Méretkizárásos módszer a szintetikus polimerek elválasztásában és a biopolimereknél

Átírás

1 Méretkizárásos módszer a szintetikus polimerek elválasztásában és a biopolimereknél I. Szerves oldószerű méretkizárásos kromatográfia (polimerek elválasztása méret szerint) A GPC-ben (gélpermeációs kromatográfia) a fázisok szorpciós aktivitását és az ebből következő anyagátadást a fázisok között egyrészt a makromolekula diffúziós mozgékonysága határozza meg, másrészt a mérete a pórusokhoz képest. A GPC-vel megállapítható így a makromolekulák mérete, molekulatömege, diffúziós együtthatója, valamint néhány szerkezeti sajátság, például a polimer elágazósága, a kopolimerek méretének függése az összetételüktől és a molekulatömegüktől, meghatározható az izomerek száma, asszociátumok és komplexek jelenléte polimerkeverékekben, illetve az ezekhez tartozó egyensúlyi állandók. Állófázisok Polimerek elválasztására a következő állófázis-töltetek ismertek: makropórusos polimer, makropórusos szilika, makroretikuláris keresztkötött duzzasztott polimer-gél. Általános megfontolások: 1. a pórusok átmérője legyen összemérhető a vizsgált molekulák méretével. Ez elengedhetetlen a méret szerinti elválasztáshoz. 2. fontos cél, hogy a pórusméret-eloszlás olyan legyen, ami lineáris összefüggést ad kalibrációkor a retenciós térfogat és a molekulatömeg logaritmusa között. A: teljes kizárás B:teljes áteresztés 3. legyen 1

2 különlegesen nagy a fajlagos pórustérfogata a töltetnek, az elválasztás nagy hatékonysága miatt fontos 4. a töltet anyagátadási ellenállása legyen minimális, a töltet szemcséibe minél könnyebben jusson be diffúzióval a makromolekula 5. az oszloptöltés hatékonyságának és a hidrodinamikai ellenállás csökkentésének érdekében a a töltet-részecskék alakja legyen gömbszerű, és a szemcseméreteloszlás legyen minél keskenyebb sávban. Ha ez teljesül, a kolonna hatékonysága jelentősen megnő. 6. rigid töltet esetén legyen jó a nedvesíthetőség, gél-töltet esetén pedig a duzzadóképesség a használt oldószerben 7. a töltet ne mutasson adszorpciós kölcsönhatást a vizsgált makromolekulákkal. Erre a következő szabály érvényes: poláris makromolekulákat poláris tölteten, poláris oldószerben, míg apoláris molekuákat apoláris állófázison, apoláris oldószerben választunk el. Általánosságban, olyan oldószert célszerű választani, amely nem kevésbé poláris, mint a vizsgált makromolekula egységei. Ebben az esetben monomolekuláris réteg alakulhat ki, ami gátolja az adszorpciót (bár enyhén csökkenti a pórus méretét). 8. a töltet legyen mechanikailag és kémiailag stabil, legyen hőálló. Állófázis-töltetek: a) xerogel b) porózus üveg (aerogel) c) szilikagél (aerogel ) d) szerves makropórusos töltet (aerogel-xerogel hibrid) e) agarose (aerogel-xerogel hibrid) 2

3 Gél alapú állófázisok ( soft ): xerogélek a polimerláncokat szolvatáló oldószerekben (erősen poláris szerves o.sz., illetve vízben és vizes pufferben is lehet használni őket) nagy mértékben megduzzadnak az oldószer eltávolítása után a duzzadt állapotban létező xerogél-hálózat összeesik, így száraz állapotban nem tartalmaz pórusokat szemcseátmérő: µm (duzzadt állapotban) adszorpciós aktivitása nincs gömb alakú töltet-részecskék p krit < 1 MPa kémiai- és hőstabilitása kicsi Szervetlen állófázisok ( rigid ): ide tartozik a szilikagél és a makropórusos üveg (MPG) mint állófázis kémiailag ellenállók, és magas hőmérsékleten is használhatók, nagy nyomásállóság jellemzi őket jó pórusméret-eloszlás érhető el d p = 5 10 µm szilikagél esetén gömbszimmetrikus, makropórusos üvegnél szabálytalan a szemcsealak jól nedvesíthető töltetek a pórusméret nem változik meg az oldószerváltáskor adszorpciós aktivitás kiküszöbölésére módosítani kell a felületét (MPG esetén lúgos kezelés) MPG esetén nagyfokú szabályosság figyelhető meg a pórusszerkezetben MPG állófázisok szemcseméret-eloszlása szűkebb a szilikagélénél p krit > 100 MPa 3

