Szerkezeti proteomika módszerei II.

Átírás

1 Bevezetés Potei fehéje: Szekezeti poteomika módszeei II. ~ 50 amiosavál hosszabb polime lác < > peptid 0 féle amiosav Dihedális szög: két sík szöge Köcsöhatások sokfélesége

2 Glici Poli Ramachada plot geeated fom huma PCNA, a timeic DNA clamp potei that cotais both β sheet ad α helix (PDB ID 1AXC). The ed, bow, ad yellow egios epeset the favoed, allowed, ad "geeously allowed" egios as defied by PoCheck Fehéje alfa helikális és béta edős szekezete Poteomika the study of a ogaism's complete complemet of poteis Azoosítás fukció feldeítése Poteom: The etie set of poteis expessed by a geome, cell, tissue o ogaism i a give type of cells o a ogaism at a give time ude defied coditios. The 35,000 gees i the huma geome ca code fo at least te times as may poteis; i exteme cases a sigle gee aloe ca code fo ove 1,000. Szekezeti poteomika Szekezeti poteomika módszeei I. potei poductio solutio of the stuctues via molecula biology X ay cystallogaphy NMR electo micoscopy mass spectomety bioifomatics the high thoughput pocedues fo potei poductio, to the solutio of the stuctues of poteis ad highe ode etities, via a multidiscipliay appoach ivolvig molecula biology, X ay cystallogaphy, NMR ad electo micoscopy, as well as bioifomatics aalysis (+Mass spectomety). Szekezet fukció

3 Szekezeti poteomika módszeei I. potei poductio solutio of the stuctues via molecula biology X ay cystallogaphy NMR electo micoscopy mass spectomety bioifomatics Biológiai edszeek szekezetét a kötések hieachiája jellemzi Atomok Molekulák Makomolekulák: pl. fehéjék O C N S. -hidak. Va de Waals. kölcsöhatások Néháy szó a fotosabb módszeekől (szekezeti poteomika I.) elsődleges kötések m De: sóhidak S-hidak is 1. A ötgekisztallogáfia módszee fehéjéke alkalmazva Méés feltétele: A fehéje kistályosítása A ötgekisztallogáfia módszee fehéjekisztallogáfia 1D diffakció Abbé-elv féye dsiω kλ legkisebb " d" λ d jeletése itt: - kötéstávolságok a kistályba - kistály-potok : molekulák atomi távolságai Rötgesugaak itefeeciája kistálysíkokól tötéő eflexióál : Bagg-egyelet fede beesés, 3D Laue egyeletek a(cosα cosα0) hλ b(cos β cos β0) kλ c(cosγ cosγ 0) lλ cos α + cos β + cos γ 1 d ~ 0.1 m λ ~ 0.1 m ötgesugázás!

4 A szekezetmeghatáozás meete A méőedsze Mookomatikus ötge-yaláb előállítása kistályo való diffakcióval Fouie aalízis Kis-szögű ötgeszóás Szóási szög függvéyébe mét itezitás. Tömegspektometia Alapja: molekulák m/z paaméteéek meghatáozása ioizált állapotba - makomolekulák 10-1 g-ja aalizálható elektomos mágeses E ki Loetz 1 mv e ő ZeV gyos F ZevB v m gyosítás és eltéítés m/z Scatteig of x ays is caused by diffeeces i electo desity, scatteig of eutos is caused by diffeeces i scatteig powe of diffeet uclei. d λ siω a az itefeeciát kis szög alatt figyeljük meg, ezek a maximumok a agyobb szekezeti egységekhez tatozak detekto A mét szög függvéyt modell illesztéssel étékeljük ki.

