Autoimmunitás és az érbetegségek kapcsolata

Autoimmunitás és az érbetegségek kapcsolata Prohászka Zoltán az MTA doktora III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Kutatólaboratórium prohoz@kut.sote.hu 2010-11-17

Kérdésfelvetés Az atherosclerosis kialakulásának mechanizmusai között autoimmun folyamatok is szereppel bírnak Megváltozott saját Autoimmun betegségekben akcelerált atherosclerosis alakul ki Elhúzódó gyulladás, károsodott saját struktúrák folyamatos jelenléte

Egy betegség autoimmun eredete valószínű, ha A betegség az autoantigénnel való immunizálással kiváltható (Hsp-re igaz, béta-2 GPI-re igaz, oxldl-re nem igaz, sőt!) Ha passzív transzferrel egyik egyedről a másikra átvihető (ApoE KO egér modellben igaz) Ha az immunmoduláló terápiának hatása van (IVIG és anti-cd40 ligand antitest esetében leírták egér modellben, endotoxin növel)

Mi utal arra, hogy az atherosclerotikus léziók kiváltásában immunológiai tényezők játszanak elsődleges szerepet? A lipidek lerakódása előtt kimutatható Immunglobulin depozitum Komplement depozitum T-sejtes majd makrofág infiltráció A sejtes elemek aktiváltak, feltehetően immunológiai felismerés történik T sejtek CD4, HLA-DR és IL2R pozitívak. Az antigénprezentáció a VALT-ban történik, ahol dendritikus sejtek hálózatát írták le. Citokin, kemokin és növekedési faktor termelés mutatható ki. Az antigénprezentációban az endothelsejtek feltehetően nem játszanak fontos szerepet, MHCII expressziójuk másodlagos. B-sejtek alig mutathatók ki a léziókban

A lehetséges, felismerésre kerülő megváltozott saját antigének A hősokkfehérjék (Wick et al., és saját munkánk) A lipoproteinek (oxldl, E-LDL, glikált-ldl) A béta-2 glikoprotein I

A Hsp-immunitás 6 alaptétele Saját Hsp Immunizáló Hsp Mechanizmus Példa Védő immunitás: Tsutsugamushi láz Valódi autoimmunitás Diabetes mellitus Nem-Hsp fehérje Immunitás a Hsp által kötött peptid ellen Adjuváns arthritis Daganat immunterápia PAMP, immunológiai felismerés környezete Vészjel Chaperokine?, a neuroendokrin és az Endogén szignál? Immunrendszer közötti folyamatok szabályozása

A hősokkfehérjék (hsp60) mint lehetséges autoantigének Nyulak immunizálása hsp65 tartalmú anyaggal atherosclerosishoz vezetett Az immunizálás során keletkező antitestek és T-sejtek felismerik az adott állat hsp60 molekuláját (nagyfokú hasonlóság, immunológiai keresztreakció) Minden emberben kimutatható anti-hsp60 antitest és T-sejt is Atherosclerosis is the price we pay for protective immunity to bacterial infecitons-g.wick

A hsp60 kimutatható a léziókban A hsp60 mrns és fehérje expressziójának fokozódását ugyanazok a tényezők váltják ki, mint amelyek endothel diszfunkciót okoznak (nyíróerő, oxldl, peroxid, hő-stressz, LPS, TNFa, ) A fokozott expressziót EC-n (artériás és humán) és makrofágokon is kimutatták Az anti-hsp60 antitestek ADCC és komplement mediált lízis útján károsítják is ezeket a sejteket Ismertek elektronmikroszkópos vizsgálatok is, melyek a sejtek hsp60 tartalmának kb. 20%-át detektálták extramitokondriálisan

Mikroorganizmusok Hsp expresszió védelem Poliklonális anti-bakteriális hsp60 antitestek Keresztreagáló Keresztreagáló Nem-keresztreagáló Hsp60 Hsp60 EC EC EC Van patogén antitest Nincs antigén Nincs betegség Van patogén antitest Van antigén Van betegség ár Nincs patogén antitest Van antigén Nincs betegség

Az anti-hsp eredet klinikai bizonyítékai A Bruneck vizsgálat eredményei (A. carotis) Mind keresztmetszeti, mind utánkövetéses megközelítés szerint találtak összefüggést Szoros összefüggés mutatkozott az anti-hsp65 antitestek szintje és a krónikus légúti fertőzések között. Más kórokozókkal (pl. H. pylori) csak az alacsony szociális státusszal rendelkezőkben mutatkozott összefüggés. Számos további, pl. ISZB-re vonatkozó bizonyítékot publikáltak az elmúlt időben. Ezek a megfigyelések megerősítették a keresztreagáló antitestek elméletet.