4 makropórusos üveg Szerves polimer állófázisok ( semi-rigid ): az egyik legfontosabb a sztirol-divinilbenzol kopolimer mint állófázis a styragelek jó nedvesíthetőséget és részleges duzzadást mutatnak kloroformban, metilén-kloridban, THF-ben, toluolban, benzolban. Jól használhatók többek között a következő anyagok vizsgálatában: nemionos felületaktív anyagok, polibutadién, poliizobutilén, poliizoprén, poliakrilát, gyanták, poliamidok, poliészterek, poliuretánok, gumik, neoprén, polisztirol, PVC. d p = µm gömbszimmetrikus szemcsék a nem módosított felületű szemcséknek esetleg lehet adszorpciós aktivitása p krit ~ 20 MPa 4

5 Mozgófázisok Általános követelmények: a mozgófázis oldja a vizsgált molekulát, nedvesítse az állófázist. Előnyös tulajdonságok még: kis visz kozitású, nem gyúlékony, kicsi a toxicitása, a detektálást lehetővé teszi. A legfontosabb mozgófázisok: THF; 1,2,4 - triklórbenzol; o-diklórbenzol; toluol; N,N - DMF; metilén-klorid; etilén-diklorid ; kloroform; m-krezol; benzol; DMSO; perklór-etilén; o-klórfenol; CCl 4. A polimerek elválasztásában a THF univerzálisnak tekinthető oldószer, de néhány anyagot nem old: ABS, poliamid, poliakrilnitril, polietilén-oxid, PE, PP, szilikonok, poliizoprén, polikloroprén. Az első négy DMF-ben, az utolsó három toluolban vizsgálható. Szilikát (szilikagél vag y üveg) állófázis esetén polárisabb mozgófázis szükséges, például THF vagy DMF, hogy a polimer adszorpciója gátolt legyen. Toluol alkalmazásakor pár százalék THF hozzáadása szükséges az adszorpció gátlására. Detektorok A polimerek méretkizárásos vizsgálatában használt detektorok: Differenciális refraktométer Ez a leggyakoribb típus. Tömbdetektor, nem szelektív. A jel arányos a törésmutatóváltozással a tiszta mozgófázis és a mintát tartalmazó mozgófázis között. UV-VIS Csak az UV-VIS-elnyelő komponensek vizsgálhatók így, illetve az oldószerek a 200 nm alatti detektálást nem teszik lehetővé. IR Polimerek és részben kopolimerek esetén is használható, egészen 200 C-ig. A detektorok celltérfogata 5-50 µl. Van olyan típus, amelyik folyamatos mérést tesz lehetővé 2.5 és 14.5 µm hullámhossz között, más típus fix hullámhosszakon mér, és van olyan is, amelyik csak a CH-vegyértékrezgés hullámhosszán (3.4 µm) mér. Fluorimetriás detektor 5