5 A méőeledezés 10,1 kda basta MALDI Time Of Flight módsze Matix-Assisted Lase Desoptio/Ioisatio N-temiális Methioi többlet m v ZeV t l TOF m ZeV Fagmetáció elektospay ioizációs módszeel Ioizációs techikák Elektobombázás Iobombázás Kémiai ioizáció Elekto-spay MALDI MALDI 3. NMR spektoszkópia Mag mágeses ezoacia elv alkalmazása a makomolekulákba külöböző kémiai köyezetbe levő azoos fajta atommagok (1, 13C, 15N) megkülöböztetésée. Kiválasztott atommagok mágeses dipólusaiak kölcsöhatásából atomi távolságok is meghatáozhatók NMR spektumok C 13 Bezol: azoos C-atomok hf ( ) μb 1 σ 0 Lamo fekvecia spektométe Toluol: metil-csopot miatt 5-féle C-atom Kémiai eltolódás hf1 hf hf 0 Pl. tetametilszilá ω1 ω ω 0 ( ppm ) Áyékolási effektus σ A külső té petubálja az atomi és molekuláis pályák elektojait Más köyezet->más f

6 Több dimeziós és koelációs NMR módszeek 4. Elektomikoszkópia Az elekto yaláb hullámtemészete ayag hullám λ h mv kv al gyosított elektook > agy sebesség, λ kicsi > agy felbotás? d λ um. ap. kicsi techikai okokból ige kicsi ~ 10 3 Az elektomikoszkóp felépítése d 0.5 m Nagyobb szekezeti egységek Pobléma: mitaté vákuumba! Szekezeti poteomika módszeei II. Molekulák közötti kölcsöhatások biológiai edszeekbe A kuzus célja éháy olya szekezet meghatáozó módsze észletesebb ismetetése, amelyek Az Itézetbe eléhetők, haszálatosak A gyos, elsődleges poteomikai szekezet meghatáozó módszeek eedméyeie építeek, abból idúlak ki A fukciók szempotjából fotos, további szekezeti potosításokhoz vezetek Általába valamely külső petubáció hatásáa adott válasza alapozak A szekezetet meghatáozó kölcsöhatások eősségét tesztelik Molekulaszekezetek kovales kötései kémia Elektosztatikus kölcsöhatások 1. Coulomb kölcsöhatás q 1 és q pottöltések távolságba? poteciális eegia E Cb q1 q (elatív) dielektomos álladó

7 A elatív dielektomos álladó ( dielektikum : elektomos té áthatol az ayago Faaday) Két fotos közeg víz 80 apoláos hidokabook ~ Defiició: kodezáto kapacitása alapjá C C C fegyvezetek között vákuum U o fegyvezetek között dielektikum U < U o dielektikum kivétele U U o (q o q) q U o, C o Eo > 1 E q U o E C > C F q o [ Newto N ] Coulomb C U elektomos téeősség A dielektikum észecskéi polaizálódak elektomos tébe: a fegyvezete táolt töltés eőtee csökke pl. Na + és Cl - 80, 0.3 m Nagy dipólusmometumu vízmolekulák E Cb ~5.4 kj/mól ~ xrt Gyege kölcsöhatás! Jeletőse módosítják az elektosztatikus kölcsöhatásokat E Cb NaCl disszociál vízbe q1 q töltések eloszlását statisztikus fizikai modellek íják le A Coulomb-poteciál temodiamikai ételmezése ioos oldatba A Coulomb poteciál ból számaztatott hidatációs eegia Bo eegia E Cb az elektosztatikus té mukáját adja meg álladó hőméséklete és yomáso miközbe a töltések távolsága végteleől -e változik E Cb a G Gibbs poteciál-változásak felel meg ΔG Δ ΤΔS miét lehet a Cb-poteciálak etopikus jellege? 80 q Δq q q q G ΔG q dq ' δ ' δ 1 ' ' q o Pl. vizes közeg q q q q S δ G δ 1 1 Δ Δ ( ) δ ΔG 1 δ δt δt δt δt víze: /K TΔS (T300K) -1.38ΔG a Cb poteciál elle hat! A Cb poteciál emcsak a kötési eegiát fedezi (Δ), haem az iookak a vízmolekulákat edező (S csökke!) hatását is! A végzett muka ha egy dielektomos álladójú közegbe, egy -sugaú üegbe q töltést viszük be pl. hidatációs eegia Mekkoa a végzett muka, ha egy iot (Na + ) vízből egy makomolekula v. lipid membá belsejébe akauk átvii? ΔG total ΔG( 80) ΔG( ) 355kJ / mól Nagy éték! m, io-ádiusz Rashi, A.A., oig, B. (1985) Reevaluatio of the Bo model of io hydatio. J.Phys.Chem. 89, 5588

