az MS-sel való detektálást. Itt most csak az ELSD (EvaporativeLightScatteringDetector = elpárologtatással egybekötött fényszórás elvén működő detektor) működését tárgyaljuk részletesebben (univerzális detektor). A kolonnáról érkező folyadékot nagy sebességű nitrogén vagy hélium gáz segítségével porlasztjuk. Az aeroszol előállítása után az oldószereket fűtés hatására elpárologtatjuk, csak a nem illékony vizsgálandó részecskék maradnak vissza. Ezeket a kiülepedő anyagokat lézer vagy wolfram lámpával világítják meg, s mérik a részecske szemcséken létrejövő fényszórást. A szórt fényt fotométerrel érzékelik, mely a részecske méretével és koncentrációjával arányos. A mért jel és a koncentráció közti összefüggés nem lineáris, mely részint a polimerek méret szerinti eloszlásának köszönhető.

14 Vizes méretkizárásos kromatográfiával kapcsolatos problémák tárgyalása A hagyományos SEC mérések viszonylag lassúak, ezért vizsgálni kell a gyors SEC alkalmazhatóságának lehetőségét. A mérés idejének csökkentésére alapvetően három lehetőségünk van: A kolonna paramétereinek csökkentése: ekkor a kolonna kapacitása is csökken. A gyors SEC-ben alkalmazott kolonnák belső átmérője rendszerint 4,6 mm. A hőmérséklet emelése: maximum 40 C-ig emelhető, mert efelett a fehérjék koagulálódhatnak és/vagy denaturálódhatnak, vagyis tönkretehetik a kolonnát. Az áramlási sebesség, térfogatáram növelése: Ez a kisebb molekulák esetében alig, a nagyobb makromolekuláknál azonban jelentősen megnövelheti a HETP-t, vagyis rontja a hatékonyságot. Ezért maximum 3 ml/min térfogatáramot alkalmaznak. Hogy ne terheljük túl a kolonnát, legfeljebb 0,2 ml mintaoldatot injektálhatunk, s benne a minta tömege nem lehet nagyobb 1mg-nál.