6 Csak fluoreszcens-jelölt polimerek eseteén lehet használni, ilyen esetben viszont kiváló érzékenységű. LALLS (Low Angle LASER Light Scattering) detektor Ezt a detektort egy koncentráció-érzékeny detektorral (RI, UV-VIS vagy IR) kiegészítve a molekulatömeg meghatározására és abszolút GPC-kalibráció elvégzésére szokták használni a méretkizárásos kromatográfiában. Előnyei: gázbuborékok és egyéb szennyezők minimális jelet adnak, nincs fluoreszcencia, nem destruktív, nincs fényabszorpció. VD (részletes tárgyalás) A viszkozimetriás detektor egy koncentráció-érzékeny detektorral információt ad a molekulatömeg-eloszlásról. Ha a Benoit-féle univerzális kalibrációt alkalmazzuk, és az [η] valódi viszkozitása a polimernek ismert, a Kuhn Mark Houwink konstansok meghatározása után a molekulatömeg meghatározható. A detektor azon alapszik, hogy stabil áramlási körülmények között egy kapillárisban a nyomásesés arányos a viszkozitással. (Hagen Poiseuille-törvény) p = k*η, ahol k = (8/π)*F c *(l/r 4 ) F c az áramlási sebesség, l a kapilláris hossza, r a sugara. Állandó (ún. Poiseuille -) körülmények között k konstans, és az alábbi arányosság áll fenn: A koncentráció-detektorral együtt a valódi viszkozitás meghatározható: Fontos a stabil áramlási viszonyok és az állandó hőmérséklet biztosítása. Polimerek molekulatömeg-eloszlása meghatározható ugyan, de biopolimerek esetében nem elégséges az érzékenysége. 6

7 viszkozimetriás detektor A: rozsdamentes acél bemenet B: kapillár-viszkoziméter C: nyomáscella külső nyomólemeze D: nyomólemez tartógyűrűje E: Swagelockösszekötő F: nyomáscella-kamra G: nyomás-jelátalakító H: termosztát J: termosztát O-gyűrű tömítés Optimálás Egy kromatográfiás rendszer produktivitása: N eff : az effektív tányérszám t: egységnyi idő u: a mozgófázis lineáris áramlási sebessége H: elméleti tányérmagasság k : visszatartási tényező, 7

8 A produktivitásnak k =2-nél optimuma van. Szilikagél és üveg állófázis esetén. Gél állófázisnál A szelektivitás: V 1 és V 2 a retenciós térfogatok, V 0 a szemcsék közötti térfogat. A szelektivitás értéke 1-től (V 1 = V 2 ) változhat végtelenig (V 1 = V 0 ). A szelektivitás jellemezhet ő az ún. S paraméterrel is: Egy adott felbontás megvalósítható kis hatékonysággal és nagy szelektivitással, vagy nagy hatékonysággal és kis szelektivitással: 8

9 Univerzális kalibráció GPC-ben Benoit és társai igazolták, hogy a retenciós térfogat (V R ) függése a hidrodinamikai térfogattól arányos a molekulatömeg és a valódi viszkozitás szorzatával (M[ η]). Továbbá, hogy minden adott polimer-oldószer párra a V M-től való függése kiszámítható a V vs. M[η] általános kalibrációból, amit univerzális kalibrációnak neveztek. Forrás: Modern liquid chromatography of macromolecules B.G. Belenkii és L.Z. Vilenchik 9

10 II. Vizes méretkizárásos kromatográfia Vizes méretkizárásos kromatográfiában használt állófázisok Az állófázisként használt vagy használható anyagok a következők: gél képzésre alkalmas természetes polimerek: keményítő, agar, dextrán (1. ábra), cellulóz porózus üveg módosított szilikagélek szintetikus polimerek: akrilát alapúak, poli(vinil-alkohol) gél, polisztirol és poliakrilamid alapúak 1. ábra: Az agaróz és a dextrán polimer szerkezete A természetes polimer alapú állófázisok használata viszonylag egyszerű, ám mechanikai terhelhetőségük kicsi, ezért csak alacsony nyomást és alacsony lineáris áramlási sebességet alkalmazhatunk. Előállításukkoráltalában kisméretű keresztkötő molekulákat használnak például epiklórhidrint,divinilszulfont (2. ábra) vagy 2,3 - dibrómpropanolt -, hogy növeljék a kapott anyag merevségét, és hogy stabilizálják a gél makroretikuláris (makropórusos 1 ) szerkezetét. Ezek az anyagok a hagyományos SEC állófázisai: a csúcsok szélesebbek, kisebb hatékonyság és alacsonyabb felbontás érhető el velük. 2. ábra: Keresztkötő reagensek: epiklórhidrin és divinilszulfon 1 A IUPAC nómenklatúra a Ǻ pórusokat mezopórusoknak, az 500Ǻ-nél nagyobb átmérőjű pórusokat makropórusnak nevezi. [1] 10