8 . Dipól-kölcsöhatások pottöltés dipól, dipól dipól, statikus dipól, fogó dipól, idukált dipól Egyszeű példa: pottöltés álló dipólus q' q q' q E el. sztat. + ha l << + q m cosθ q -- -q θ l +q + m q' l dipólus-mometum eősebbe csökke a távolsággal Ted: miél boyolultabb töltéseloszlások hatak kölcsö, aál eősebbe csökke az eegia a távolsággal m m Pl. két dipólus 1 EMozgóDipDip 6 + oietációs mozgás 3 kt Setlow ad Pollad: Molecula Biophysics, Chpt.6, Palo Alto, Addiso-Wesley, 196 szabad otáció csökketi a kh. eősségét és övidíti a hatótávolságot Egy külöleges dipól kölcsöhatás Diszpeziós kölcsöhatás va de Waals kölcsöhatás (Lodo féle eő) dipólus-mometum Megjegyzések: -- α molekulák polaizálhatósága : m α E -- E diszp helyett víz >> víz 1 α1 α I1 I I + I 1 E MozgóDipólok -- fomula évéyes, ha >> l << E Diszp -- speciális eset: hosszúkás alakú II hidokabo lácok fehéjék, membáok lipidjei elektomos téeősség Ezt a faktot ehéz általába elméletileg meghatáozi, empiikus módszeekkel hatáozzák meg E 1 diszp 5 Az elektosztatikus kölcsöhatások poteciális eegiájáak távolság függése, és átlagos eegiája idogé-hidas szekezetek Kölcsöhatás Eegia-függvéy távolság-függése Átlagos kölcsöhatási eegia (kj/mól) io-io io - álló dipólus 10-0 álló dipólus - álló dipólus dipólus dipólus hőmozgás mellett diszpeziós kölcsöhatás Kölcsöhatás összetett: - kovales A---B - elektosztatikus - diszpeziós elektoegatív pilléatomok: O, N, F d Nagysága széles tatomáyba fodulhat elő 3-4 kj/mól kj/mól alifás széhidogéek ezimatikus katalízis 1 35 kj/mól biológiai makomolekulák d < va de Waals ádiuszok összege Víz - szekezetek O.O Δ (kj/mól) gáz -3 folyadék -14 jég Redkívüli tulajdoságok