Van-e még keresnivalónk az anti-hsp60 autoimmun eredettel kapcsolatosan? Patkányokat hsp65-tel immunizálva arthritist lehet (törzsspecifikus) indukálni. Koleszterin etetett nyulakat immunizálva atherosclerosist. Egyes vizsgálatok nem találtak direkt összefüggést a krónikus fertőzések (pl. C. pn., HP, CMV) jelenléte és az anti-hsp antitestválasz között. Epitópanalízis, funkcionális jellemzés

A lehetséges, felismerésre kerülő megváltozott saját antigének A hősokkfehérjék (Wick et al., és saját munkánk) A lipoproteinek (oxldl, E-LDL, glikált-ldl) A béta-2 glikoprotein I

A humán komplementrendszer Klasszikus út (immunkomplex, CRP, CMV, C1, C4, C2) Lektin út (szénhidrátok, MBL, ficolin, MASP, C2, C4) Alternatív út (idegen felszín, koleszterin, módosított lipidek E-LDL, B, D) C3 C5 C5b-9m (MAC) Anafilatoxinok (C3a, C5a) Membránkárosító komplex (sc5b-9)

A humán komplementrendszer Klasszikus út (immunkomplex, CRP, CMV, C1, C4, C2) Lektin út (szénhidrátok, MBL, ficolin, MASP, C2, C4) Alternatív út (idegen felszín, koleszterin, módosított lipidek E-LDL, B, D) C1-INH C4BP, I-faktor S fehérje, Clusterin C3 C5 C5b-9m (MAC) H-faktor, I-faktor Anafilatoxinok (C3a, C5a) Membránkárosító komplex (sc5b-9) CRI, DAF, MCP, CD59

A humán komplementrendszer Klasszikus út (immunkomplex, CRP, CMV, C1, C4, C2) Lektin út (szénhidrátok, MBL, ficolin, MASP, C2, C4) Alternatív út (idegen felszín, koleszterin, módosított lipidek E-LDL, B, D) C1q-R CR2 CR1 CR3 CR4 C3 C5 C5b-9m (MAC) C3a-R Anafilatoxinok (C3a, C5a) Membránkárosító komplex (sc5b-9) C5aR

C-reaktív fehérje Ligandjai: Foszfo-kolin Kromatin Hiszton Fibronectin snrna Laminin Polikationok Foszfo-etanolamin In vitro hatások: pro-inflammatorikus anti-inflammatorikus Komplement aktiváció De: HF kötés miatt csak az opszono-fagocitózis fokozódik CRP receptor hatások FcγRI (ITIM) FcγRII (ITAM) In vivo hatások Akut fázis reakció Tartós akut fázis reakció

PCh-kötő oldal C1q-kötő oldal

natív CRP szubsztrát kötés 8M Urea+10mM EDTA Hő (95 o C, 10 perc) Savas kezelés (ph2) Polisztirén gyöngy Új antitestkötő hely (neo-epitóp) Nincs Van szubsztrátumot kötött CRP módosított CRP

Módosított lipoproteinek mint target antigének 1, Oxidált LDL (oxldl) Előszeretettel scavanger receptorokon keresztül kerül felvételre a makrofágokba kontroll és feed-back nélkül és bemutatásra kerülhet a T sejtek felé A plakkokból izolálható T sejtek felismerik mint antigént Ellene antitestek mutathatók ki érbetegek savójában, de állatmodellben ezek az antitestek védő hatásúak oxldl nincs a keringésben, csak a lézióban mutatható ki, feltehetően a makrofágok hatására keletkezik