11 A porózus üveg olyan kovasav alapú anyag, melyben úgy hoznak létre pórusokat, hogy erős sav segítségével kioldják az üveg bórvegyületekben gazdag fázisát. Ez a technika nagyon egységes pórusméretet eredményez. Mivel a vizes SEC segítségével biopolimereket vizsgálunk, a hagyományos szilikagél nem tudna eleget tenni annak a követelménynek, hogy ne lépjen fel kölcsönhatás az állófázis és a kérdéses molekula között, ezért módosított szilikagéleket alkalmaznak. Ezek merevebbek (rigidebbek) 1000 barig nagy mechanikai stabilitással bír, ezért ezek a nagy teljesítményű (HP-) SEC kolonnák töltetei - a természetes polimer alapú állófázisoknál. Az alkalmazhatóságnak a ph szab határt, általában 2-8 között stabil az állófázis. 2-es ph alatt a felületre szilanizálással felvitt csoportok hidrolízisének sebessége nő meg, míg 8-as ph felett a szilikagél alapját képező polikovasav oldódik fel. Mivel az elválasztást a pórusok mérete szabja meg, fontos ezek jellemzése, hiszen minél nagyobb a pórustérfogat, annál kisebb a munkagörbe meredeksége, így annál nagyobb a szelektivitás. Pásztázó elektronmikroszkóp által (ScanningElectronMicroscopy=SEM) a pórusok szerkezete jól láthatóvá válik. Higany porozimetriával a pórusméret eloszlás adható meg, míg nitrogén gáz adszorpcióval a fajlagos felület mérhető. Vizes méretkizárásos kromatográfiában használt mozgófázisok Az eluens rendszer megválasztásánál két fontos szempontot kell figyelembe venni. Az első, hogy a mozgófázisnak meg kell akadályoznia a biopolimer és az állófázis között lehetséges ionos vagy hidrofób kölcsönhatás létrejöttét. A második, hogy a vizes SECkel vizsgált makromolekulák főleg a fehérjék szerkezete jelentős mértékben változhat az eluens minőségének köszönhetően, ugyanis az oldószer polaritása, a hozzáadott só koncentrációja, az ionerősség, módosító szer (detergens) jelenléte és a ph nagyban befolyásolja a molekulák konformációját. A fehérjék szerkezete kb. 5-8 közötti ph értéken stabil. Ennek biztosítására puffereket használunk. A leggyakrabban használt ún. nem denaturáló puffer a TRIS trisz(hidroximetil)aminometán (3. ábra) - és a különböző foszfátok. Az előbbi pk a értéke 8 körül van, így maximális pufferkapacitása ph=8,3±1, míg a foszfátoknak 7,2±1. A hagyományos SEC-ben mindegyik alkalmazható, a nagy teljesítményű SECben használt szilikagél alapú állófázisok esetében azonban csak a foszfát pufferek. Bár ezek is a töltet tönkremenetelét eredményezik, a folyamat nem olyan gyors, mintha 8- as vagy afölötti ph-n működtetnénk a kolonnát. A pufferek ionerősségét 0,1-0,5M 11

