ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA IV. NORMÁL ÉS FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA

HTML
DOWNLOAD

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA IV. NORMÁL ÉS FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA"

György Orbán
9 évvel ezelőtt
Látták:

1 ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor IV. FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK NORMÁL ÉS FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest 2015

2 KROMATOGRÁFIA FOLYADÉK / SZILÁRD ADSZORPCIÓS

3 NORMÁL ÁLLÓ FÁZISOK Szervetlen: SiO 2 - Al 2 O 3 MgO ZnO Florisil - TiO 2 - ZrO 2 stb. Szerves: Agaróz, polidextrán (Sephadex), poliakril amid polisztirol-divinil benzol, polimetil metakrilát alapú gélek, cellulóz, poliamid, csontszén, KÖTÖTT ÁLLÓ FÁZISOK (bonded phases) / \ NORMÁL (poláris) FÁZISOK FORDÍTOTT (apoláris) FÁZISOK OH (diol) (RP, reversed phases) CN (ciano) alifás alkil lánccal (C2, C4, C8, C18) NH 2 (amino propil) fenil N(CH 3 ) 1-3 i-propil (mono-, di-, trimetil amino) i-butil SO 3 H (szulfo propil) ciklohexil NO 2 (nitro) HILIC hidrofil kölcsönhatású HIC - hidrofób kölcsönhatású töltetek (anion- és kation cserélők) kromatográfiás töltetek

4 ADSZORPCIÓS FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA ÁLLÓ FÁZISA SiO 2 - Al 2 O 3 MgO ZnO TiO 2 ZrO 2 CaO CaSO 4 (gipsz) CaCO 3 Ca 3 (PO 4 ) 2 (hidroxi apatit) Mg-Al-szilikátok (Florisil) Csontszén (C PGC), cellulóz, poliamid LC HPLC ~ TLC

5 ADSZORPCIÓS FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA ÁRAMLÓ FÁZISA APOLÁRIS, vagy KÖZEPESEN APOLÁRIS OLDÓSZER (ELEGYEK) Kirkland szerint a legtöbb adszorpciós elválasztási feladat az alábbi nyolc oldószerrel, vagy optimális kombinációjukkal megoldható: hexán CH 2 Cl 2 CHCl 3 (metil-t-butil)éter CH 3 OH CH 3 CN THF H 2 O Más szerzők a növekvő elúciós erő (polaritás) sorrendjében hasonló oldószer (eluotróp) sorozatot ajánlanak: petroléter(hexán) ciklohexán széntetraklorid toluol diklórmetán éter kloroform aceton etilacetát propanol etanol víz ecetsav.

6 Az adszorpciós kromatográfia elválasztási folyamatainak tényezői (oxid típusú mezopórusos állófázisoknál) - Dipól-dipól, hidrogén-híd és -komplexek képződésén alapuló permanens, orientációs és indukált intermolekuláris kölcsönhatások. - A reverzibilis kötési tulajdonságokat elsősorban az adszorbens felületén igénybe vehető ún. aktív helyek száma és minősége határozza meg. - Az elválasztás mechanizmusa azon az elméleti megközelítésen alapul, hogy a különböző kölcsönhatások energiaváltozásainak eredményeként az adszorbens aktív helyein versengés van az elválasztandó anyagok és az oldószer molekulák között. - Az adszorbensek aktivitása egyrészt fajlagos felületükkel (m 2 g -1 ), másrészt - az elválasztandó vegyület típusokra specifikusabb és sokkal informatívabb adszorpciós erősségével (kromatográfiás aktivitásával) jellemezhető. - Az adszorpció erőssége vegyület csoportok szerint a következő sorrendben növekszik: - alkánok, telített szénhidrogének, - olefinek, - aromás szénhidrogének, - szerves halogén vegyületek, éterek, észterek, szulfidok, nitro-származékok, - aldehidek, - ketonok, alkoholok, - aminok, amidok, szulfonok, szulfoxidok, - karbonsavak.

7 A SZILIKAGÉL SZERKEZETE H H H O O H H O H H H O

8 RÉTEGKROMATOGRÁFIA Elválasztott frakciók Oldószer áramlás Iránya (front) Réteglap Minta felvitel helye (start) Oldószer (áramló fázis)

9 EGÉSZSÉGES ÉS DAGANATOS PAJZSMIRIGY MINTÁK LIPID TARTALMÁNAK RÉTEGKROMATOGRÁFIÁS VIZSGÁLATA TUMOR NOR CHOL TG SERUM

10 POLÁRIS ÉS APOLÁRIS LIPIDEK (ZSÍROK) TLC ANALIZISE EGYDIMENZIÓS KÉT LÉPÉSES ELVÁLASZTÁS 1. - LÉPÉSBEN: CHCl 3 -MeOH-AcOH ( ) 2. - LÉPÉSBEN: HEXÁN-ÉTER-AcOH ( ) ELŐHIVÁS: PMS

11 POLÁRIS ÉS APOLÁRIS LIPIDEK EGYDIMENZIÓS-KÉTLÉPÉSES RÉTEGKROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA ELŐHÍVÁS: SZENESÍTÉS