Módosított lipoproteinek mint target antigének 2, Enzimatikusan módosított LDL (E-LDL) Az oxldl nem mutatható ki nagy mennyiségben a lézióból izolált lipid dús anyagban, csak a monociták bevándorlása után keletkezik jelentős mennyiség. Már a sejtek megjelenése előtt is kimutathatók azonban nagy, fuzionált lipid partikulumok, melyek oxldl-ből nem keletkeznek A lipid anyagból sikerült kivonni egy sok szabad koleszterint tartalmazó frakciót, mely kifejezetten erősen aktiválja a komplementkaszkád alternatív útját (LCA). Az oxldl-ben (és a natív LDL-ben is) szabad koleszterin csak nyomokban mutatható ki, leginkább az észterszármazékok vannak jelen.

Módosított lipoproteinek mint target antigének 2, E-LDL-folyt. Az E-LDL tripszin, koleszterin-észteráz és neuraminidáz kezeléssel hozható létre in vitro, in vivo keletkezése nem teljesen tisztázott Az E-LDL-t a makrofágok fel tudják venni a scavanger receptorokon keresztül Az enzimatikusan módosított LDL nem tartalmazza az oxidáció hatására keletkező epitópokat. Megjelennek azonban csak az E- LDL-re jellemző neo-epitópok. Az oxldl-nél erősebben aktiválja a komplementrendszert. Ebben a szabad koleszterin jelenlétének van kitüntetett szerepe. CRP-t köt

Early atherosclerotic lesion within an adaptive intimal thickening of a human coronary artery. The lumen is to the bottom. A, Simultaneous stain for C5b-9 neoantigen and E-LDL. Note the colocalization of the two antigens with the more extensive area taken up by E-LDL (red color) than by the terminal complement complex (brown color, arrowheads). The demarcation between intima and media is indicated by an arrow. B, Simultaneous stain with mab AIL-3 for E-LDL and with CD68 for macrophages. Note the predominant deposition of the lipoprotein (brown color, big arrowheads) in the subluminal regions below the layers of macrophage foam cells (red color, small arrowheads). Scale bars indicate 25 µm. Torzewski M et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1998 Mar;18(3):369-78.

Early atherosclerotic lesion (fatty streak with macrophages and macrophage foam cells visible throughout most of the intima) within an adaptive intimal thickening of a human coronary artery stained simultaneously for CRP (brown) and E-LDL (violet). The lumen is to the left. Note the close intermingling and overlapping of CRP and E-LDL deposits predominantly within the deeper parts of the intima. The demarcation between intima and media is indicated by an arrow. Bar=50 µm. Torzewski M et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1998 Mar;18(3):369-78.

Sequential sections of 2 early atherosclerotic lesions (A, B and C, D, respectively) within adaptive intimal thickenings of human coronary arteries. Lumen is to the upper right-hand corner. A and C, CRP stain, demonstrating deposition of CRP in the deeper part of the intima adjacent to the media (arrowheads). Note foam cells forming layers next to the luminal surface and also showing positive intracellular staining (especially in A). B and D, C5b-9 stain, also demonstrating deposition of granules in a deeper part of the intima adjacent to media (arrowheads). Demarcation between intima and media is indicated by an arrow. Bar=25 µm. Torzewski J, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998 Sep;18(9):1386-92

Base of early atherosclerotic lesion within adaptive intimal thickening of human coronary artery stained simultaneously for CRP (violet, small arrowheads) and C5b-9 neoantigens (brown, large arrowheads). Note granules of C5b-9 in close association with CRP within the intima (score=3). Demarcation between intima and media is indicated by an arrow. Bar=25 µm. Torzewski J, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998 Sep;18(9):1386-92

NEM MÓDOSÍTOTT VLDL, LDL, ÉS HDL ÁLTAL KIVÁLTOTT C1 AKTIVÁCIÓ CRP (100 µg/ml) JELENLÉTÉBEN VAGY HIÁNYÁBAN 50 C1 aktiváció (%) 40 30 20 10 0 lipoprotein nélkül nvldl nldl nhdl CRP nélkül CRP-vel Bíró A et al, Mol Immunol, 2007