12 értékre kell beállítani. Ezzel kiküszöböljük a fehérje adszorpcióját az állófázison, illetve megszüntetjük a savas jellegű fehérjék ionkizáródásának lehetőségét.módosító szerre a hidrofób kölcsönhatás eliminálása céljából van szükség. Erre példa a nem denaturáló nátrium-deoxikolát (3. ábra) és a denaturáló nátrium-dodecilszulfát (SDS) vagy a guanidin-hidroklorid (3. ábra). A fehérjék denaturációja a pontos molekulatömeg meghatározásánál jelent előnyt. 3. ábra: TRIS,Na-deoxikolát és guanidin-hidroklorid Vizes SEC alkalmazási területei, a vizsgált anyagok Elsősorban a bioanalitikában alkalmazzák: például fehérjék eltérő tömegű komponenseinek meghatározására, peptid keverékek, poli- és oligoszacharidok elválasztására, DNS fragmensek és nukleinsavak vizsgálatára. Olyan szintetikus polimerek jellemzésére is használható, melyek vízben oldódnak, például poli(vinilamin), poli(etilén-oxid), polietilénimin. A vizes SEC-ben használt detektorok Elterjedten alkalmazzák a SEC-LALLS (LowAngleLaserLightScattering = kis szögű lézer fényszórás detektor) technikát, s újabban az MS-sel való detektálást. E részben most csak az ELSD (EvaporativeLightScatteringDetector) működését tárgyaljuk részletesebben. Az elpárologtatással egybekötött fényszórás elvén működő detektor készülékének vázlatát mutatja a 4. ábra. Ennek az univerzális detektornak a működési elve a következő: a kolonnáról érkező folyadékot nagy sebességű nitrogén vagy hélium gáz segítségével porlasztjuk. Az aeroszol előállítása után az oldószereket fűtés hatására elpárologtatjuk, csak a nem illékony vizsgálandó részecskék maradnak vissza. Ezeket a kiülepedő anyagokat lézer vagy wolfram lámpával világítják meg, s mérik a részecske szemcséken létrejövő fényszórást. A szórt fényt fotométerrel érzékelik, mely a részecske méretével és koncentrációjával arányos. A mért jel és a koncentráció közti összefüggés nem lineáris, mely részint a polimerek méret szerinti eloszlásának 12

13 köszönhető. Nagy előnye (az RI detektorral sze mben) a gradiens elúciós technika alkalmazhatósága. 4. ábra: ELSD készülék vázlata A vizes SEC-kel kapcsolatos problémák tárgyalása A hagyományos SEC mérések viszonylag lassúak, akár több tíz percet is igénybe vehetnek, ezért vizsgálni kell a gyors SEC alkalmazhatóságának lehetőségét. A mérés idejének csökkentésére alapvetően három lehetőségünk van: A kolonna paramétereinek csökkentése: ekkor a kolonna kapacitása is csökken, ami előnyt jelenthet akkor, ha kevés minta áll rendelkezésünkre. A gyors SEC-ben alkalmazott kolonnák hossza változó, de belső átmérőjük rendszerint 4,6 mm. A hőmérséklet emelése: a hőmérséklet felső határát a vizsgálandó anyagok szabják meg, maximum 40 C-ig emelhető, mert efelett a fehérjék koagulálódhatnak és/vagy denaturálódhatnak, vagyis tönkretehetik a kolonnát. Az áramlási sebesség, térfogatáram növelése:ez a kisebb molekulák esetében alig, a nagyobb makromolekuláknál azonban jelentősen megnövelheti a HETP-t, vagyis rontja a hatékonyságot. Ezért maximum 3 ml/min térfogatáramot alkalmaznak. A méretkizárásos kromatográfiában is fontos, hogy ne terheljük túl a kolonnát. Hogy megállapítsák, mekkora a maximálisan vizsgálható minta mennyisége, a HETP-t vizsgálták az injektált térfogat és a minta tömegének függvényében. Ezek olyan olyan görbéket adtak, melyeken egy küszöbértékig konstans HETP, de utána nagyon gyorsan kezd nőni. Ezek alapján legfeljebb 0,2 ml mintaoldatot injektálhatunk, s benne a minta tömege nem lehet nagyobb 1mg-nál. Források: Dr. Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata 13

14 Journal of chromatographylibrary volume 40: Aqueoussize-exclusionchromatography, editedbyp.l.dubin Az Analitikai kémia II és műszerezés című tárgy Fehérjeanalitika előadásainak anyaga: anal/feherje-analitika%201%20-% fsz.pdf 14