Antigén-ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló analitikai módszerek. Áramlási citofluorimetria (FACS) Konfokális lézerpásztázó mikroszkópia (CLSM)

Átírás

1 Antigén-ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló analitikai módszerek Áramlási citofluorimetria (FACS) Konfokális lézerpásztázó mikroszkópia (CLSM) Sándor Noémi

2 Ismétlés Mivel jelöljük az ellenanyagot Példa Mit detektálunk Milyen módszerben használjuk Enzim HRPO, AP Enzimreakciót (szubsztrát elhasítva világít/színt vált) ELISA, Western blot, immunhisztokémia Fluoreszcens festék FITC, PE, Alexa fetsékek, stb... Fluoreszcenciát (fényt) FACS, fluoreszcens mikroszkópia Fémkolloid arany, vas A fém tulajdonságait MACS, elektronmikroszkóp Radioaktív izotóp pl. 125 I Radioaktiv sugárzást RIA

3 Fluoreszcencia Egy gerjesztett molekula elektronátmeneteit (relaxáció) kísérő foton kibocsátás (emittáció) Egy foton elnyelése, az ABSZORBCIÓ (1) váltja ki (=lézerrel megvilágítjuk) Egy gerjesztett elektronállapot (S1 ) jön létre, mely először az alacsonyabb S1 vibrációs szintre relxál (2), majd Fluoreszcencia kibocsátás (=ezt detektáljuk) vagy egyéb relaxációs folyamatok (3) során visszatér az alapállapotba: a kibocsátott fluoreszcencia mindig hosszabb hullámhoszú, mint az elnyelt hullámhossz Ha a jelölt ellenanyag felismerte az antigént tudott kötődni van mit gerjeszteni a mintában van detektálható fluoreszcencia

4 Fluorofórok A flurofórok olyan molekulák, melyek képesek az elnyelt fényt jó hatásfokkal fluoreszcencia formájában kibocsátani (gerjeszthető elektronok) Természetes fluorofórok: Trp, Tyr, koenzimek, szteroidok, DNS/RNS (autofluoreszcencia) Gyakori szintetikus és szemi szintetikus fluorofórok: Fluoreszcein, Rhodamin, Etídium bromid, Propídium jodid, fikobiliproteinek (RPE, APC) Fluoreszcensen jelölt ellenanyagok Fluoreszcens próbák Pl. anti-cd4-fitc phalloidin-fitc (F-aktin próba)

5 Fluorofórok Fluorofórok lényeges paraméterei Gerjesztési (elnyelési, excitációs) spektrum Emissziós (kibocsátási) spektrum A spektrum megmutatja mely hullámhosszon optimális az adott fluorofór gerjesztése, és mely hullámhosszon célszerű detektálni

6 Miért jó fluoreszcens technikákat használni? pmol/l érzékenységű a radioaktív jelölés lenne hasonlóan érzékeny, de az veszélyes térbeli és időbeli feloldást is lehetővé tesz (határ: ns, ami a fluoreszcencia életideje) Felhasználási területek: spekrofluorimetria, excitációs és emissziós spektrumok mérése multiparaméteres fluoreszcens mikroplate reader, high troughput áramlási citofluorimetria (FACS) fluoreszcens mikroszkópia

7 Áramlási citofluorimetria (FACS) Előnyök Sejtenkénti multiparaméteres analízis (1 sejtről 2-6 paraméter meghatározása egyszerre) Nagy sebesség (akár sejt/perc) Sejtszortírozás lehetősége (tetszőleges tulajdonság alapján) Felhasználások Klinikumban: sejtpopulációk arányának, sejttípusok abszolút számának meghatározása, aktivációs állapot meghatározása, citokinek mérése Kutatásban: gyakorlatilag bármire : populációk mennyisége/minősége, sejtosztódás, sejtaktiváció, sejthalál, ionok, citokinek meghatározása

8 Áramlási citofluorimetria (FACS) Fluorescence Activated Cell Sorting Alapelvek Optikai szűrők és dikroikus tükrök Sejtszuszpenzió áramoltatása zárt keringési rendszerben Hidrodinamikai fókuszálás kis keresztmetszetű kapilláris fejbe Egyszerre 1 sejt megvilágítása lézerrel Sejtről érkező fluoreszcencia és fényszórás detektálása Adatok digitális feldolgozása és tárolása (1 minta=1 file a minta összes sejtjének összes paraméterét tartalmazza, fcs formátum)

9 Áramlási citofluorimetria Hidrodinamikai fókuszálás A minta laminárisan áramlik (köpenyfolyadék) Cytometry-A-Survey-and-the-Basics.html