9 idogé-hidas szekezetek Biológiai makomolekulák tészekezetéek kialakulása idofób kölcsöhatás biológiai makomolekulák belső szekezetébe ige jeletős speciális szempotok: - kötéseősség függ a köyezettől - em a Δ haem a ΔG vezéli? A.O + B..O A.B + O..O - amidok és kaboil csopotok eőse poláosak, de -kötés csökketi a polaitást -kötések eősebbek a fehéjék és lipid membáok belsejébe - etwok fomációk: -doo atom töltéseloszlása megváltozik ő az elektoegativitás jobb akcepto lesz víz-klaszteek kialakulása, -kötések lácolata fehéjékbe Iocsatoa-fehéje sejtmembába ágyazva foszfogliceát kiáz ezim víz-dobozba Az apoláos széhidogé-lácok egymás felé fodulva a víz-molekulákkal való kölcsöhatásokat csökketik - hidofób effektus Weihold, F. (1997) Natue of -bodig i clustes, liquids ad ezymes. J.Mol.Stuct. 398, 181 idofób kölcsöhatás temodiamikai ételmezés elv: széhidogéek és víz kölcsöhatása eegia-befektetést igéyel idatációs eők víz - víz széhidogé - széhidogé dipól dipól diszpeziós kh. ERŐS Mi hajtja a szegegációt? víz széhidogé keveedés: Δ 0 Jellegzetes hőméséklet-hatás Magas T diszpeziós kh. eősödik víz-oietáció gyegül ΔS szeg ~ ΔS oldott,de Δ<<0 > ΔG ΔG szeg -ΔG oldott <0 magas hőméséklet: -dive Dill, K.A. (1990) Domiat foces i potei foldig. Biochemisty 9, 7133 O O víz Alacsoy T (RT): A víz molekulák edezett szekezetet alakítaak ki egymással az apoláos molekula felületéél S csökke, de szegegációál kevésbé, Δ ~0 ΔG Δ TΔS ΔG szeg -ΔG oldott < 0 A szegegált és az elkeveedett állapot közötti külöbség: szegegált állapotba a edezésből eedő etópia-változás kisebb alacsoy hőméséklet: S-dive Makomolekulák felületi töltései kölcsöhatak víz-molekulákkal. Molekula molekula kölcsöhatáshoz a kötött vízmolekulákat le kell választai. A kötött víz-molekulák helyettesítése agy eegia-befektetést igéyel. Rövid távú kh. hid ~ 0.1 el.sztat Külööse jeletős: fehéjékél lipid membá-felületekél Abel, S., Fekel, D. (011) Accoutig fo potei-solvet cotacts facilitates desig of o-aggegatig lattice poteis. Biophysical Joual, 100, 693

10 π elekto katio kölcsöhatások töltés kvadupól (két dipól) és töltés idukált dipól jelleg E kh 1 3 Galliva, J.P., Doughety, D.A. (1999) Catio- π iteactios i stuctual biology. PNAS 96, 9459 (000) JACS 1, Vizes közeg kevésbé csökketi mit a Cb-kh eegiáját E 0. 5 E víz de E ~ 0. 5 E Cb E Cb víz 0.05 E Cb aomás széhidogé Tp Ty Phe Kovales (atomi/kémiai) kötések eegetikai leíása amoikus poteciállal közelítik a kötés egyesúlyi paaméteei közelébe: amoikus ezgés a kötés meté f φ m E kov kötéseősség 1 φ ( x x ) 0 egyesúlyi kötéstávolság méése IR spektoszkópiával : f φ C C kötés yújtása : φ 75x10 3 kj/mól(m) pl m yújtás E > 10 RT asoló hamoikus poteciálok a kötés szögek függvéyébe is. kötések köüli elfodulások eegiája ~ RT Eddig vozó kölcsöhatások Kötések kialakulása: szteikus gátlás mellett Atomi ádiuszok külöböző kölcsöhatásokba E pot B m taszítás m> Elem Redszám Va de Waals sugá (m) Kovales sugá (m) Iosugá (m) 1 0,10 0,037 + Io E pot A vozás C 6 0,170 0,077 0,09 C + N 7 0,155 0,075 0,05 N + O 8 0,15 0,073 0,140 O - kölcsöható észecskék távolsága o egyesúlyi kötéstávolság E k kötési eegia Atomi ádiuszok ételmezése F 9 0,147 0,071 0,117 F - P 15 0,180 0,106 0,058 P 3+ A kötéstávolság ( o A + B ) és kötési eegia E k a kölcsöhatási eegiafüggvéyek kokét függvéy-alakjától függ ( a és b) S 16 0,180 0,10 0,184 S -