A CRP HATÁSA AZ oxldl ÁLTAL KIVÁLTOTT C1 AKTIVÁCIÓRA 40 C1 aktiváció (%) 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 CRP (µg/ml)

AZ LDL KOLESZTERIN-ÉSZTERÁZZAL VALÓ EMÉSZTÉSE KRITIKUS LÉPÉS A C1 AKTIVÁLÓ SZÁRMAZÉK KIALAKÍTÁSÁBAN 60 50 40 30 20 10 kezeletlen plazmin proteináz K tripszin KÉáz plazmin+kéáz proteináz K+KÉáz tripszin+kéáz tri+kéáz+naáz 0 C1 aktiváció (%)

AZ E-LDL ÁLTAL KIVÁLTOTT DÓZISFÜGGŐ C1 AKTIVÁCIÓ C1 aktiváció (%) 75 50 25 LDL E-LDL 0 0 1 10 100 1000 lipoprotein koncentráció (nm)

Levonható következtetések Az LDL és az oxldl csak CRP jelenlétében aktiválja a komplementet, azonban igen gyengén (oxldl esetében 30%) Az E-LDL erős komplement aktivátor (70-80%), melyet a CRP nem befolyásol Az E-LDL kialakításában fehérje emésztésnek és koleszterin-észteráz kezelésnek van elsődleges szerepe

A CRP mint komplement regulátor A CRP monomer formája erősen köti az alternatív út regulátoros fehérjét, a H faktort FH: Kofaktor aktivitás (I faktor kötődést erősít) Decay accelerating factor aktivitás (C3bBb komplex féléletidejét csökkenti) Gátolja a C5 aktivációt, a C5b-9 komplex kialakulását és a lízist, vagyis csak az opszono-fagócitózist fokozza

A humán komplementrendszer Klasszikus út (immunkomplex, CRP, CMV, C1, C4, C2) Lektin út (szénhidrátok, MBL, ficolin, MASP, C2, C4) Alternatív út (idegen felszín, koleszterin, módosított lipidek E-LDL, B, D) C1-INH C4BP, I-faktor S fehérje, Clusterin C3 C5 C5b-9m (MAC) H-faktor, I-faktor Anafilatoxinok (C3a, C5a) Membránkárosító komplex (sc5b-9) CRI, DAF, MCP, CD59

Heparin kötés CRP kötés M-fehérje kötés Komplement faktor H C3b-kötés DAF aktivitás Kofaktor aktivitás C3b-kötés C3b-kötés Heparin kötés Heparin kötés Sziálsav kötés

A CRP diadalútja CRP mint kardiovaszkuláris marker ( okozat ) Egészséges populáció (primer prevenció) Érbeteg populáció (secunder prevenció) CRP mint rizikó faktor pathofiziológiai hatásai ( ok ) CRP szerepe kettős lehet: rizikó marker és rizikó faktor CRP mint terápiás target CRP szint követése terápia során CRP gátlószerek kifejlesztése

és hanyatlása Proapoptotic, antimigratory, antiproliferative, and antiangiogenic effects of commercial C-reactive protein on various human endothelial cell types in vitro: implications of contaminating presence of sodium azide in commercial preparation. Evidence for sodium azide as an artifact mediating the modulation of inducible nitric oxide synthase by C-reactive protein C-reactive protein does not relax vascular smooth muscle: effects mediated by sodium azide in commercially available preparations. C-reactive protein-induced in vitro vasorelaxation is an artefact caused by the presence of sodium azide in commercial preparations. C-reactive protein-induced in vitro endothelial cell activation is an artefact caused by azide and lipopolysaccharide. Proinflammatory changes in human umbilical cord vein endothelial cells can be induced neither by native nor by modified CRP.