10 Áramlási citofluorimetria Alapelvek Optikai szűrők és dikroikus tükrök Sejtszuszpenzió áramoltatása zárt keringési rendszerben Hidrodinamikai fókuszálás kis keresztmetszetű kapilláris fejbe Egyszerre 1 sejt megvilágítása lézerrel Sejtről érkező fluoreszcencia és fényszórás detektálása Adatok digitális feldolgozása és tárolása (1 minta=1 file a minta összes sejtjének összes paraméterét tartalmazza, fcs formátum)

11 Áramlási citofluorimetria Mit detektálunk? Fényszórás a megvilágító lézer fénye beleütközik a detektálandó részecskébe (sejt, gyöngy, stb), ez nem fluoreszcencia!!! Két típusa: előre szóródó (FSC=forward scatter) partikulum mérete oldalra szóródó (SSC=side scatter) partikulum granuláltsága Ezek mellett fluoreszcens jelek Cytometry-A-Survey-and-the-Basics.html

12 Áramlási citofluorimetria Fluoreszcens jelölés típusok 1. Fluoreszcens próbák 2. Jelölés specifikus ellenanyaggal direkt fluo jelölt ellenanyag jelöletlen elsődleges + fluo jelölt másodlagos (=indirekt) biotinnal jelölt elsődleges + fluo avidin B av

13 partikulumok (sejtek) száma paraméter #2 értéke Eredmények feldolgozása Általában sejtet analizálunk minimum statisztikailag értelmezhető, a populációt reprezentáló eredmény HISZTOGRAM 1 paraméter eloszlásának vizsgálata DOT-PLOT 2 paraméter eloszlásának vizsgálata 1 pont=1 sejt paraméter értéke paraméter #1 értéke A paraméter lehet fényszórás vagy fluoreszcens jel

14 partikulumok (sejtek) száma Eredmények feldolgozása A hisztogram eredményeinek értékelése, számszerűsítése paraméter értéke Paraméter intenzitásának középértéke (általában fluo)

15 Eredmények feldolgozása A hisztogram eredményeinek értékelése, számszerűsítése M1 M2 Nem mindig homogén a populáció az adott paraméterre CD4+ CD4- Markerekkel kijelölhetjük a populációkat, ezekre utána ugyanolyan statisztika kérhető, mint a homogén (egy csúcsú) hisztogramra, pl. fluoreszcencia intenzitás középértéke Pl. CD4 sejtek arányának meghatározása T-sejt szuszpenzióban, jelölés: anti- CD4-FITC

16 Eredmények feldolgozása A hisztogram eredményeinek értékelése, számszerűsítése Több minta (=file) egyidejű vizsgálata = hisztogram overlay Pl. adott marker eloszlása negatív kontrol (=nem stimulált) és pozitív kontrol (=stimulált) minta sejtjein Erre is kérhető statisztika, markerezhető (természetesen mintánként külön adja meg az eredményeket)

17 Eredmények feldolgozása A dot-plot eredményeinek értékelése, számszerűsítése Hány sejt van itt? Kapuzás (gate) Konkrét százalékot, darabszámot határozhatok meg, illetve további kiértékeléseket kérhetek erre a populációra Kvadráns analízis

18 sejtszám sejtszám Eredmények feldolgozása A dot-plot eredményeinek értékelése, számszerűsítése Kapuzás felhasználása példa: Emberi monocitákon milyen mértékben fejeződik ki a CD4 a T-sejtekhez képest??? Ha nincs kapuzás Emberi fehérvérsejtek CD4 jelölés CD4 jelölés Ha van kapuzás = minden, nem a kapuba eső sejtet figyelmen kívül hagy az adott elemzés szempontjából

19 Eredmények feldolgozása 2 paraméteres dot plot Eredmények feldolgozása

20 FL-2 : anti-cd8 Kvadráns-analízis (pl. T sejt populációk a timuszban) Eredmények feldolgozása 2 paraméteres dot plot, példa érett, CD8+ citotoxikus T-limfocita (5-7%) TÍMUSZ éretlen, CD4+ és CD8+ T-limfocita (~ 80 %) éretlen, CD4- és CD8- T-sejt (3-5 %) FL-1 : anti-cd4 érett, CD4+ helper T-limfocita (~ 10 %) ( sejt)

21 Sejtpopulációk a lépben. Kvadráns analízis limfocita markerekkel Eredmények feldolgozása 2 paraméteres dot plot, példa B limfociták TÍMUSZ FL-2 : sigm spec. antitest Nincs kettősen pozitiv sejt! T limfociták nem limfoid sejtek FL-1: anti-cd3

22 FL-2 : anti-cd8 Sejtpopulációk a lépben. Kvadráns analízis limfocita markerekkel Eredmények feldolgozása 2 paraméteres dot plot, példa érett, CD8+ citotoxikus T-limfocita (10-15%) LÉP Nincs kettősen pozitiv sejt! B limfociták nem limfoid sejtek FL-1 : anti-cd4 érett, CD4+ helper T-limfocita (~ %)