12 C:M:NH 4 OH POLÁRIS (FOSZFOR)LIPIDEK KÉTDIMENZIÓS RÉTEGKROMATOGRÁFIÁJA SiO 2 - HR C C:M:AcOH Előhivás: PMS

13 FOLYADÉK-FOLYADÉK MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA PAPÍRKROMATOGRÁFIA Consden, Gordon és Martin (1944) Cellulózrostok (por), szűrőpapír - vizes oldószer rendszerekkel FOLYADÉK-FOLYADÉK MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA Howard és Martin (1950) Normál fázis (SiO 2 ) squalen/paraffin olajjal SiO 2 Áramló fázis: poláris oldószerelegyek HIDROFIL KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography HILIC) Kötött normál poláris állófázisokon (ioncserélő, diol, ciano, amino, stb.) Vízzel (pufferrel) elegyedő apoláris oldószer (acetonitril, dioxán, THF), amely a töltet felszínén egy állandó, vízben gazdag réteget tart fenn és különböző poláris kölcsönhatások kialakulása révén az elválasztandó anyagok szelektív megoszlását eredményezi. (Alpert, 1990)

14 FORDÍTOTT FÁZISÚ (REVERSED PHASE, RP-LC RP-HPLC) FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA Prof. J.F.K. Huber Prof. Horváth Cs. Prof. Halász I.

15 Schematic illustration of the surface of the alkyl-silica bonded phases most widely used in reversed-phase chromatography. The octadecyl-silane junctions are bound via siloxane bridges to the surface of silica gel still containing some polar silanol residues. (Horváth és mtsai, 1966)

16 FORDÍTOTT FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA A fordított fázis (Reversed Phase, RP) elnevezés arra utal, hogy ebben a rendszerben az álló és áramló fázisok polaritása a normál fázisú rendszerekkel ellentétben fordított elrendezésű. Ennek megfelelően a fordított fázisú folyadék kromatográfiában áramló fázisként polárisabb oldószereket, leggyakrabban a víz és metanol, etanol, acetonitril, aceton, dioxán, n- és i-propanol, tetrahidrofurán, stb. elegyeit alkalmazzák. A normál és fordított fázisú folyadék kromatográfiás módszereket összehasonlítva: - a normál fázisú rendszerekben az elválasztást elsősorban az álló fázis és a minta kölcsönhatása határozza meg, míg - a fordított fázisok alkalmazásakor az elválasztást inkább a mozgó fázis tulajdonságai (polaritás, oldószer elegyek, adalékok) modulálják, A töltet-minta kölcsönhatása ebből a szempontból másodlagos tényezőnek tekinthető.

17 A FORDÍTOTT FÁZISÚ FOLYADÉK KROMATOGRÁFIA Az ELV Horváth Csaba professzor úr tolmácsolásában Horváth Cs.:Reversed-phase chromatography. Trends in Anal Chem 1 (1981) 6-12.

18 RP-HPLC ÁLLÓ FÁZISOK FEJLESZTÉSE MŰSZER FEJLESZTÉS Jellemzői - előnyei Egyszerű - hatékony - szelektív Gradiens elúció alkalmazható Vegyületcsoportok széles skáláján használható Sokoldalúan használható (RP + adalékok SAX, SCX) Detektálás (UV-VIS, FLU, RI, IR, LSD, VEZ, MS) tág lehetőségei Kereskedelmi termékek széles választéka Hátrányai Alacsony retenció az erősen poláris (ionos) vegyületekre Szolvát burok változása (dewetting, collapsing) Töltetek (SiO 2 ) instabilitása, tulajdonságai (ph, Si-OH), reprodukálhatósága

19 Daganatsejtek szfingomielin frakcióinak elválasztása HP-RP18 (25x0,46 cm, 5 m) oszlopon Izokratikus elúció, metanol-5 mm foszfát puffer, ph 7,4 (95:5 v/v) oldószerrel, T: 25 0 C, áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, detektálás: 205 nm. (Kremmer, 1988)

20 A B C Természetes oligo(poli)aminok danzil származékainak RP-HPLC elválasztása Nucleosil C18 oszlopon (20x0,46 cm, 5 m), 10 mm ammónium foszfát (ph 4,4)-acetonitril (1:1) és acetonitril-metanol (37:3) gradiens elúcióval. A Referencia vegyületek, B humán vizelet minta és C humán szérum poliamin spektruma. (Kremmer és mtsai, 1984)

21 Humán szérum savanyú alfa-1 glikoprotein (AGP) tripszines emésztési termékeinek elválasztása Vydac 218WP54 (300P wide pore C18, 25x0,46 cm, 5 m) oszlopon lineáris gradiens elúcióval, A víz - acetonitril (95:5) - 0,1% TFA és B - víz-acetonitril (5:95)

22 Nukleotid foszfátok (A - CMP, UMP, GMP, IMP, CDP, UDP, AMP, GDP, CTP, UTP, GTP, ADP, ATP) és a kritikus párok (B CMP-UMP, IMP-GMP, OMP-AMP) elválasztása fordított fázisú ion-pár folyadékkromatográfiával. Nucleosil ODS oszlop (25x0,46 cm, 5 m) lineáris gradiens elúció. Áramló fázis: 0,08 mm NaCl 0,025 M tetrabutil ammonium foszfát puffer (ph 6,0), Áramlási sebesség: 0,75 ml/perc, detektálás: 254 nm (Kremmer és mtsai, 1987).. A B

23 . Adenozin trifoszfát (ATP) retenciós tényezőjének változása az ion-pár RP-HPLC paramétereinek (NaCl, metanol) függvényében

24 KÖSZÖNÖM A FIGYELMET

Hasonló dokumentumok

NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMA- TOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLC

NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMA- TOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLC Az alkalmazott nagy nyomás (100-1000 bar) lehetővé teszi nagyon finom szemcsézetű töltetek (2-10 μm) használatát, ami jelentősen megnöveli