Az atherosclerosis immunológiai eredete Klasszikus rizikófaktorok LDL Endothel diszfunkció-endothelsejt aktiváció Permeabilitás növekszik Adhéziós molekulák és a sejtfelszíni hsp60 expresziója nõ E-LDL Leukocyta immigráció + Y Y Y Anti-humán hsp60 antitestek Aktiválódó T-sejtek Komplementaktiváció + + Inflammatio, sejtkárosodás SMC aktiváció? CRP

A lehetséges, felismerésre kerülő megváltozott saját antigének A hősokkfehérjék (Wick et al., és saját munkánk) A lipoproteinek (oxldl, E-LDL, glikált-ldl) A béta-2 glikoprotein I Anionos felszínhez kötődő glikoprotein (pl. thrombocyta, heparin, DNS)

Antifoszfolipid antitestek Negatívan töltött foszfolipidekkel kofaktor nélkül reagáló antitestek, melyeket fertőző betegségek indukálnak (pl. anti-kardiolipin). Az autoimmun betegségekben másodlagos szerepet játszanak. Kofaktor dependens antitestek, melyek kötődéséhez szérum fehérjékre van szükség (béta-2 GPI vagy apoh). Főleg a thrombogén rizikó növekedését jelezik az ellene kimutatható antitestek, mivel funkciója szerint antikoaguláns.

A béta2-gpi kimutatható a plakkokban Szerepe lehet a foam-sejt keletkezésben

Módosított lipoproteinek és egyéb target antigének AGE glikált LDL, anti-ec antitestek, anti-prothrombin antitestek, anti-annexinv antitestek.

A gyulladásos és autoimmun mechanizmusok helye az atherosclerosis pathogeneziségeben Az atherosclerosist kísérő gyulladásos jelenségek fenntartásában módosított saját struktúrák (LDL, HSP) jelentős szerepet játszhatnak A folyamatok lényegi része a szövetek között zajlik, a betegség helyszíne a plakk. A károsodott saját struktúrák hozzájárulnak a gyulladás fenntartásához, ezért a kellően szenzitív gyulladásos markerek (pl. CRP) a károsodás összességét képes jelezni A natív CRP és a natív LDL szerepe a plazmában inkább csak marker, az oki folyamatokkal csak áttételes kapcsolatban vannak Ha van a CRP-nek és az LDL-nek mediátor szerepe, az a szöveti (?) módosított formákhoz köthető

Terápiás ajánlások megfogalmazása a fentiek tükrében A CRP szerepe legfeljebb rizikó marker lehet mai ismereteink szerint Szintjének változása követi a kóros folyamatok változását Gátlásának, csökkentésének direkt hatása nem bizonyított A CRP mint emerging risk factor bekerült a hazai rizikóbesorolási ajánlásba (nemzetközi ajánlások figyelembe vételével), vizsgálata a közepes rizikójú betegek besorolásánál játszhat szerepet II. Magyar Terápiás Konszenzus Konferencia (2005. nov. 3.) ajánlása, Metabolizmus, 2006 január

I/3 Kardiovaszkuláris tünetektől mentes, nagy kockázatú állapot A. Legalább egy súlyos kockázati tényező esetén: - összkoleszterin >8,0 mmol/l - vérnyomásérték >180/110 Hgmm - testtömegindex (BMI) >40 kg/m2 - boka/kar index <=0,9 - GFR (glomerulus filtr.ráta) <60 ml/min - mikroalbuminuria 30-300 mg/l illetve - preklinikus ateroszklerózis (igazolt plakk), B. Legalább kettő az alábbiakból: - Lp/a >=30 mg/dl -CRP >=3 mg/l - homocisztein >=12 mikromol/l - familiaritás, illetve atherogen génkonstelláció (4/10) Emerging risk factors C. Legalább egy nagy kockázatot mutató score esetén: - 10 éves halálozási kockázat >=5% (SCORE táblázat), vagy - 10 éves ISZB megbetegedési kockázat >20% (Framingham ponttáblázat) *Megjegyzés:,,IGEN NAGY kockázatot jelent opcionálisan - terápiás opcióként sz.e. más célértékkel - a következő Kardiovaszkuláris betegség + legalább egynek a jelenléte az alábbiakból: 1. Diabetes mellitus 2. Dohányzás 3. Metabolikus szindróma 4. Akut koronária szindróma Pados Gy, Metabolizmus, 2006 A21-24

Atherosclerosis Inflammatory and sclerosing arterial disease (ISAD) Páramo, Beloqui, Diez: Circulation, 2000