11 Szteikus gátlás a Pauli elv alapjá: Lead Joes poteciál A makomolekulák szekezete és komplex-képzése a köyezeti molekulákkal való kölcsöhatás jelelétébe eegia-miimum-állapotot jelet A taszító poteciált az elektofelhők átlapolása okozza övid hatótávolságú kölcsöhatás A vozó kölcsöhatást a diszpeziós/va de Waals poteciál adja: E LJ ( ) ( ) ) E0 Kötési eegia 44 kda tomapeoxidáz ezim víz-io köyezetbe Zöld: fehéje Sága: iook Pios-fehé: vízmolekulák További szeveződés sejtes szite molecula cowdig Pios: akti filametumok Kék:sejtmag A biológiai folyamatokba az eegia-miimum-elvek statisztikus jelleggel évéyesülek. Kötések folyamatosa felszakadak és újaépülek, a kötéseősségek hieachiája alapjá szekezeti diamika Zöld:micotubulusok

12 Boltzma eloszlás Boltzma eloszlás N függetle észecske - k, i, j 1, 0, 0 i T, temikus egyesúly, - edsze egy mikoállapotába egy észecske eegiája (Az összes észecske kokét eegiaállapota defiiálja) Az N függetle molekulából álló edsze teljes eegiája i i i E N a betöltési számok egy kokét soozata jeleti a edsze egy makoállapotát { 0, 1,... } p Z i i e Z i kt t i kt e i Ne Z i kt Boltzma eloszlás fotos összefüggések Aak valószíűsége, hogy adott i eegiájú állapot a edszebe megvalósul állapotösszeg i 0 i 0 e kt Δ e kt Boltzma fakto Két eegiaállapot elatív betöltöttsége Boltzma eloszlás összhagba a tapasztalattal Mit étsük a biológiai ayag szekezeté? Pl. makomolekuláis kofomáció? N,T temikus egyesúly Eegia-miimum ige sokféle kölcsöhatás k, k i, i Ne i Z i kt T 3 >T >T 1 Foszfogliceát kiáz Rötgekisztallogáfia NMR T 3 >T >T 1 1, 1 0,, 0 j o j o e kt Δ e kt A kofomáció sok mikoállapot időbeli és tébeli eedője őméséklete ézékey

13 Molekuláis/makomolekuláis szekezetet kialakító kölcsöhatások Szekezeti ed testhőméséklete T310 K E k ~ elsődleges kötések : kovales ioos 6 ev/kötés fémes E k ~ másodlagos kötések -híd éháyszo x 0.1 idofób kölcsöhatás ~ 0.1 va de Waals dipól pottöltés ~ dipól dipól ~ 0.0 dipól idukált dipól ~ 0.01 időleges dipól ~ 0.0 (diszpeziós) Kédés: va-e olya kötés a szekezetbe, ahol az eegiaállapot a kötött állapothoz képest éppe a kötési eegiával magasabb? többlet-eegiával bíó kötések száma e elektovolt kötött 1 ev 3 kcal/mole ~ ~ 100 kj/mole kt ~ 0.07 ev T310 K, k1.38x10-3 J/K Boltzma álladó RT ~.6 kj/mól Ek kt N kt E k Szekezeti ed testhőméséklete T310 K Szekezeti ed testhőméséklete T310 K Kédés: va-e olya kötés a szekezetbe, ahol az eegiaállapot a kötött állapothoz képest éppe a kötési eegiával magasabb? többlet-eegiával bíó kötések száma kötött e kt ~ 0.07 ev RT ~.6 kj/mól Ek kt N T310 K, k1.38x10-3 J/K Boltzma álladó kt E k 0.07 ev E k Másodlagos kötések -hidak pl. E N e 01. ev o.1ev o. o7ev e Temikus okokból elsődleges kötések em szakadak fel testhőméséklete (1-7 kcal / mole) % A másodlagos kötések jeletős számba felszakadtak testhőméséklete szekezeti diamika 3.7 idofób kölcsöhatások, va de Waals kölcsöhatások k elsődleges -> va de Waals/diszpeziós E k kt

14 A szekezeti diamika alapvetőe fotos szeepet kap a biológiai makomolekulák fukcioális kölcsöhatásaiba tomapeoxidáz ezim aosecudum-os időtatomáy foszfogliceát kiáz ezim millisecudum-os időtatomáy