23 paraméter Fluoreszcencia időbeli követése Eredmények feldolgozása Gyors (percek alatt lejátszódó) biokémiai folyamatok követése idő Pl. intracelluláris Ca+ koncentráció követése Ca+ próbával, ami ha Ca-ot köt, intenzívebben emittál adott hullámhosszon

24 Áramlási citofluorimetria felhasználási területei Sejtfelszíni receptorok jelölése (pl. 18. dia, CD4 expresszió monocitákon) sejtpopulációk elkülönítése (pl. lép CD4+ és CD8+ T-sejt összetételének meghatározása) sejtizolálás hatékonyságának ellenőrzése sejtszortírozás áramlási citometriával aktivációs markerek detektálása Monociták (CD14+) tisztítása vérből M1 Igen/nem válasz Saha, CMGH, 2016 Expresszió fokozódás Tisztítás előtt sok CD14- (=nem monocita) sejt Tisztítás során eltűnnek a CD14- sejtek (=tisztítás sikeres, a sejtszuszpenzió már csak monocitákból áll) Speciális, szortírozásra képes áramlási citofluoriméter képes szétválogatni az általam kijelölt sejtpopulációt, pl. az M1 markerrel azonosított CD14+ sejteket.

25 Áramlási citofluorimetria felhasználási területei Intracelluláris molekulák jelölése - intracelluláris receptorok jelölése (pl. TLR9) - jelátviteli molekulák foszforilációs állapotának meghatározása (foszforilált formára specifikus fluoreszcensen jelölt ellenanyagokkal) - citokin termelő sejtpopuláció azonosítása - DNS jelölés (sejtosztódási fázisok (G1, S, stb) és sejthalál meghatározása) A sejtfelszín jelölése is lehetséges ezzel párhuzamosan! Ha adott citokint termelő sejtpopulációt szeretnénk azonosítani, akkor mivel ezek szekretált proteinek, gátolnunk kell a sejtkeből való kijutásukat (más esetben ez a lépés nem szükséges)

26 Áramlási citofluorimetria felhasználási területei citokin termelő sejtpopuláció azonosítása

27 Áramlási citofluorimetria felhasználási területei Halott sejtek jelölése: propídium jodiddal (PI, DNS interkaláló festék) Citotoxicitás vizsgálata (pl. gyógyszerek) Halott sejtek kizárása a mérésből PI

28 Áramlási citofluorimetria felhasználási területei Ionok szintjének detektálása Pl. Ca ++ koncentráció változása sejtaktivációkor Fluo4AM festékkel (ez nem ellenanyag jelölés, hanem fluoreszcens próba) Atkinson, 2010, Blood A festék fluoreszcenciájának intenzitása a Ca A ++ koncentráció növekedésével párhuzamosan nő. Ezt tudjuk időben követni. Atkinson, 2010, Blood

29 Áramlási citofluorimetria felhasználási területei Sejtosztódás detektálása az újonnan szintetizált DNS fluoreszcens jeölésével (BrDU) fluoreszcensen jelölt sejtek osztódáskor bekövetkező fluoreszcencia csökkenés követésével (CFSE) BrDU az újonnan szintetizálódó DNS-be épül jelölése fluoreszcens anti-brdu-val Luzyanina, 2007, TBMM

30 Fluoreszcens mikroszkópia Szelektíven csak a számunkra érdekes molekulákat látjuk Térbeli és időbeli meghatározás a minta előkészítése gyakorlatilag azonos a FACS-al és IHC-val lokalizáció meghatározására elsősorban a sejtekről érkező fluoreszcens jelet detektáljuk Fényforrás: lámpa/lézer A sejteknek nem kell szuszpenzióban lenni Lassabb (adott idő alatt kevesebb sejtről nyerünk adatot) Információ a vizsgált molekula lokalizációjáról FACS

31 Fluoreszcens mikroszkópia-konfokális (konfokális) mikroszkópia CLSM: confolal laser scanning microscope A nem a fókuszsíkból származó fluoreszcencia kizáródik (Ez a pinhole a gerjesztő fény fókuszálására van)

32 A konfokális Konfokális mikroszkópia előnye előnye

33 Konfokális mikroszkópia Többféle fluoreszcensen jelölt molekula egyidejű térbeli vizsgálata (kolokalizáció)

34 Konfokális mikroszkópia Transzkripciós faktorok magi traszlokációja

35 Konfokális mikroszkópia Fagocitózis detektálása

36 Konfokális mikroszkópia Intracelluláris Ca ++ jelölése (ezt sima fluoreszcenssel is lehet) Atkinson, 2010, Blood